初級(jí)體感皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞參與電針治療炎性痛的實(shí)驗(yàn)研究

謝創(chuàng)波，艾娟，李向宇，趙高峰，許能貴

1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，廣東 廣州510006

2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)針灸康復(fù)臨床醫(yī)學(xué)院華南針灸研究中心，廣東 廣州510006

電針（EA）鎮(zhèn)痛效果確切，臨床應(yīng)用廣泛，但其機(jī)制仍未完全闡明。一直以來(lái)，研究者們認(rèn)為電針鎮(zhèn)痛主要與疼痛神經(jīng)傳導(dǎo)通路上相關(guān)神經(jīng)元的活動(dòng)變化有關(guān)[1-2]。近年來(lái)，星形膠質(zhì)細(xì)胞在疼痛的發(fā)生和調(diào)控中的作用被越來(lái)越多的研究者所報(bào)道[3-5]。多項(xiàng)研究表明，電針可以通過(guò)抑制脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化而發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用[6-8]。在疼痛傳入通路的大腦皮層感覺(jué)區(qū)域——初級(jí)體感皮層中，星形膠質(zhì)細(xì)胞也參與了疼痛的形成[9]。然而，初級(jí)體感皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞是否在電針鎮(zhèn)痛中發(fā)揮作用仍未見(jiàn)報(bào)道。本研究旨在通過(guò)觀察初級(jí)體感皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞在電針治療炎癥性疼痛中的作用，探討初級(jí)體感皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞是否參與電針鎮(zhèn)痛，探索電針鎮(zhèn)痛的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選取健康SPF 級(jí)8～12 周雄性C57小鼠80只，體質(zhì)量（25±3）g，購(gòu)自廣東至遠(yuǎn)生物醫(yī)藥科技有限公司，合格證號(hào)為SCXK（粵）2021-0057。飼養(yǎng)于光照與黑暗各12 h 循環(huán)交替，溫度控制在（23±1）℃的環(huán)境中，自由攝食和飲水。本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（No.20220629001），在廣州中醫(yī)藥大學(xué)華南針灸研究中心完成。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組與造模本研究分3 部分實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)一為電針治療炎性痛效果的觀察，將實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為4 組（每組8 只）：空白對(duì)照組（ShamCFA 組）、模型組（CFA 組）、假電針組（CFA+ShamEA 組）和電針組（CFA+EA 組）。除ShamCFA 組外，其余3 組均在異氟烷麻醉下于左后足底緩慢注射完全弗氏佐劑（CFA）20 μL。ShamCFA 組以相同方法注射等體積0.9%氯化鈉溶液。實(shí)驗(yàn)二為觀察抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)小鼠痛閾及電針鎮(zhèn)痛效果的影響，將實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為4 組（每組8 只）：模型組（CFA+aCSF 組）、星形膠質(zhì)細(xì)胞抑制組（CFA+L-α-AAA 組）、電針組（CFA+aCSF+EA 組）和星形膠質(zhì)細(xì)胞抑制復(fù)合電針組（CFA+L-α-AAA+EA 組），各組CFA 造模方法同實(shí)驗(yàn)一。實(shí)驗(yàn)三為觀察激活星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)電針鎮(zhèn)痛效果的影響，將實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為2 組（每組8 只）：化學(xué)遺傳激活組（CFA+EA+CNO 組）和化學(xué)遺傳對(duì)照組（CFA+EA+Saline 組），2 組均需造模，方法同實(shí)驗(yàn)一。

1.3 穴位選取及電針本實(shí)驗(yàn)中電針穴位為左下肢“環(huán)跳”穴和“陽(yáng)陵泉”穴，按照中國(guó)中醫(yī)藥出版社《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》定位，分別為后肢髖關(guān)節(jié)上緣0.3 cm 處和后肢腓骨小頭前下方凹陷處。電針時(shí)將華佗牌無(wú)菌針灸針（蘇州醫(yī)療用品廠有限公司，規(guī)格：0.25 mm×13 mm）刺入皮膚2～3 mm，電針參數(shù)為頻率2 Hz、電流1 mA，每次30 min，連續(xù)7 d。實(shí)驗(yàn)一中空白對(duì)照組和模型組不進(jìn)行電針，假電針組僅將針灸針刺入皮下，不通電。實(shí)驗(yàn)一和實(shí)驗(yàn)三小鼠在造模后第2 天進(jìn)行電針治療。實(shí)驗(yàn)二所有小鼠在藥物注射3 d 后進(jìn)行電針治療。

1.4 立體定位注射與化學(xué)遺傳操縱實(shí)驗(yàn)二中所有小鼠在CFA 造模后第2 天進(jìn)行腦區(qū)藥物注射。在異氟烷麻醉下，CFA+L-α-AAA 組和CFA+L-α-AAA+EA 組注射星形膠質(zhì)細(xì)胞選擇性膠質(zhì)毒素L-α-氨基己二酸（L-α-AAA）（上海西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司，貨號(hào)A7275），使用人工腦脊液（aCSF）配制為0.1 mol/L，注射區(qū)域?yàn)槌跫?jí)體感皮層后肢區(qū)（S1HL），坐標(biāo)為（AP-0.5 mm，ML-1.75 mm），注射深度為硬腦膜下0.65 mm，注射量為1 μL，CFA+aCSF 組和CFA+aCSF+EA 組僅注射等量人工腦脊液。

實(shí)驗(yàn)三中所有小鼠在CFA 造模前3 周進(jìn)行病毒注射。2 組小鼠均在異氟烷麻醉下注射化學(xué)遺傳激活病毒rAAV-GfaABC1D-hM3D（Gq）-mCherry，AAV2/5（武漢樞密腦科學(xué)技術(shù)有限公司，批次5-1169-K210810，滴度5.31E+12 vg/mL）。注射區(qū)域和深度同實(shí)驗(yàn)二，病毒注射量為200 nL，注射速度40 nL/min。CFA+EA+CNO 組在每次電針前40 min 按1 mg/kg 腹腔注射N(xiāo)-氧化氯氮平（CNO）（武漢樞密腦科學(xué)技術(shù)有限公司，批次CNO-220412）以特異性激活初級(jí)體感皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞。CFA+EA+Saline 組電針前40 min腹腔注射等量0.9%氯化鈉溶液。

1.5 疼痛閾值檢測(cè)本實(shí)驗(yàn)分別使用VonFrey 電子測(cè)痛儀（深圳市瑞沃德生命科技有限公司）和紅外熱痛測(cè)試儀（深圳市瑞沃德生命科技有限公司）進(jìn)行機(jī)械痛閾值（PWT）和熱痛閾值（TL）檢測(cè)。分別于造模前1 天（Baseline）、造模后1 天（Model）和電針第1、3、5、7 天（Day1、Day3、Day5、Day7）進(jìn)行檢測(cè)，共6 次。每次痛閾檢測(cè)重復(fù)3次，每次間隔大于5 min，取平均值作為該次測(cè)量值。

1.6 病毒表達(dá)位置驗(yàn)證及免疫熒光檢測(cè)最后一次疼痛閾值檢測(cè)后在麻醉下將實(shí)驗(yàn)小鼠進(jìn)行心臟灌注和斷頭取腦，4%PFA 固定后分別使用15%和30%蔗糖溶液進(jìn)行梯度脫水。小鼠腦組織在30%蔗糖溶液中沉底后，按照第4 版腦立體定位圖譜，使用冰凍切片機(jī)進(jìn)行大腦切片，厚度40 μm。分別使用兔源膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）多克隆抗體（一抗，廣州昂科生物科技有限公司，批號(hào)WF3312325C）、驢抗兔IgG，Alexa Fluor 488 抗體（二抗，廣州昂科生物科技有限公司，批號(hào)2286294）和4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，碧云天生物技術(shù)有限公司）對(duì)小鼠腦片進(jìn)行免疫熒光染色。標(biāo)本制備完成后，使用共聚焦顯微鏡（尼康，日本）拍攝熒光圖片。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。采用Shapiro-Wilk 檢驗(yàn)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)。各組不同時(shí)間點(diǎn)疼痛閾值的比較，符合正態(tài)分布時(shí)采用兩因素重復(fù)測(cè)量資料的方差分析，兩兩比較采用Bonferroni 事后檢驗(yàn)。不符合正態(tài)分布時(shí)采用秩和檢驗(yàn)。P＜0.05 表示有顯著性差異。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 電針治療對(duì)炎性痛小鼠疼痛閾值的影響見(jiàn)圖1。造模24 h后，除ShamCFA 組外，各組小鼠PWT 和TL 與基線值相比均顯著下降（P＜0.05），提示造模成功。與CFA 組比較，CFA+EA 組電針治療第3、5、7 天PWT 均顯著上升（P＜0.05）；而CFA+ShamEA 組各時(shí)間點(diǎn)PWT 與CFA 組均無(wú)明顯差異（P＞0.05）。與CFA 組比較，CFA+EA 組TL 在電針治療第3、5、7 天均顯著上升（P＜0.05）；而CFA+ShamEA 組各時(shí)間點(diǎn)TL 與CFA 組均無(wú)明顯差異（P＞0.05）。

圖1 各組小鼠疼痛閾值檢測(cè)結(jié)果比較

2.2 抑制初級(jí)體感皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)炎性痛小鼠疼痛閾值及電針鎮(zhèn)痛效果的影響見(jiàn)圖2。與CFA+aCSF 組比較，CFA+L-α-AAA 組在造模后抑制了初級(jí)體感皮層的星形膠質(zhì)細(xì)胞，顯著提高了炎性痛小鼠的PWT 和TL（P＜0.05），并可維持到電針第7 天的時(shí)間點(diǎn)。與CFA+aCSF+EA 組比較，CFA+L-α-AAA+EA 組在電針第1、3 天PWT 顯著提高（P＜0.05）；而在電針第5、7天，2 組PWT 無(wú)顯著差異（P＞0.05）。與CFA+aCSF+EA 組比較，CFA+L-α-AAA+EA 組在電針第1、3 天TL 顯著提高（P＜0.05）；而在電針第5、7天，2 組TL 無(wú)顯著差異（P＞0.05）。另外，與CFA+L-α-AAA 組比較，CFA+Lα-AAA+EA 組在電針第7 天PWT 和TL 均顯著提高（P＜0.05）。

圖2 各組小鼠疼痛閾值檢測(cè)結(jié)果比較

2.3 化學(xué)遺傳操縱病毒轉(zhuǎn)染初級(jí)體感皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞的情況見(jiàn)圖3。本研究使用帶有星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性啟動(dòng)子GfaABC1D 的重組腺相關(guān)病毒（rAAV）來(lái)轉(zhuǎn)染S1HL 腦區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞，在細(xì)胞膜表面表達(dá)化學(xué)遺傳激活的元件——hM3Dq（一種G 蛋白偶聯(lián)受體，可被外源性藥物CNO 特異性激活）。圖3B 展示了病毒轉(zhuǎn)染的范圍，病毒表達(dá)報(bào)告蛋白——mCherry（紅色）的范圍指示了hM3Dq 準(zhǔn)確表達(dá)于S1HL腦區(qū)。圖3C 中CFA+EA+Saline 組和CFA+EA+CNO組的化學(xué)遺傳病毒均可準(zhǔn)確與星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)記物——GFAP 共標(biāo)，提示2 組病毒均轉(zhuǎn)染皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞并星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)化學(xué)遺傳操縱元件。

圖3 星形膠質(zhì)細(xì)胞化學(xué)遺傳病毒注射位點(diǎn)示意圖及病毒表達(dá)情況

2.4 化學(xué)遺傳激活初級(jí)體感皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)電針鎮(zhèn)痛效果的影響見(jiàn)圖4。與造模24 h 后PWT 比較，CFA+EA+Saline 組電針第3、5、7 天的PWT 顯著提高（P＜0.05）。與CFA+EA+Saline 組比較，CFA+EA+CNO 組電針第3、5、7 天的PWT 均顯著降低（P＜0.05）。與造模24 h 后TL 比較，CFA+EA+Saline 組電針第3、5、7 天的TL 顯著提高（P＜0.05）。與CFA+EA+Saline 組比較，CFA+EA+CNO 組電針第3、5、7 天的TL 均顯著降低（P＜0.05）。

圖4 2 組小鼠疼痛閾值檢測(cè)結(jié)果比較

3 討論

炎癥性疼痛是指由創(chuàng)傷、手術(shù)以及感染等引起的外周組織損傷并導(dǎo)致炎癥時(shí)所產(chǎn)生的疼痛，是臨床常見(jiàn)的疼痛類(lèi)型。本研究中，我們選用了國(guó)內(nèi)外較為公認(rèn)的炎癥性疼痛模型—CFA 模型[10]研究。在造模24 h后，小鼠機(jī)械痛閾值和熱痛閾值的檢測(cè)均表明了造模成功。電針鎮(zhèn)痛是廣為認(rèn)可的治療疼痛的有效手段之一。據(jù)報(bào)道，電針可以有效治療炎癥性疼痛[11-12]。參照相關(guān)文獻(xiàn)[1-2]，本研究選取了環(huán)跳穴和陽(yáng)陵泉穴作為電針干預(yù)穴位。本研究結(jié)果表明，CFA+EA 組在電針治療第3 天開(kāi)始出現(xiàn)明顯的鎮(zhèn)痛效果，隨著電針次數(shù)的增加，疼痛閾值逐漸升高，說(shuō)明了電針環(huán)跳穴和陽(yáng)陵泉穴可以有效治療CFA 誘導(dǎo)的炎性痛，并且存在累積效應(yīng)。

星形膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中數(shù)量最多的一類(lèi)膠質(zhì)細(xì)胞，主要分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元周?chē)?。在脊髓與初級(jí)體感皮層中，疼痛的發(fā)生均伴隨星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活[6-7，9]。電針可以抑制脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞的活性而發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用[6-8]。由此可以推測(cè)，電針也可能通過(guò)對(duì)初級(jí)體感皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生抑制作用而發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用。本研究中，使用星形膠質(zhì)細(xì)胞選擇性膠質(zhì)毒劑——L-α-AAA[13]對(duì)初級(jí)體感皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行抑制，并觀察抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)炎性痛小鼠疼痛閾值的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與電針治療的效果類(lèi)似，抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞可以提高炎性痛小鼠的疼痛閾值。與電針治療的累積效應(yīng)不同的是，直接抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的CFA+L-α-AAA組在電針第1 天的時(shí)間點(diǎn)就呈現(xiàn)出提高痛閾的效果，并維持到第7 天。在電針治療的第1 天和第3天，CFA+L-α-AAA+EA 組小鼠的疼痛閾值顯著高于CFA+EA組，這可能是由于L-α-AAA 對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的抑制程度強(qiáng)于這兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)電針?biāo)苓_(dá)到的效應(yīng)。值得注意的是，雖然L-α-AAA 對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的抑制可以顯著提高疼痛閾值，但是在電針治療的第5 天和第7天，CFA+L-α-AAA+EA 組小鼠的疼痛閾值與CFA+EA 組無(wú)明顯差異，提示我們電針治療炎性痛的機(jī)制可能包含了對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的抑制，即星形膠質(zhì)細(xì)胞參與了電針鎮(zhèn)痛。在電針治療第7天，CFA+L-α-AAA+EA 組小鼠的疼痛閾值顯著高于CFA+L-α-AAA組，這提示星形膠質(zhì)細(xì)胞的參與只是電針治療炎性痛的部分機(jī)制。

為了進(jìn)一步證明星形膠質(zhì)細(xì)胞參與電針治療炎性痛，本研究使用化學(xué)遺傳學(xué)的方法激活初級(jí)體感皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞，并觀察其對(duì)電針鎮(zhèn)痛的影響。本研究結(jié)果表明，在電針治療時(shí)激活初級(jí)體感皮層的星形膠質(zhì)細(xì)胞可以翻轉(zhuǎn)電針的鎮(zhèn)痛作用。這與通過(guò)間接活化星形膠質(zhì)細(xì)胞翻轉(zhuǎn)電針鎮(zhèn)痛效應(yīng)的研究結(jié)果類(lèi)似[14]。該研究中，研究者通過(guò)鞘內(nèi)注射選擇性腺苷A1 受體抑制劑引起了脊髓L4～6節(jié)段星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化，逆轉(zhuǎn)了電針的鎮(zhèn)痛效果，從而證明了脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞參與了電針鎮(zhèn)痛作用[14]。

Sun Kwang K等[9]研究發(fā)現(xiàn)，激活初級(jí)體感皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞代謝性谷氨酸受體5（mGluR5）信號(hào)通路可以誘發(fā)長(zhǎng)時(shí)間的痛覺(jué)過(guò)敏，而阻斷星形膠質(zhì)細(xì)胞mGluR5 信號(hào)通路則可以抑制機(jī)械痛覺(jué)過(guò)敏。阻斷星形膠質(zhì)細(xì)胞谷氨酸信號(hào)通路也可能是本研究中抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞和電針治療提高疼痛閾值的潛在原因。對(duì)“三聯(lián)突觸”（由突觸前膜、突觸后膜及包繞在其周?chē)男切文z質(zhì)細(xì)胞三部分共同組成）的研究表明星形膠質(zhì)細(xì)胞可以感知和調(diào)控神經(jīng)元活動(dòng)[15]。大腦皮層神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞的交互作用與疼痛的發(fā)生有關(guān)[4，9]。Yin W等[4]研究者發(fā)現(xiàn)，前扣帶回皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)元之間的乳酸轉(zhuǎn)運(yùn)與CFA 誘導(dǎo)的炎癥性疼痛密切相關(guān)。抑制糖異生和乳酸釋放可以阻斷CFA 誘導(dǎo)的持續(xù)疼痛，而外源性L-乳酸可以逆轉(zhuǎn)這種效應(yīng)。初級(jí)體感皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞參與電針治療炎性痛的機(jī)制也可能是由于電針抑制了皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)元之間的代謝物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)。本研究?jī)H從初級(jí)體感皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞的抑制和激活對(duì)電針治療炎癥性疼痛的影響這一角度說(shuō)明初級(jí)體感皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞參與了電針鎮(zhèn)痛。電針如何影響初級(jí)體感皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞的活性，以及神經(jīng)元與星形膠質(zhì)細(xì)胞如何相互作用并最終影響電針鎮(zhèn)痛效果仍需要進(jìn)一步的研究。另外，初級(jí)體感皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞是否在電針治療其他類(lèi)型的疼痛發(fā)揮作用仍有待探討。

總之，本研究結(jié)果表明電針環(huán)跳穴和陽(yáng)陵泉穴可以有效治療CFA 誘導(dǎo)的炎癥性疼痛，而初級(jí)體感皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞參與電針治療炎性痛。對(duì)初級(jí)體感皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞的干預(yù)可能是電針鎮(zhèn)痛的機(jī)制之一，也可能是炎癥性疼痛治療的靶點(diǎn)。