富鐵產(chǎn)朊假絲酵母對斷奶仔豬生長性能、血液指標(biāo)和腸道形態(tài)的影響

曾 艷 孫翔宇 肖 蕾 汪 彬

（湖南省微生物研究院，湖南 長沙 410009）

鐵是動物必需的微量元素，能夠以輔酶的形式參與機(jī)體代謝，在DNA合成、免疫調(diào)節(jié)和腸道健康等方面發(fā)揮重要作用[1]。在現(xiàn)代規(guī)模養(yǎng)殖中，斷奶仔豬主要從飼糧中獲取鐵元素，非血紅素鐵在動物腸道的吸收率僅為1%～20%，鐵供應(yīng)不足常誘發(fā)貧血、腹瀉、精神萎靡和生長緩慢等問題[2-3]。但過量添加鐵制劑會增加動物消化系統(tǒng)負(fù)擔(dān)，造成大量未吸收的鐵制劑排出體外，增加成本，污染環(huán)境[4]。因此，需要尋找具有更高生物利用率的新型鐵制劑。研究發(fā)現(xiàn)，與化學(xué)合成相比，以微生物為載體的微量元素制劑具有更高的生物活性，利于機(jī)體吸收，并且成本低廉、工藝簡單、穩(wěn)定性好[5-6]。酵母菌蛋白質(zhì)和多糖含量豐富，能夠富集多種鐵、硒、鋅等元素，是理想的微生物載體，但國內(nèi)外鮮有文獻(xiàn)報道富鐵酵母制劑對斷奶仔豬的相關(guān)影響[7-8]。因此，本試驗(yàn)旨在研究富鐵產(chǎn)朊假絲酵母對斷奶仔豬生長性能、鐵代謝、抗氧化和免疫功能的影響，為其在斷奶仔豬生產(chǎn)中的進(jìn)一步研究與應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用富鐵產(chǎn)朊假絲酵母（Candidautilis）由本實(shí)驗(yàn)室從土壤中篩選分離所得，每克富鐵產(chǎn)朊假絲酵母凍干粉含2.15 mg的Fe2+。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計

選用90 頭（7.86±0.54）kg、體況相近的健康28 日齡“杜×長×大”斷奶仔豬，隨機(jī)分為2組，每組9個重復(fù)，每個重復(fù)5 頭豬。對照組（CON 組）仔豬飼喂基礎(chǔ)日糧+硫酸亞鐵（含鐵104 mg/kg），試驗(yàn)組（CU 組）仔豬飼喂基礎(chǔ)日糧+富鐵產(chǎn)朊假絲酵母（含鐵104 mg/kg）?；A(chǔ)日糧參照NRC（2012）配制，基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)）

1.3 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)于湖南省綏寧縣華隆生態(tài)種養(yǎng)殖專業(yè)合作社豬場進(jìn)行，每個重復(fù)為一欄飼養(yǎng)。試驗(yàn)開始前對仔豬舍進(jìn)行清洗、消毒。試驗(yàn)期全程仔豬自由采食和自由飲水，其他程序參照豬場管理進(jìn)行。試驗(yàn)期28 d。

1.4 測定指標(biāo)及方法

1.4.1 樣品采集

試驗(yàn)結(jié)束后，每個重復(fù)挑選一頭空腹體重接近平均體重的健康仔豬前腔靜脈采血，屠宰采樣。血液分別收集于5 mL肝素鈉抗凝采血管和普通采血管?？鼓裳苡? ℃保存，采樣結(jié)束進(jìn)行血常規(guī)檢測。普通采血管室溫靜置20 min，3 500 r/min離心10 min，收集血清，于-80 ℃保存，用于檢測血清指標(biāo)。取十二指腸中段、空腸前段和回腸后段各2 cm 于4%多聚甲醛溶液中固定，用于腸道形態(tài)學(xué)檢測。

1.4.2 生長性能

試驗(yàn)結(jié)束，仔豬進(jìn)行空腹稱重，記錄每日給料量和余料量，用于計算平均日增重（ADG）、平均日采食量（ADFI）及料重比（F/G）。記錄每日各欄仔豬腹瀉頭數(shù)，計算平均腹瀉率。

平均日增重=(末重-初重)/試驗(yàn)天數(shù)(1)

平均日采食量=總采食量/試驗(yàn)天數(shù)(2)

料重比=平均日采食量/平均日增重(3)

腹瀉率=總腹瀉數(shù)/(每欄仔豬數(shù)×試驗(yàn)天數(shù))(4)

1.4.3 血常規(guī)指標(biāo)

采用BC-5000VET 全自動血液分析儀（深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司）測定仔豬血液中白細(xì)胞總數(shù)（WBC）、中性粒細(xì)胞百分比（Neu）、淋巴細(xì)胞百分比（Lym）、單核細(xì)胞百分比（Mon）、嗜酸性粒細(xì)胞百分含量（Eos）、嗜堿性粒細(xì)胞百分含量（Bas）、紅細(xì)胞總數(shù)（RBC）、血紅蛋白（HGB）、血細(xì)胞比容（HCT）、平均紅細(xì)胞體積（MCV）、平均血紅蛋白量（MCH）、平均血紅蛋白濃度（MCHC）、血小板總數(shù)（PLT）、平均血小板體積（MPV）、血小板分布寬度（PDW）和血小板壓積（PCT）。

1.4.4 血清抗氧化指標(biāo)

采用試劑盒（南京建成生物工程研究所）測定仔豬血清過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）、總超氧化物歧化酶（T-SOD）、 谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）及丙二醛（MDA），采用ELISA 試劑盒（江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司）測定仔豬血清細(xì)胞色素C 氧化酶（COX），具體操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4.5 血清鐵代謝相關(guān)指標(biāo)

采用試劑盒（南京建成生物工程研究所）檢測仔豬血清中鐵（Fe）含量、銅藍(lán)蛋白（CP）活性及總鐵結(jié)合力（TIBC），嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作。

1.4.6 血清免疫指標(biāo)

采用ELISA 法測定仔豬血清免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白M（IgM）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素-4（IL-4）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、白細(xì)胞介素-10（IL-10）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）含量，試劑盒購自江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司，所有操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4.7 腸道形態(tài)

參照王磊[9]的方法將固定于4%多聚甲醛溶液中的腸道樣品依次進(jìn)行乙醇脫水，石蠟包埋，切片，蘇木精-伊紅（HE）染色等，使用光學(xué)顯微鏡對腸道組織觀察拍照，測量腸道絨毛高度（VH）和隱窩深度（CD），計算絨毛高度與隱窩深度的比值（V/C）。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 23.0 軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P＜0.05 表示數(shù)據(jù)差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 富鐵產(chǎn)朊假絲酵母對斷奶仔豬生長性能的影響（見表2）

表2 富鐵產(chǎn)朊假絲酵母對斷奶仔豬生長性能的影響

由表2可知，與CON組相比，富鐵產(chǎn)朊假絲酵母可在一定程度上改善仔豬平均日增重、平均日采食量、料重比、腹瀉率（P＞0.05）。

2.2 富鐵產(chǎn)朊假絲酵母對斷奶仔豬血常規(guī)的影響（見表3）

表3 富鐵產(chǎn)朊假絲酵母對斷奶仔豬血常規(guī)的影響

由表3可知，與CON組相比，CU組仔豬血液WBC、Bas 含量顯著提高（P＜0.05），富鐵產(chǎn)朊假絲酵母替代飼糧無機(jī)鐵對仔豬血液Neu、Lym、Mon、Eos、RBC、HGB、HCT、MCV、MCH、MCHC、PLT、MPV、PDW和PCT無顯著影響（P＞0.05）。

2.3 富鐵產(chǎn)朊假絲酵母對斷奶仔豬血清抗氧化指標(biāo)的影響（見表4）

表4 富鐵產(chǎn)朊假絲酵母對斷奶仔豬血清抗氧化指標(biāo)的影響

由表4 可知，與CON 組相比，CU 組仔豬血清CAT、COX、T-SOD、GSH-Px活性顯著提高（P＜0.05），MDA含量顯著降低（P＜0.05）。

2.4 富鐵產(chǎn)朊假絲酵母對斷奶仔豬血清鐵代謝相關(guān)指標(biāo)的影響（見表5）

表5 富鐵產(chǎn)朊假絲酵母對斷奶仔豬血清鐵代謝相關(guān)指標(biāo)的影響

由表5可知，與對照組相比，CU組仔豬血清Fe水平顯著提高（P＜0.05）， CP 活性和TIBC 顯著降低（P＜0.05）。

2.5 富鐵產(chǎn)朊假絲酵母對斷奶仔豬血清免疫球蛋白的影響（見表6）

表6 富鐵產(chǎn)朊假絲酵母對斷奶仔豬血清免疫球蛋白的影響

由表6可知，與CON組相比，CU組仔豬血清IgA和IgG含量顯著提高（P＜0.05）。

2.6 富鐵產(chǎn)朊假絲酵母對斷奶仔豬血清炎癥因子的影響（見表7）

表7 富鐵產(chǎn)朊假絲酵母對斷奶仔豬血清炎癥因子的影響 單位：ng/L

由表7可知，與CON組相比，CU組仔豬血清TNF-α含量顯著降低（P＜0.05），富鐵產(chǎn)朊假絲酵母對IL-1β、IL-4、IL-6和IL-10具有一定改善作用（P＞0.05）。

2.7 富鐵產(chǎn)朊假絲酵母對斷奶仔豬腸道形態(tài)的影響（見表8、圖1）

圖1 富鐵產(chǎn)朊假絲酵母對斷奶仔豬腸道形態(tài)的影響

表8 富鐵產(chǎn)朊假絲酵母對斷奶仔豬腸道形態(tài)的影響

由表8可知，與CON組相比，CU組仔豬腸道十二指腸和空腸的VH 和V/C 顯著提高（P＜0.05），十二指腸、空腸和回腸的CD 顯著降低（P＜0.05），但對回腸VH 和V/C影響不顯著（P＞0.05）。

由圖1 可知，富鐵產(chǎn)朊假絲酵母可以提高斷奶仔豬的腸道絨毛高度，降低隱窩深度。

3 討論

鐵是仔豬必需的微量礦物元素，缺鐵會導(dǎo)致仔豬貧血、腹瀉、精神萎靡和生長遲緩，甚至死亡。飼用補(bǔ)鐵劑從第一代無機(jī)鹽到第二代有機(jī)鹽，到第三代氨基酸螯合鐵，生物學(xué)效價和穩(wěn)定性均具有了明顯的突破，但生產(chǎn)成本、生產(chǎn)工藝及對生產(chǎn)設(shè)備的要求也隨之變高。而以酵母菌為代表的微生物載體，在轉(zhuǎn)化和富集有機(jī)鐵過程中，對生產(chǎn)工藝、生產(chǎn)設(shè)備和生產(chǎn)成本的要求更低，而且在動物腸道能夠發(fā)揮微生物的益生作用，是一種安全、經(jīng)濟(jì)、綠色的飼用鐵制劑。

3.1 富鐵產(chǎn)朊假絲酵母對斷奶仔豬生長性能的影響

斷奶仔豬生產(chǎn)性能直接與養(yǎng)殖效益相關(guān)，是養(yǎng)殖水平的重要考量指標(biāo)。本試驗(yàn)中，使用富鐵產(chǎn)朊假絲酵母完全替代仔豬日糧中的無機(jī)鐵對仔豬生產(chǎn)性能具有一定的改善作用，這可能與鐵供應(yīng)量充足和產(chǎn)朊假絲酵母的益生作用有關(guān)。李偉[10]給斷奶仔豬補(bǔ)充不同水平的無機(jī)鐵和有機(jī)鐵，發(fā)現(xiàn)仔豬生長性能與鐵添加水平呈現(xiàn)正向劑量趨勢。李晨陽[11]研究發(fā)現(xiàn)，在生長育肥豬日糧中鐵水平與育肥豬生長性能間存在顯著的正相關(guān)關(guān)系。但廖志超等[12]發(fā)現(xiàn)，使用甘氨酸亞鐵完全替代飼糧無機(jī)鐵對斷奶仔豬生產(chǎn)性能的影響不顯著，與本研究結(jié)果類似。富鐵產(chǎn)朊假絲酵母，除含有高含量高吸收率的鐵元素外，還可提供相當(dāng)數(shù)量的蛋白、必需氨基酸及豐富的維生素、甘露寡糖及一些重要的營養(yǎng)輔助因子等[13]。Yang 等[14]為斷奶仔豬補(bǔ)充1.2×109CFU 的產(chǎn)朊假絲酵母，發(fā)現(xiàn)斷奶仔豬生長性能明顯提高，腹瀉率明顯降低。趙明遠(yuǎn)等[15]為育肥期新疆褐牛補(bǔ)充10 g/100 kg BW的產(chǎn)朊假絲酵母，發(fā)現(xiàn)褐牛的料重比明顯降低，粗飼料采食量和ADF、NDF、GE 的消化率明顯降低。因此，在未來的研究中，也應(yīng)考慮富鐵產(chǎn)朊假絲酵母對仔豬日糧養(yǎng)分表觀消化率的影響。

3.2 富鐵產(chǎn)朊假絲酵母對斷奶仔豬血常規(guī)指標(biāo)的影響

仔豬腸道對飼糧中鐵的吸收率不高，易發(fā)生缺鐵及其并發(fā)癥。本研究中，使用富鐵產(chǎn)朊假絲酵母完全替代飼糧無機(jī)鐵后，仔豬血液中紅細(xì)胞數(shù)量、血紅蛋白含量和紅細(xì)胞體積等相關(guān)指標(biāo)均有一定程度的提高。血清鐵含量顯著提高，表明富鐵產(chǎn)朊假絲酵母有利于仔豬鐵的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)。周文俊[16]給斷奶仔豬補(bǔ)充不同劑量的有機(jī)鐵制劑，發(fā)現(xiàn)仔豬血細(xì)胞比容和血紅蛋白含量隨劑量增加而提高。

3.3 富鐵產(chǎn)朊假絲酵母對斷奶仔豬血清鐵代謝相關(guān)指標(biāo)的影響

銅藍(lán)蛋白活性和總鐵結(jié)合能力是反映機(jī)體鐵代謝的重要指標(biāo)，當(dāng)動物缺鐵時，機(jī)體會提高銅藍(lán)蛋白活性和總鐵結(jié)合能力以滿足各器官的鐵需要[17]。本試驗(yàn)中，飼喂富鐵產(chǎn)朊假絲酵母的仔豬也表現(xiàn)出銅藍(lán)蛋白活性和總鐵結(jié)合能力顯著降低，進(jìn)一步印證了富鐵產(chǎn)朊假絲酵母有利于仔豬對鐵的吸收代謝。許禎瑩等[18]使用富鐵啤酒酵母替代斷奶仔豬日糧中的無機(jī)鐵，對臨界缺鐵仔豬進(jìn)行飼喂補(bǔ)鐵，發(fā)現(xiàn)富鐵啤酒酵母可以提高仔豬血液紅細(xì)胞數(shù)量、血紅蛋白含量和紅細(xì)胞體積分布寬度，提高血清鐵含量，降低銅藍(lán)蛋白活性和總鐵結(jié)合力，與本試驗(yàn)結(jié)果類似。此外，也有研究評估了飼糧鐵的消化率，臟器、肌肉的鐵沉積率以及鐵代謝相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)量[19-20]。

3.4 富鐵產(chǎn)朊假絲酵母對斷奶仔豬血清抗氧化指標(biāo)的影響

腸道中過量的鐵通常會通過芬頓和哈伯-韋斯反應(yīng)產(chǎn)生活性氧，因此會觸發(fā)氧化應(yīng)激，是口服補(bǔ)鐵劑應(yīng)用中問題之一[21]。姜懿宸[22]發(fā)現(xiàn)，高鐵攝入會顯著提高大鼠腸組織丙二醛含量，顯著降低總超氧化物歧化酶活性。在本研究中，富鐵產(chǎn)朊假絲酵母顯著提高仔豬血清CAT、COX、T-SOD、GSH-Px 活性，顯著降低血清MDA 水平，表明富鐵產(chǎn)朊假絲酵母可以增強(qiáng)仔豬的抗氧化能力，可能有利于鐵釋放、吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)性能。富鐵產(chǎn)朊假絲酵母的抗氧化特性可能與產(chǎn)朊假絲酵母有關(guān)，王瑤[23]給斷奶仔豬每天口服3次1.2×109CFU的產(chǎn)朊假絲酵母，28 d后發(fā)現(xiàn)其顯著提高仔豬的總超氧化物歧化酶和CAT活性，以及總抗氧化能力。

3.5 富鐵產(chǎn)朊假絲酵母對斷奶仔豬免疫功能的影響

免疫系統(tǒng)對預(yù)防病原菌感染至關(guān)重要，而缺鐵會損害機(jī)體免疫功能[24]。研究發(fā)現(xiàn)，在先天性免疫中，鐵調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化、中性粒細(xì)胞募集和NK細(xì)胞活性；在適應(yīng)性免疫中，鐵對Th1、Th2 和Th17 和CTL 的活化和分化以及B 細(xì)胞的抗體反應(yīng)均有影響[25]。本研究表明，富鐵產(chǎn)朊假絲酵母顯著提高仔豬血液WBC和Bas數(shù)量，顯著提高血清IgA 和IgG 含量，顯著降低TNF-α 含量，表明富鐵產(chǎn)朊假絲酵母可以改善斷奶仔豬的免疫功能。趙金香[26]通過體外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，酵母鐵可以提高T、B淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率和免疫器官指數(shù)，說明富鐵酵母可以改善免疫功能。王冬華[27]在雛雞中觀察到富硒產(chǎn)朊假絲酵母能夠提高血清免疫球蛋白含量，與本試驗(yàn)結(jié)果類似。此外，酵母中甘露寡糖、β-葡聚糖和有機(jī)酸等成分也是重要的免疫增強(qiáng)劑，能夠改善動物的免疫狀態(tài)[28-29]。

3.6 富鐵產(chǎn)朊假絲酵母對斷奶仔豬腸道形態(tài)的影響

腸道是重要的消化和免疫器官，腸道結(jié)構(gòu)完整性是動物生長發(fā)育的基礎(chǔ)，斷奶仔豬由于食物狀態(tài)等的變化，導(dǎo)致腸道結(jié)構(gòu)損傷[30]。有研究發(fā)現(xiàn)，鐵可以通過調(diào)節(jié)干細(xì)胞活性和細(xì)胞增殖影響仔豬的腸道發(fā)育，缺鐵會導(dǎo)致腸道受損，降低腸道絨毛高度，增加隱窩深度[31-32]。本研究中，富鐵產(chǎn)朊假絲酵母顯著提高十二指腸和空腸前段組織的VH 和V/C，顯著降低CD，表明富鐵產(chǎn)朊假絲酵母可以改善斷奶仔豬腸道形態(tài)。原因可能是微生物載體減弱了無機(jī)鐵元素對仔豬腸胃刺激，更利于鐵的吸收，還有可能是產(chǎn)朊假絲酵母的益生作用[13]。董正林[17]給哺乳仔豬補(bǔ)鐵發(fā)現(xiàn)可以顯著提高仔豬十二指腸VH 和V/C，增加結(jié)腸杯狀細(xì)胞數(shù)量和Muc2mRNA表達(dá)。王瑤[23]給斷奶仔豬灌服產(chǎn)朊假絲酵母也觀察到仔豬回腸VH和V/C的顯著提高，CD顯著降低。

4 結(jié)論

在本試驗(yàn)條件下，使用富鐵產(chǎn)朊假絲酵母完全替代斷奶仔豬日糧中的無機(jī)鐵，可以改善仔豬生長性能，提高仔豬機(jī)體的鐵代謝、抗氧化和免疫能力，維護(hù)腸道形態(tài)。