基于炎癥模型大鼠建立穿心蓮內(nèi)酯抗炎作用的PK-PD 模型

姚媛，廖瓊峰，陳國(guó)平，孫旭，蘇芬麗 （. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東 廣州 50405；. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東 廣州 50006）

穿心蓮內(nèi)酯是中藥穿心蓮的主要有效成分之一，具有抗炎、抗菌作用[1]，對(duì)諸多炎癥性疾病和感染性疾病有良好療效，已被開(kāi)發(fā)成為多種制劑應(yīng)用于臨床，如喜炎平注射液可用于治療新冠病毒感染重癥患者[2]。穿心蓮內(nèi)酯口服制劑因其療效確切，安全性高，使用方便，被臨床廣泛用于治療上呼吸道感染、細(xì)菌性痢疾等。然而以往的研究[3]發(fā)現(xiàn)，在正常動(dòng)物體內(nèi)，穿心蓮內(nèi)酯口服生物利用度低。這一特點(diǎn)無(wú)法解釋穿心蓮內(nèi)酯在臨床上高效的抗炎作用。在疾病條件下，藥物在體內(nèi)的藥效學(xué)和藥動(dòng)學(xué)行為可能發(fā)生改變。基于藥物本身是作用于疾病狀態(tài)下的機(jī)體，本研究通過(guò)大鼠炎癥模型，研究穿心蓮內(nèi)酯血藥濃度與對(duì)炎癥因子的作用關(guān)系，旨在建立穿心蓮內(nèi)酯在體內(nèi)炎癥狀態(tài)下的藥代動(dòng)力學(xué)-藥效動(dòng)力學(xué)（PK-PD）結(jié)合模型，客觀闡明穿心蓮內(nèi)酯發(fā)揮抗炎作用的量效關(guān)系和作用時(shí)間窗，以期為其臨床治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器 BS224S 萬(wàn)分之一電子天平，德國(guó)Sartorius公司； HH-6 數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市富華儀器有限公司；3K30 離心機(jī)，德國(guó)Sigma 公司；5424 型小型高速離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf 公司； Varsoskan Flash 多功能酶標(biāo)儀，美國(guó)Thermo 公司；Thermo Scientific Ultimate 3000 液相系統(tǒng)、TSQ Endura 三重四極桿質(zhì)譜儀、Thermo Fisher 和Thermo Scientific Xcalibur 數(shù)據(jù)采集和處理系統(tǒng)，美國(guó)Thermo 公司。

1.2 藥物與試劑 穿心蓮內(nèi)酯對(duì)照品，中國(guó)藥品生物制品研究院，批號(hào)：110797-201609，純度≥98%；白術(shù)內(nèi)酯對(duì)照品，上海詩(shī)丹德生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：4030，純度≥98%；穿心蓮內(nèi)酯供試品，西安美禾生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：2021040301，純度≥98%；脂多糖（LPS），美國(guó)Sigma-Aldrich 公司，批號(hào)：12181202，純度≥98%；大鼠TNF-α、IL-1β及IL-6 酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，天津安諾瑞康生物技術(shù) 有 限 公 司， 批 號(hào)： 596210720、 310210720、385210720；甲醇、甲酸，色譜純，德國(guó)Merck 公司；實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。

1.3 動(dòng)物 SPF 級(jí)SD 大鼠，180～220 g，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（粵）2018-0002，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)44007200090193。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)環(huán)境：廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院SPF 級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室。動(dòng)物飼養(yǎng)于溫度（22±2）℃、相對(duì)濕度（60±10）%的環(huán)境中，飼養(yǎng)管理均按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的要求及規(guī)則執(zhí)行。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)廣東省中醫(yī)藥工程研究院動(dòng)物倫理委員會(huì)審批，審批號(hào)：048889。

1.4 大鼠炎癥模型的建立 選取雄性SD 大鼠10 只，體質(zhì)量（250±20）g，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d。按10 mg·kg-1給予大鼠腹腔一次性注射LPS 溶液，注射后正常飲食，備用[4]。大鼠腹腔注射麻醉后仰臥位躺立，對(duì)右頸部進(jìn)行皮膚消毒后剪開(kāi)，鈍性分離頸靜脈，將此靜脈的遠(yuǎn)心端結(jié)扎，在血管上剪一小切口；然后沿切口處向心臟方向插入連接1 mL 注射器，觀察出血是否順暢，后拔掉注射器，將聚乙烯管的末端固定在頸部的皮膚上，縫合開(kāi)口處。

1.5 藥液的制備 先稱取穿心蓮內(nèi)酯0.080 g，置研缽中，先加一滴乙醇充分研磨，再用0.5%CMC-Na配制成穿心蓮內(nèi)酯質(zhì)量濃度約為11 mg·mL-1的混懸藥液。藥液現(xiàn)配現(xiàn)用，并超聲充分混勻。

1.6 穿心蓮內(nèi)酯在炎癥模型大鼠體內(nèi)的藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究 取炎癥模型大鼠，按84.70 mg·kg-1灌胃穿心蓮內(nèi)酯，于給藥前及給藥后5、15、30 min，1、1.5、2、3、4、6、8、10、12 h 各采血0.45 mL，置于肝素化的離心管中，以3 500 r·min-1離心15 min（離心半徑13.5 cm），分離血漿，取血漿樣品100 μL于-80 ℃下保存，用于藥效學(xué)考察。

取血漿樣品50 μL，置于1.5 mL 高速離心管中。精密加入4.0 μg·mL-1內(nèi)標(biāo)溶液白術(shù)內(nèi)酯50 μL，甲醇100 μL，渦流混合1 min，離心10 min（15 000 r·min-1，離心半徑7.7 cm），取上清液10 μL 進(jìn)樣分析。采用LC-MS/MS 測(cè)定不同時(shí)間點(diǎn)血漿中穿心蓮內(nèi)酯的質(zhì)量濃度，按非房室模型計(jì)算穿心蓮內(nèi)酯主要的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。

1.7 穿心蓮內(nèi)酯干預(yù)后的藥效動(dòng)力學(xué)考察 取“1.6”項(xiàng)下的血漿樣品，按酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書操作，測(cè)定不同時(shí)間點(diǎn)血漿中IL-6、IL-β 和TNF-α 的含量，結(jié)合“1.6”項(xiàng)下樣品的血藥濃度數(shù)據(jù)，分別繪制穿心蓮內(nèi)酯的質(zhì)量濃度-時(shí)間和效應(yīng)濃度-時(shí)間曲線。

1.8 穿心蓮內(nèi)酯在效應(yīng)室質(zhì)量濃度的擬合 將“1.7”項(xiàng)下穿心蓮內(nèi)酯的質(zhì)量濃度-時(shí)間及效應(yīng)濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)導(dǎo)入到Phoenic 8.1 軟件，通過(guò)半房室模型工具對(duì)上述數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，獲得穿心蓮內(nèi)酯在效應(yīng)室的質(zhì)量濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)，進(jìn)而繪制穿心蓮內(nèi)酯效應(yīng)室的質(zhì)量濃度-效應(yīng)曲線（以IL-6、IL-β 和TNF-α 為藥效指標(biāo)）。

1.9 穿心蓮內(nèi)酯PK-PD 結(jié)合模型的建立 固定“1.6”項(xiàng)下穿心蓮內(nèi)酯的相關(guān)藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，采用Phoenic 8.1 軟件中的Phoenic model 項(xiàng)下的“PK”模型進(jìn)行擬合，獲得PK 參數(shù)；采用Phoenic model 項(xiàng)下的“PD”模型，對(duì)“1.8”項(xiàng)下效應(yīng)室濃度-效應(yīng)關(guān)系（分別以IL-6、IL-β 和TNF-α 為藥效指標(biāo)）進(jìn)行擬合，得相關(guān)PD 參數(shù)；進(jìn)而獲得穿心蓮內(nèi)酯的PKPD 結(jié)合模型的參數(shù)，建立其PK-PD 結(jié)合模型。

2 結(jié)果

2.1 穿心蓮內(nèi)酯在炎癥模型大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)研究 炎癥模型大鼠灌胃給予穿心蓮內(nèi)酯后，大鼠血漿中穿心蓮內(nèi)酯的血藥濃度-時(shí)間關(guān)系經(jīng)一、二、三房室模型擬合后，以負(fù)2 倍對(duì)數(shù)似然函數(shù)值（-2LL）、最小化信息量（AIC）、貝葉斯信息準(zhǔn)則（BIC）為主要擬合優(yōu)度參數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)，發(fā)現(xiàn)二房室模型擬合優(yōu)度最高。通過(guò)模型計(jì)算后發(fā)現(xiàn)血藥濃度的實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值基本一致。穿心蓮內(nèi)酯的主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)：吸收速率常數(shù)（Ka）=0.045 08 min-1，表觀分布容積1（V1）=1 290 L，表觀分布容積2（V2）=3 733 L，清除率1（Cl1）=9.40 L·min-1，清除率2（Cl2）=37.82 L·min-1，分布半衰期（t1/2）=15.37 min。

2.2 穿心蓮內(nèi)酯干預(yù)后的藥效動(dòng)力學(xué)研究 分別以IL-6、IL-1β 和TNF-α 為藥效指標(biāo)，穿心蓮內(nèi)酯在炎癥模型大鼠體內(nèi)的血藥濃度-時(shí)間和效應(yīng)-時(shí)間之間的變化見(jiàn)圖1。

圖1 穿心蓮內(nèi)酯在炎癥大鼠體內(nèi)的血藥濃度-時(shí)間和效應(yīng)-時(shí)間曲線（n=10）Figure 1 Plasma concentration-time and effect-time profiles of andrographolide in inflammatory model rats（n=10）

2.3 穿心蓮內(nèi)酯在效應(yīng)室濃度（Ce）的擬合 以IL-6、IL-β 及TNF-α 為藥效指標(biāo)，可得穿心蓮內(nèi)酯在效應(yīng)室的效應(yīng)-濃度變化，如圖2 所示。

圖2 穿心蓮內(nèi)酯在炎癥模型大鼠體內(nèi)的效應(yīng)室質(zhì)量濃度-效應(yīng)曲線（n=10）Figure 2 Concentration in effect compartment and effect profiles of andrographolide in inflamatory model rats（n=10）

2.4 穿心蓮內(nèi)酯的PK-PD 模型的建立 分別以IL-6、IL-β、TNF-α 為藥效指標(biāo)時(shí)，利用Phoenic model 項(xiàng)下的“PK-Emax”模型進(jìn)行擬合計(jì)算，得到穿心蓮內(nèi)酯的PK-PD 參數(shù)。見(jiàn)表1。根據(jù)穿心蓮內(nèi)酯的PK-PD參數(shù)，以IL-6 為藥效指標(biāo)時(shí)，可得穿心蓮內(nèi)酯的PK-PD 模型為：E=55.004-20.544 5×Ce/（1.680 23+Ce）。最終模型擬合的-2LL 為78.83，AIC 值為100.83，BIC 值為114.68，說(shuō)明該模型擬合度較精確。

表1 穿心蓮內(nèi)酯以IL-6、IL-1β 和TNF-α 為藥效指標(biāo)的PK-PD 參數(shù)Table 1 PK-PD parameters of andrographolide when using IL-6，IL-1β and TNF-α as pharmacodynamic indexes

以IL-1β 為藥效指標(biāo)時(shí)，可得穿心蓮內(nèi)酯的PK-PD 模型為：E=133.776-42.560 3×Ce/（3.483 03+Ce）。最終模型擬合的-2LL 為132.40，AIC 值為156.40，BIC 值為171.50 ，說(shuō)明該模型擬合度較精確。

以TNF-α 為藥效指標(biāo)時(shí)，可得穿心蓮內(nèi)酯的PK-PD 模型為：E=138.27-52.412 2×Ce/（2.571 69+Ce）。最 終 模 型 擬 合 的-2LL 為109.73，AIC 值 為133.72， BIC 值為148.82，說(shuō)明該模型擬合度較精確。

式中E為效應(yīng)值。由上述PK-PD 模型可以根據(jù)穿心蓮內(nèi)酯的濃度推算出相應(yīng)的藥效值，也可以根據(jù)藥效值推算相對(duì)應(yīng)的濃度。

3 討論

以往對(duì)穿心蓮內(nèi)酯的藥動(dòng)學(xué)研究多在正常機(jī)體條件下進(jìn)行，未考慮炎癥狀態(tài)下藥物在體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)行為可能發(fā)生變化，從而導(dǎo)致藥物治療效果的差異。對(duì)于臨床而言，病理狀態(tài)下獲得的藥效指標(biāo)更有意義[5]。因此，在疾病狀態(tài)下進(jìn)行穿心蓮內(nèi)酯的PK-PD 研究，可客觀評(píng)價(jià)穿心蓮內(nèi)酯在機(jī)體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)行為和產(chǎn)生藥理效應(yīng)的動(dòng)態(tài)變化，為科學(xué)預(yù)測(cè)其在感染性疾病中的作用機(jī)制提供參考[6-7]。

本研究主要是以大鼠炎癥模型為研究對(duì)象，觀察穿心蓮內(nèi)酯的血藥濃度-時(shí)間曲線以及效應(yīng)-時(shí)間曲線。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在大鼠給藥后，隨著穿心蓮內(nèi)酯的血藥濃度的提高，炎癥因子表達(dá)緩慢下降，給藥30 min 后血藥濃度達(dá)峰，而IL-6、IL-1β 和TNF-α在給藥后90 min 才基本達(dá)到最大下調(diào)值，提示藥物在作用部位的效應(yīng)變化滯后于血藥濃度變化，藥物分布至靶點(diǎn)的延遲、通過(guò)間接機(jī)制產(chǎn)生活性、受體激活時(shí)間的延長(zhǎng)和耐受現(xiàn)象的產(chǎn)生等[8]均可能是導(dǎo)致滯后現(xiàn)象產(chǎn)生的原因。根據(jù)這種變化關(guān)系宜采用間接效應(yīng)連接模型建立PK-PD 模型。因此以Phoenic 8.1 軟件中的半房室模型法對(duì)血藥濃度-效應(yīng)濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，獲得穿心蓮內(nèi)酯在效應(yīng)室的質(zhì)量濃度-效應(yīng)濃度數(shù)據(jù)，采用效應(yīng)室間接連接模型擬合，進(jìn)而呈現(xiàn)穿心蓮內(nèi)酯與藥效指標(biāo)之間的量效關(guān)系，最終建立穿心蓮內(nèi)酯的PK-PD 結(jié)合模型。

穿心蓮內(nèi)酯的PK-PD 模型結(jié)果表明，IL-6、IL-1β、TNF-α 的濃度與穿心蓮內(nèi)酯的質(zhì)量濃度存在一定的相關(guān)性。由此可推測(cè)穿心蓮內(nèi)酯通過(guò)抑制促炎性細(xì)胞因子IL-6、IL-1β、TNF-α 的表達(dá)發(fā)揮抗炎作用。通過(guò)對(duì)炎癥狀態(tài)下穿心蓮內(nèi)酯的PK-PD 模型建立，可準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)穿心蓮內(nèi)酯在炎癥狀態(tài)下體內(nèi)的動(dòng)力學(xué)過(guò)程和產(chǎn)生藥理效應(yīng)的動(dòng)態(tài)變化，為揭示中藥穿心蓮及穿心蓮內(nèi)酯制劑的清熱解毒的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制提供參考。