夏 冰 劉 軍 潘燦盛 溫才潔 蔡群娣 張 飛
(廣東省科學(xué)院測(cè)試分析研究所(中國(guó)廣州分析測(cè)試中心)廣東省化學(xué)測(cè)量與應(yīng)急檢測(cè)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東 廣州 510070)
魚(yú)粉是常見(jiàn)的優(yōu)質(zhì)動(dòng)物蛋白原料,廣泛在家畜飼料和水產(chǎn)餌料應(yīng)用[1]。魚(yú)粉由一種或多種魚(yú)類通過(guò)一系列操作加工而成?;铘~(yú)死后,魚(yú)體內(nèi)蛋白酶催化蛋白質(zhì)水解成小肽物質(zhì)和氨基酸,氨基酸脫羧酶又進(jìn)一步催化氨基酸水解成生物胺[2],魚(yú)體越腐敗,生物胺含量就越高。若使用腐敗變質(zhì)的魚(yú)肉制品或魚(yú)粉保存不當(dāng)均會(huì)導(dǎo)致魚(yú)粉中生物胺含量升高[3-4],因此,魚(yú)粉中生物胺的含量是評(píng)價(jià)魚(yú)粉質(zhì)量的一個(gè)重要指標(biāo)[5]。色胺屬于一種生物胺,是由色氨酸脫羧形成的胺,具有潛在毒性,含量過(guò)高可能會(huì)引起變態(tài)反應(yīng)等不良后果[6]。
在日常檢測(cè)中,魚(yú)粉中色胺的檢出率較高,部分樣品中色胺的含量接近方法定量限,此時(shí)需要對(duì)影響色胺測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確性的因素進(jìn)行不確定度評(píng)定。不確定度評(píng)定可以提高色胺測(cè)量結(jié)果的準(zhǔn)確度、有效性和科學(xué)性;提供測(cè)量結(jié)果的分散性[7],對(duì)色胺質(zhì)量控制具有重要意義[8]。目前,關(guān)于魚(yú)粉中色胺的不確定度評(píng)定未見(jiàn)報(bào)道。本研究依據(jù)《化學(xué)分析中不確定度的評(píng)估指南》(CNAS—GL06)[9]和《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》(JJF 1059.1—2012)[10]中規(guī)定的方法和程序,參照《動(dòng)物源性飼料中生物胺的測(cè)定》(GB/T 23884—2021)[11],采用高效液相色譜法對(duì)魚(yú)粉中色胺的含量進(jìn)行測(cè)定,并建立數(shù)學(xué)模型,量化檢測(cè)過(guò)程中各不確定度分量,得到合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度及擴(kuò)展不確定度,并分析影響不確定度的關(guān)鍵來(lái)源,找出影響檢測(cè)不確定度的主要因素,為進(jìn)一步提高魚(yú)粉中色胺含量檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度提供參考。
Agilent 1260高效液相色譜儀配紫外檢測(cè)器購(gòu)自美國(guó)Agilent 公司,Multi reax 多位試管渦旋振蕩器購(gòu)自heidolph 公司,BT125D 電子天平購(gòu)自賽多利斯科技有限公司,PIFE 防腐型24 位氮吹儀購(gòu)自ANPEL 公司,F(xiàn)E15067超聲波機(jī)購(gòu)自Fisherbrand公司。
色胺(98.3%)購(gòu)自Chromadex 公司,乙腈(色譜純)購(gòu)自MERK,丹酰氯(分析純)購(gòu)自Sigma,高氯酸、氨水、碳酸氫鈉、丙酮、氫氧化鈉(分析純)購(gòu)自廣州化學(xué)試劑廠,魚(yú)粉購(gòu)自市場(chǎng)。
丹磺酰氯溶液(10 g/L):稱取0.5 g 丹磺酰氯于50.00 mL容量瓶,使用丙酮溶解并定容。
按照《動(dòng)物源性飼料中生物胺的測(cè)定》(GB/T 23884—2021)的要求測(cè)定魚(yú)粉中色胺的含量[11]。
1.2.1 樣品制備
稱取1.0 g 于50 mL 離心管中,加入10 mL 0.4 mol/L高氯酸溶液,渦旋混勻,振搖提取10 min,4 000 r/min離心10 min,移出上清液,重復(fù)提取殘?jiān)淮?,合并兩次上清液;移? mL 上清液于10 mL 比色管中,依次加入2 mol/L 氫氧化鈉溶液200 μL,飽和碳酸氫鈉溶液300 μL和10 g/L丹磺酰氯溶液2 mL,渦旋混勻,45 ℃避光反應(yīng)45 min,加入氨水100 μL 終止反應(yīng),靜置15 min。45 ℃下用氮?dú)獯党译娑ㄈ葜? mL,過(guò)濾上機(jī)[11]。
1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制
準(zhǔn)確稱取5.54 mg 標(biāo)準(zhǔn)品于50 mL 容量瓶,使用0.1 mol/L鹽酸溶液定容,得到108.9 mg/L溶液,逐級(jí)稀釋為54.500、27.200、10.900、5.450、0.545、0.109、0 mg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液。
1.2.3 色譜條件
色譜柱:Ultimate?XB-C18柱(4.6 μm×250 mm,5 μm);流動(dòng)相A:乙酸銨溶液(5 mmol/L),流動(dòng)相B:乙腈,梯度洗脫:0~5 min,60% B;5~12 min,60% B~75% B;12~20 min,75% B~95% B;20~21 min,95%B~60% B;21~25 min,60% B;流速:1.0 mL/min;柱溫:30℃;檢測(cè)波長(zhǎng):254 nm;進(jìn)樣量:10 μL。
1.3.1 數(shù)學(xué)模型
式中:X為試供試液中色胺的含量(mg/kg);c為由標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的供試液質(zhì)量濃度(mg/L);V為樣品定容體積(mL);m為樣品質(zhì)量(g)。
1.3.2 不確定度來(lái)源分析
對(duì)試驗(yàn)過(guò)程和數(shù)學(xué)模型進(jìn)行分析,魚(yú)粉中色胺測(cè)定結(jié)果的不確定度來(lái)源見(jiàn)圖1。
圖1 魚(yú)粉中色胺不確定度來(lái)源
2.1.1 對(duì)照品純度Urel(P)
色胺對(duì)照品純度為98.3%,未標(biāo)識(shí)不確定度。按矩形分布,對(duì)照品純度引入相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:。
2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)品稱量Urel(mstd)
對(duì)照品稱樣量為5.54 mg,精確至0.01 mg,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)《電子天平》(JJG 1036—2008)[12]平行測(cè)定6 次;稱量時(shí)操作兩次,計(jì)2 次不確定度,對(duì)照品稱樣量的不確定度見(jiàn)表1。
表1 對(duì)照品稱樣量的不確定度
2.1.3 系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制Urel(Cstd)
使用容量瓶配制108.900、54.500、27.200、10.900、5.450、0.545、0.109、0 mg/L 標(biāo)準(zhǔn)溶液,1.00、5.00 mL分度吸量管,20、200 μL 移液器,標(biāo)準(zhǔn)工作曲線配制方法見(jiàn)表2。根據(jù)《常用玻璃量器檢定規(guī)程》(JJG 196—2006)[13]規(guī)定,在(20±5)℃進(jìn)行操作,水膨脹系數(shù)2.08×10-4(1/℃),溫差引起的體積分散區(qū)間半寬度。
表2 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線配制方法
50 mL 容量瓶:ΔV=50 mL×2.08×10-4℃-1×5 ℃=0.052 mL。
10 mL 容量瓶:ΔV=10 mL×2.08×10-4℃-1×5 ℃=0.010 mL。
取矩形分布,標(biāo)液移取和定容引起的不確定度見(jiàn)表3。由此可知,標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制引入的相對(duì)不確定度為:。
表3 標(biāo)液移取和定容引起的不確定度
2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線引入的不確定度Urel(Cal)
使用最小二乘法對(duì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行擬合,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表4。
表4 標(biāo)液濃度及相應(yīng)的峰面積和標(biāo)準(zhǔn)曲線
樣品做兩次平行測(cè)定,采用線性回歸方程計(jì)算得出樣品的平均質(zhì)量濃度為0.092 0 mg/L。由標(biāo)準(zhǔn)曲線引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:。其中;=(0+0.109+0.545+5.45+10.9+27.2+54.5+108.9)/8=26.0 mg/L。
式中:SR為標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積殘差的標(biāo)準(zhǔn)偏差;aˉ為回歸方程斜率平均值,本試驗(yàn)aˉ=19.908;b為-99.11;cˉ為標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的平均質(zhì)量濃度;P為樣品的平行測(cè)定次數(shù),P=2;n為標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)定次數(shù),n=6;j為校正曲線級(jí)別。
c的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:,。
樣品做2次平行測(cè)定,使用10 mL單標(biāo)線吸量管進(jìn)行定容,根據(jù)JJG 196—2006[13]規(guī)定,樣品定容引入的不確定度見(jiàn)表5。
表5 樣品定容引入的不確定度
樣品稱樣量為1.0 g,引入的不確定度見(jiàn)表6。
表6 樣品稱量引入的不確定度
重復(fù)稱取樣品6次進(jìn)行測(cè)定,測(cè)得含量分別為10.50、10.20、9.97、10.50、10.50 和10.40 mg/kg,平均值為10.3 mg/kg。
單次測(cè)量的標(biāo)準(zhǔn)不確定度使用貝塞爾公式計(jì)算[14]:。
在實(shí)際檢測(cè)時(shí)通常做平行雙樣,平均值的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為(n=2):。
在加標(biāo)量為10 mg/kg 時(shí),求得加標(biāo)回收率為分別為102.1%、100.0%、101.2%、102.5%、102.1%、102.7%,平均值101.8%,回收率的標(biāo)準(zhǔn)不確定度URec為:。
則回收率Rec的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:。
2.6.1 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度
因各分量相互獨(dú)立不相關(guān),因此樣品中色胺測(cè)定結(jié)果的合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:
則合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:U(ω)=0.033×10.3 mg/kg ≈0.34 mg/kg。
2.6.2 相對(duì)擴(kuò)展不確定度
取包含因子k=2,則相對(duì)擴(kuò)展不確定度為:Urel=2×3.3%=6.6%。
2.6.3 擴(kuò)展不確定度
U=2×0.34=0.68mg/kg。
樣品中魚(yú)粉色胺含量為:10.3 mg/kg。樣品中魚(yú)粉色胺含量結(jié)果表示為:(10.30±0.68) mg/kg,k=2[10]。
本研究對(duì)高效液相色譜法測(cè)定魚(yú)粉中色胺含量的不確定度進(jìn)行評(píng)定,量化各相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量,見(jiàn)表7。由表7 可知,影響魚(yú)粉中色胺測(cè)量不確定度的因素有測(cè)定液中色胺的濃度(標(biāo)準(zhǔn)曲線線性擬合和標(biāo)準(zhǔn)溶液配制)、定容體積、樣品稱量、樣品重復(fù)性和樣品前處理的回收率,其中測(cè)定液中色胺的濃度是主要因素,而樣品稱量過(guò)程引入的不確定度最小[14-15]。
表7 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度
本研究通過(guò)量化色胺檢測(cè)結(jié)果中各不確定度分量,得到了影響結(jié)果不確定度的主次因素,為采取針對(duì)性的措施提供了參考,可以選購(gòu)權(quán)威機(jī)構(gòu)提供的有效期內(nèi)、不確定度較小的有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),并且定期對(duì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行期間核查;嚴(yán)格按照操作規(guī)范配制標(biāo)準(zhǔn)溶液,包括使用計(jì)量檢定合格的移液器、移液管和容量瓶,定期對(duì)器皿進(jìn)行校準(zhǔn)和核查;選擇適當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)系列濃度點(diǎn)和測(cè)定次數(shù);注意色譜峰面積積分細(xì)節(jié)的處理以減小最小二乘法線性擬合曲線的影響,使標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)≥0.999;設(shè)計(jì)合適的標(biāo)準(zhǔn)曲線,使供試液濃度位于標(biāo)準(zhǔn)曲線的中間;定期對(duì)儀器進(jìn)行檢定和核查,確保儀器處于最佳工作狀態(tài);定期開(kāi)展人員比對(duì),提高檢測(cè)人員熟練水平;確保樣品均勻性,盡量降低相關(guān)不確定度。