不同培養(yǎng)條件對薏苡黑穗病菌菌絲生長的影響※

●楊江敏 練啟仙 岑怡紅 楊光粉 李冰冰

（1.興義民族師范學院 貴州 興義 562400；2.貴州大學 貴州 貴陽 550025）

薏苡（Coix lacryma-jobi L.）是禾本科（Gramineae）薏苡屬（Coix）1年生草本植物，其作為一種藥食兼用作物具有豐富的營養(yǎng)價值和藥用價值[1-3]。中國薏苡資源十分豐富，貴州省薏苡種植面積為3.2×104hm2[4]。

薏苡在種植過程中易感染黑穗病，對其產(chǎn)量和品質(zhì)造成嚴重影響[5]。薏苡黑穗病是由薏苡黑粉菌（Ustilago coicis Brefeld）引起的真菌病害，病原菌隸屬擔子菌亞門（Basidiomycotina）黑粉菌目（Ustilaginales）黑粉菌科（Ustilaginaceae）黑粉菌屬（Ustilago）[6]。黑穗病或黑粉病多發(fā)生于禾本科作物，不同的作物往往由不同菌種引起[7]，如小麥散黑穗病菌[Ustilago tricici（Pers.）Jens][8]、甘蔗黑穗病菌（Ustilago scitamineaSyd.）[9]、玉米瘤黑粉病菌[Ustilago zzeae（Beckm.）Unger][10]等。目前，針對薏苡黑穗病病原菌的研究多集中在形態(tài)學特征方面，關(guān)于其生物學特性方面的研究較少。本試驗探究不同溫度、培養(yǎng)基、pH、碳氮源等培養(yǎng)條件對薏苡黑穗病病原菌菌絲生長的影響，旨在進一步明確薏苡黑穗病菌的生物學特性，為病害的防控和后續(xù)研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣品采集薏苡黑穗病菌標本于2018年7～8月采集于貴州省興義市萬峰林薏苡種植基地。

1.1.2 供試培養(yǎng)基馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）、馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基（PSA）、查氏（Czapek）培養(yǎng)基、燕麥片瓊脂培養(yǎng)基（OA）、玉米粉瓊脂培養(yǎng)基（CMA）、薏苡組織汁培養(yǎng)基，均為自配，成分及配制方法參照《植病研究方法》[11]。所有培養(yǎng)基使用立式壓力蒸汽滅菌鍋（YXQ-SL-100G）經(jīng)121℃滅菌25 min，倒入培養(yǎng)皿中備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 不同溫度篩選試驗使用滅菌接種針挑取適量薏苡黑穗病菌接種于PDA培養(yǎng)基平板中央，分別置于5℃，10℃，15℃，20℃，25℃，30℃，35℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每個處理3次重復，28 d后觀察菌落生長情況，用十字交叉法測量菌落直徑。

1.2.2 不同培養(yǎng)基對薏苡黑穗病菌菌絲生長的影響用接種針挑取適量薏苡黑穗病菌接種于PSA、CMA、OA、薏苡組織汁培養(yǎng)基以及PDA平板上，于自然條件下培養(yǎng)。

1.2.3 不同碳源培養(yǎng)基的配制參照《植病研究方法》[11]，以Czapek培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別用等量的甘露醇、麥芽糖、肌醇、葡萄糖、乳糖、可溶性淀粉、果糖替代培養(yǎng)基中的蔗糖，制備不同碳源的培養(yǎng)基，對薏苡黑穗病菌菌絲進行培養(yǎng)。

1.2.4 不同氮源培養(yǎng)基的配制參照《植病研究方法》[11]，以Czapek培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別用等量的苯丙氨酸、精氨酸、硝酸鈣、蛋白胨、硫酸銨替代培養(yǎng)基中的硝酸鈉，制備不同氮源的培養(yǎng)基對薏苡黑穗病菌菌絲進行培養(yǎng)。

1.2.5 不同pH培養(yǎng)基的配制以PDA為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，使用1%HCl和0.5%NaOH溶液調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH為7個不同梯度（5、6、7、8、9、10和11），探究不同pH對薏苡黑穗病菌菌絲生長的影響。

1.2.6 不同碳氮比培養(yǎng)基的配制以Czapek培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，改變碳源（蔗糖）和氮源（硝酸鈉）的比例，分別配制不同碳氮比（0∶100、10∶90、20∶80、30∶70、40∶60、50∶50、60∶40、70∶30、80∶20、90∶10、100∶0）的培養(yǎng)基，用接種針挑取適量薏苡黑穗病菌接種其上進行培養(yǎng)。

1.3 數(shù)據(jù)處理及分析

采用DPS1.1進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，應用Duncan新復極差法進行差異顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 薏苡黑穗病菌在不同培養(yǎng)基上的培養(yǎng)性狀

薏苡黑穗病菌在PDA、PSA和OA培養(yǎng)基上的培養(yǎng)性狀存在差異（圖1）。在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)28 d后的菌落形態(tài)表現(xiàn)為米黃色，中間菌絲呈褶皺狀凸起；在PSA培養(yǎng)基上菌落為白色；在OA培養(yǎng)基上為米白色。

圖1 薏苡黑穗病菌在不同培養(yǎng)基上的培養(yǎng)性狀

2.2 不同溫度對薏苡黑穗病菌菌絲生長的影響

由表1可知，薏苡黑穗病菌菌絲在5℃和10℃下未生長，在15～35℃范圍內(nèi)均能生長。最適宜該病原菌菌絲生長的溫度是25℃，此時菌落平均直徑為2.97 cm，菌絲長勢最緊密，菌落呈淡黃色，與其余溫度處理存在顯著差異（P＜0.05）。20℃和30℃時菌絲生長形態(tài)差異不顯著（P＞0.05），低溫和高溫條件對菌絲生長存在明顯的抑制作用。

表1 不同溫度下薏苡黑穗病菌菌絲生長形態(tài)

2.3 不同培養(yǎng)基對薏苡黑穗病菌菌絲生長的影響

由表2可知，薏苡黑穗病菌菌絲在PDA上生長最好，菌絲緊密，其次是PSA培養(yǎng)基，菌落平均直徑分別為3.18 cm和3.15 cm，兩者間無顯著差異。病原菌在OA培養(yǎng)基上生長最慢，與其余4種培養(yǎng)基差異顯著，但其菌絲較CMA培養(yǎng)基緊密。

表2 不同培養(yǎng)基薏苡黑穗病菌菌絲生長形態(tài)

2.4 不同碳源對薏苡黑穗病菌菌絲生長的影響

由表3可知，供試的8種碳源中，薏苡黑穗病菌對蔗糖的利用最好，菌落白色，中央菌絲緊密邊緣稀疏，菌落平均直徑為3.32 cm，其次是葡萄糖，與乳糖、麥芽糖和甘露醇差異顯著（P＜0.05）。

表3 不同碳源薏苡黑穗病菌菌絲生長形態(tài)

2.5 不同氮源對薏苡黑穗病菌菌絲生長的影響

由表4可知，培養(yǎng)28 d后薏苡黑穗病菌菌絲在6種氮源培養(yǎng)基上生長的平均直徑大小依次為：硝酸鈣＞蛋白胨＞硫酸銨＞苯丙氨酸＞硝酸鈉＞精氨酸。病原菌對硝酸鈣的吸收利用最好，菌落平均直徑為3.97 cm，菌落顏色為中間淡黃色邊緣白色，菌絲緊密，其次是蛋白胨。當以精氨酸為氮源時，菌落最小，平均直徑只有1.27 cm，與其他氮源存在顯著差異。

表4 不同氮源薏苡黑穗病菌菌絲生長形態(tài)

2.6 不同pH值對薏苡黑穗病菌菌絲生長的影響

由表5可知，在pH 值7～11的范圍內(nèi)，薏苡黑穗病菌菌絲生長隨堿度的增加呈逐漸遞減的趨勢。當pH值為6時病原菌菌落最大，平均菌落直徑為3.4 cm，菌落中間為米白色，邊緣為白色，菌絲濃密，與pH值為5時菌絲的生長沒有顯著差異（P＞0.05），說明薏苡黑穗病菌菌絲偏好在弱酸性條件下生長。

表5 不同pH值薏苡黑穗病菌菌絲生長形態(tài)

2.7 不同碳氮比對薏苡黑穗病菌菌絲生長的影響

由表6可知，當碳氮比為30∶70時，薏苡黑穗病菌菌絲的長勢較好，平均菌落直徑為3.92 cm，與其余碳氮比條件下菌絲的生長存在顯著差異（P＜0.05），菌落特征表現(xiàn)為中間淡黃色邊緣白色，菌絲緊密。碳氮比升高，菌絲長勢總體呈現(xiàn)下降的趨勢，碳氮比在100∶0時菌絲長勢最弱，菌落白色，稀疏。

表6 不同碳氮比薏苡黑穗病菌菌絲生長形態(tài)

3 討論與結(jié)論

薏苡黑粉菌在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中較為常見，病原菌的生物學特性與病害的發(fā)生和流行規(guī)律有緊密聯(lián)系[11]，研究薏苡黑穗病病原菌的生物學特性，可為病害的防治提供理論參考。

病原菌的生長和產(chǎn)孢受溫度、pH、營養(yǎng)元素等多種因素影響[12]。練啟仙等[13]研究不同條件對薏苡黑穗病菌冬孢子萌發(fā)的影響，明確了孢子萌發(fā)的適宜溫度為25℃，中性和偏酸條件均有利于冬孢子萌發(fā)。本研究中薏苡黑穗病菌菌絲生長的適宜溫度為25℃，且弱酸性條件對菌絲生長有利，這與已有研究結(jié)果類似。

不同病原菌的最適培養(yǎng)條件不完全相同[14]。肖淑芹等[15]的研究結(jié)果表明，玉米瘤黑粉病菌對天冬氨酸氮源利用較好，其次是硝酸鉀，當以硫酸銨為氮源時菌絲生長幾乎停止。本研究結(jié)果表明，薏苡黑穗病菌菌絲對硝酸鈣的利用較好，對精氨酸的利用效果最差，與肖淑芹等的研究結(jié)果不一致，說明不同病原菌對氮源的需求和利用存在差異。吳偉懷等[16]認為葡萄糖和蔗糖均能促進甘蔗黑穗病菌厚垣孢子萌發(fā)，但高濃度則會抑制其萌發(fā)；翟璐等[17]研究發(fā)現(xiàn)玉米黑粉菌菌絲生長最適碳源為葡萄糖。本研究中薏苡黑穗病菌菌絲在以蔗糖作為唯一碳源的條件下生長最好，其次是葡萄糖，研究結(jié)果與已有研究結(jié)果相似。碳氮比（C/N）對微生物生長發(fā)育尤為重要[18]，已有研究表明碳氮比對食用菌菌絲生長速度以及子實體的形成均存在較大影響[19]，本研究中，薏苡黑穗病菌菌絲碳氮比為30∶70時的菌落平均直徑顯著優(yōu)于其他培養(yǎng)條件。

薏苡黑穗病菌在不同培養(yǎng)基上的長勢不同，本研究中，薏苡黑穗病菌在PDA培養(yǎng)基上生長最好，培養(yǎng)28 d后菌落為米黃色，中間菌絲呈褶皺狀突起，與劉榮等[20]對薏苡黑穗病菌在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)15 d的描述（菌落中央皺褶凸起，表面菌絲白色）不完全一致，推測產(chǎn)生差異的原因可能是由于培養(yǎng)周期和地域不同。

綜上所述，薏苡黑穗病菌菌絲生長的適宜溫度為25℃，適宜pH值為5～6，利用效果較好的碳、氮源分別為蔗糖和硝酸鈣。本研究結(jié)果可為掌握薏苡黑穗病菌菌絲體生長、繁殖所需的營養(yǎng)條件及防治奠定理論基礎(chǔ)。不同區(qū)域的薏苡黑穗病菌其菌絲生長的條件是否存在差異有待進一步研究。