神經(jīng)退行性疾病相關(guān)蛋白病理性聚集和液液相分離研究進(jìn)展

唐一鳴，姚逸飛，楊中元，周運，王子超，韋廣紅

（復(fù)旦大學(xué)物理學(xué)系，表面物理國家重點實驗室，計算物質(zhì)科學(xué)教育部重點實驗室，上海 200438）

蛋白質(zhì)是生物功能的主要執(zhí)行者，它們通過折疊成特定的空間結(jié)構(gòu)來發(fā)揮生理功能，但在一定的條件下會發(fā)生錯誤折疊和聚集并導(dǎo)致疾病。神經(jīng)退行性疾病就是一類以蛋白質(zhì)異常相互作用和聚集為病理特征的疾病，如阿爾茨海默病與β淀粉樣蛋白（amyloid-β， Aβ）形成的淀粉樣斑塊以及微管相關(guān)蛋白（tubulin associated unit， Tau）異常聚集而形成的神經(jīng)纖維纏結(jié)有關(guān)［1］；帕金森病的病理特征是α-突觸核蛋白（α-synuclein，αSyn）聚集成的路易小體［2］；肌萎縮側(cè)索硬化癥與TDP-43蛋白包涵體有關(guān)［3］。除此之外，最新研究表明：很多神經(jīng)退行性疾病相關(guān)蛋白（包括Tau［4］、αSyn［5］、TDP-43［6］）亦能發(fā)生液液相分離并組裝成液態(tài)凝聚物（在體內(nèi)被稱為無膜細(xì)胞器），進(jìn)而發(fā)揮調(diào)控信號傳導(dǎo)和異染色質(zhì)轉(zhuǎn)錄等生理功能［7］。病理性纖維化與液液相分離是蛋白質(zhì)聚集的兩種形式，蛋白質(zhì)液液相分離可能是下一步錯誤聚集和纖維化的驅(qū)動力［8-9］。在細(xì)胞微環(huán)境（如pH、溫度）改變或氨基酸突變等情況下，蛋白質(zhì)液態(tài)凝聚物會進(jìn)一步發(fā)生液-固相變，形成病理性纖維［10］。表1列出了部分能發(fā)生纖維化和/或相分離的神經(jīng)退行性疾病相關(guān)蛋白。

表1 代表性神經(jīng)退行性疾病相關(guān)蛋白的聚集和相分離能力Table 1 Aggregation and phase separation of proteins associated with neurodegenerative diseases

研究蛋白質(zhì)分子間相互作用以及聚集的微觀機理，對于進(jìn)一步理解蛋白質(zhì)的生理功能和病理過程，以及相關(guān)疾病的藥物研發(fā)具有非常重要的科學(xué)意義和應(yīng)用價值。目前對于神經(jīng)退行性疾病相關(guān)蛋白的毒性機理和纖維化機制已經(jīng)有廣泛和深入的研究。利用X射線衍射、核磁共振、冷凍電鏡等實驗方法，研究人員解析出了大量蛋白的纖維結(jié)構(gòu)，它們具有cross-β的結(jié)構(gòu)特征，即由主鏈間氫鍵穩(wěn)定的β折疊結(jié)構(gòu)。多種實驗方法已經(jīng)被用來表征蛋白質(zhì)的纖維形貌和纖維化過程［28］；計算模擬被用來研究纖維的熱力學(xué)性質(zhì)、揭示蛋白-蛋白以及纖維-抑制劑之間的相互作用機理［29-30］。與此相比，蛋白質(zhì)液液相分離微觀機制的研究尚處于起步階段。目前普遍認(rèn)為蛋白質(zhì)固有無序區(qū)域之間的多價相互作用是相分離的主要驅(qū)動力［31-32］，但對于凝聚物內(nèi)部的蛋白構(gòu)象特征、蛋白-蛋白、蛋白-RNA之間的相互作用模式等，尚知之甚少。本文將以神經(jīng)退行性疾病相關(guān)蛋白為切入點，綜述它們病理性聚集和液液相分離的前沿進(jìn)展，介紹表征蛋白質(zhì)聚集體形貌和空間結(jié)構(gòu)的實驗手段，研究蛋白質(zhì)相互作用、聚集和相分離微觀機理的理論和計算方法，以及預(yù)測相分離能力的機器學(xué)習(xí)方法。

1 神經(jīng)退行性疾病相關(guān)蛋白病理性聚集的實驗研究方法

為了理解神經(jīng)退行性疾病的病理過程，揭示相關(guān)蛋白病理性聚集的物理機制，國內(nèi)外實驗工作者已經(jīng)開展了大量研究，包括解析纖維的空間結(jié)構(gòu)和形貌、表征纖維化的動力學(xué)過程等。表2列出了主要實驗方法（主要包括譜學(xué)方法和顯微方法兩大類）以及它們各自的適用范圍。

表2 研究蛋白質(zhì)病理性聚集的主要實驗方法Table 2 Major experimental methods for studying protein pathological aggregation

圓二色譜法（circular dichroism spectroscopy，即CD譜）［33］和傅里葉紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy， FTIR）［34］等譜學(xué)方法常用來測定蛋白質(zhì)鏈中的二級結(jié)構(gòu)含量。這些方法具有操作簡便、測定時間短等優(yōu)點，但不能表征二級結(jié)構(gòu)在蛋白質(zhì)鏈上的分布。根據(jù)核磁共振方法（nuclear magnetic resonance， NMR）測得的特定原子化學(xué)位移，可以得到每個氨基酸形成的二級結(jié)構(gòu)類型［46］。跟蹤熒光強度的時間演化是實驗表征蛋白質(zhì)纖維化過程以及抑制劑分子干預(yù)的主要手段，如ThT熒光光譜法（ThT fluorescence spectroscopy， ThT-FS）［35］。例如根據(jù)在Tau255-411溶液中加入硫酸化的肝素后的ThT信號的增長速度快慢，判定肝素對Tau蛋白片段的纖維化的影響［47］。值得注意的是，一些外源性化合物本身會導(dǎo)致ThT熒光信號產(chǎn)生偏差［48］。

掃描電鏡（scanning electron microscope， SEM）［36］、透射電鏡（transmission electron microscope，TEM）［37］、原子力顯微鏡（atomic force microscope，AFM）［38］等方法是用于表征淀粉樣纖維空間形貌的常用方法。如Islam等［49］結(jié)合TEM和SEM觀測到Aβ淀粉樣纖維具有螺旋狀纏結(jié)的形貌；Makky等［50］通過TEM發(fā)現(xiàn)Tau蛋白能形成6種具有不同形貌的纖維，并通過AFM給出了這6種纖維的高度。由于淀粉樣纖維不溶于水，又很難結(jié)晶，常規(guī)的解析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的方法，如晶體X射線衍射和液體核磁共振不能用于解析纖維的結(jié)構(gòu)。X射線衍射只能得到主鏈的骨架信息，即cross-β結(jié)構(gòu)。例如Salveson等［51］通過X射線衍射（X-ray diffraction， XRD）方法解析出了具有cross-β結(jié)構(gòu)的Aβ16-36纖維。解析纖維原子分辨空間結(jié)構(gòu)的主要方法包括固體核磁共振（solid-state NMR，ssNMR）［40-41］和冷凍電鏡［43］方法。如Tuttle等［52］通過ssNMR解析出了全長Aβ40的纖維結(jié)構(gòu)。Gremer等［53］、Fitzpatrick等［13］以及Li等［21］分別通過冷凍電鏡解析出了全長Aβ42蛋白、Tau306-378和TDP-43低復(fù)雜度結(jié)構(gòu)域（low-complexity domain， LCD）的纖維結(jié)構(gòu)。這些纖維結(jié)構(gòu)的解析為藥物研發(fā)提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

用于表征蛋白質(zhì)纖維化過程中蛋白分子內(nèi)/分子間相互作用的實驗方法有交聯(lián)質(zhì)譜（chemical crosslinking of proteins coupled with mass spectrometry，簡稱CXMS或XL-MS）［44］、核磁共振［40-41］、熒光共振能量轉(zhuǎn)移（fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET）［45］方法等。例如Daniele Ubbiali等［54］采用交聯(lián)質(zhì)譜的方法跟蹤αSyn蛋白聚集過程中相互作用的演化，觀察到蛋白質(zhì)鏈隨著聚集進(jìn)程逐漸伸展；Yoh課題組［55］使用固體核磁共振方法觀察到了αSyn蛋白在纖維化過程中單體構(gòu)象逐漸伸展并形成β折疊結(jié)構(gòu)的過程。Meng等［56］使用單分子熒光共振能量轉(zhuǎn)移方法研究了Aβ40和Aβ42的單體構(gòu)象，發(fā)現(xiàn)兩者單體結(jié)構(gòu)均呈現(xiàn)高度無序的狀態(tài)。上述這些實驗手段為揭示蛋白質(zhì)聚集機理提供了重要幫助。

2 神經(jīng)退行性疾病相關(guān)蛋白自聚集和共聚集的實驗研究

神經(jīng)退行性疾病通常伴隨著神經(jīng)系統(tǒng)中的不溶性淀粉樣蛋白斑塊，這些斑塊通常由一種或多種蛋白質(zhì)聚集而成［57］。研究相關(guān)蛋白質(zhì)的聚集和共聚集，對深入理解神經(jīng)退行性疾病的復(fù)雜病理學(xué)成因至關(guān)重要。本節(jié)以αSyn、TDP-43、Aβ、Tau、FUS等疾病相關(guān)蛋白為例，簡要介紹實驗上對它們形成的纖維結(jié)構(gòu)的表征，并以αSyn和Aβ蛋白為例，介紹它們與其他蛋白質(zhì)共聚集的研究工作。上述五個蛋白中，αSyn、Aβ和Tau蛋白是固有無序蛋白，而TDP-43和FUS蛋白則分別包含了長為148、165個氨基酸的固有無序區(qū)域，它們均具有高親水性、高帶電性和結(jié)構(gòu)無序的特征。圖1給出了Aβ、αSyn、TDP-43、Tau和FUS代表性的纖維結(jié)構(gòu)及對應(yīng)的PDB ID。除了PDB ID為2M4J和2LNQ的Aβ纖維結(jié)構(gòu)與PDB ID為5W3N的FUS纖維結(jié)構(gòu)由ssNMR解出，PDB ID為5XSG的FUS纖維結(jié)構(gòu)由X射線衍射解出外，圖中其余結(jié)構(gòu)均由冷凍電鏡解出。該圖的最左邊給出了每種蛋白或其LCD的氨基酸占比（“其他”包含了所有低于5%含量的氨基酸）。

圖1 神經(jīng)退行性疾病相關(guān)的五種蛋白的氨基酸組成和代表性纖維結(jié)構(gòu)Fig.1 Amino acid composition and fibril structures of neurodegenerative disease-related proteins

2.1 阿爾茲海默病與Aβ、Tau蛋白

阿爾茨海默病是全球第一大神經(jīng)退行性疾病，它的病理進(jìn)程與大腦中β淀粉樣蛋白（β-amyloid，Aβ）和微管相關(guān)蛋白（Tau）形成的神經(jīng)纖維纏結(jié)有關(guān)。Aβ是最早被關(guān)注和研究的淀粉樣蛋白之一，全長的Aβ共有42個氨基酸，存在多個氨基酸數(shù)目少于42的異構(gòu)體，其中Aβ40和Aβ42是兩種被廣泛研究的重要異構(gòu)體。在過去的二十多年里，研究人員已經(jīng)通過核磁共振、冷凍電鏡等方法解析出了全長Aβ及其多個片段的空間結(jié)構(gòu)，如2M4J［58］、5OQV［53］等。Tau蛋白是一種主要在腦細(xì)胞中表達(dá)的微管相關(guān)蛋白，由441個氨基酸組成，主要具有穩(wěn)定軸突微管的生理功能，其微管結(jié)合域由4個重復(fù)單元組成（R1～R4）。早在1963年和1981年，研究人員就找到了2種不同形貌的Tau蛋白的纖維——雙螺旋細(xì)絲形態(tài)（PHF）和直絲形態(tài)（SF）［59-60］，但直到2017年這2種纖維結(jié)構(gòu)才被冷凍電鏡解出（PDB ID：5O3T，5O3L）［13］。從不同的神經(jīng)退行性疾病患者大腦中提取的Tau蛋白纖維空間結(jié)構(gòu)不同，如從皮質(zhì)基底節(jié)變性患者大腦內(nèi)提取的兩種纖維結(jié)構(gòu)（PDB ID：6TJO、6TJX）［61］，不同于從眼頸肌張力障礙病人體內(nèi)提取的兩種纖維結(jié)構(gòu)（PDB ID：7P66、7P67）［62］。這些結(jié)構(gòu)的解析為進(jìn)一步理解蛋白質(zhì)錯誤折疊/纖維化與不同神經(jīng)退行性疾病的關(guān)系提供了新的視角，并為這些疾病的藥物研發(fā)提供了新的線索。

2.2 帕金森病與α-突觸核蛋白

帕金森病是全球第二大神經(jīng)退行性疾病，其病理特征是大腦中主要由αSyn蛋白聚集成的淀粉樣斑塊（路易小體）［63］。αSyn共有140個氨基酸，由N端結(jié)構(gòu)域、纖維核心域（NAC）和C端結(jié)構(gòu)域組成。目前已有多個全長αSyn或其片段的纖維結(jié)構(gòu)被解析出來，其中2016年Tuttle等采用固體核磁共振（ssNMR）方法解析出的全長纖維，2018年采用冷凍電鏡方法，Li、Stahlberg和Ye三個課題組分別解析出了αSyn片段的纖維結(jié)構(gòu)。這4個結(jié)構(gòu)均具有希臘鑰匙（Greek-key）的結(jié)構(gòu)特征，即單體由多段β折疊在空間蛇形排列，它們的PDB ID分別是2N0A［52］、6A6B［64］、6H6B［65］、6CU7［66］。2019年Guerrero-Ferreira等［19］解出了兩個單體結(jié)構(gòu)類似但原纖維間界面不同的αSyn片段纖維結(jié)構(gòu)；2020年Schweighauser等［20］解析了2種從病人體內(nèi)提取的αSyn片段纖維結(jié)構(gòu)。而這4個結(jié)構(gòu)沒有Greek-key的結(jié)構(gòu)特征。除此之外，氨基酸突變、翻譯后修飾等會影響αSyn的分子內(nèi)/間相互作用模式，從而使纖維結(jié)構(gòu)不同于野生型纖維。例如H50Q、G51D、A53T這三個突變均會改變原纖維間的界面，從而改變纖維形貌（PDB ID：6PES［67］、7E0F［68］、6LRQ［69］）。N端截短（如Δ1-40）和磷酸化（如pY39）等翻譯后修飾都會改變纖維的空間結(jié)構(gòu)（PDB ID：7LC9［70］、6L1U［71］）。

2.3 肌萎縮側(cè)索硬化癥與TDP-43蛋白、FUS蛋白

肌萎縮側(cè)索硬化癥（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）也稱漸凍人癥，其病理特征是大腦組織中由多種蛋白聚集形成的不溶性蛋白質(zhì)包涵體，TDP-43和FUS蛋白是其主要成分。TDP-43蛋白由414個氨基酸組成，包括3個結(jié)構(gòu)域：N端結(jié)構(gòu)域、RNA識別結(jié)構(gòu)域和C端低復(fù)雜度結(jié)構(gòu)域（LCD）。其中LCD結(jié)構(gòu)域?qū)DP-43的聚集具有至關(guān)重要的作用，且其單獨也能夠發(fā)生纖維化。近年來LCD區(qū)域多個片段的纖維結(jié)構(gòu)被解出，2019年Cao等［72］通過冷凍電鏡解出了5個長度不同的LCD短肽片段纖維結(jié)構(gòu)，其形貌各不相同（PDB ID：6N37、6N3B、5O3L、5O3T、6GX5）。Guenther等［73］找出了LCD區(qū)域中6個能獨立形成空間拉鏈結(jié)構(gòu)的片段（PDB ID：5WKD、6CEW、6CB9、5WIQ、5WIA、5WHN）。全長LCD纖維結(jié)構(gòu)于2021年被Li等［21］通過冷凍電鏡方法首次解析出來，該纖維（PDB ID：7KWZ）包含一個由139個殘基堆疊而成的纖維核。LCD包含了TDP-43蛋白約90%的病理性突變，大部分突變能夠加速纖維化過程或改變纖維形貌。例如野生型LCD312-317片段能夠形成動態(tài)可逆的纖維，但A315E/T突變會導(dǎo)致固態(tài)不可逆纖維的形成［73］；A315T突變會使LCD286-331片段在體外形成的纖維神經(jīng)毒性增強［74］；G335D突變能促進(jìn)LCD發(fā)生從螺旋到β折疊的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變從而促進(jìn)其聚集［75］。LCD片段及全長LCD纖維結(jié)構(gòu)的成功解析，為進(jìn)一步理解TDP-43蛋白質(zhì)的異常聚集和纖維化奠定了基礎(chǔ)。

FUS蛋白由526個氨基酸組成，它在生物體內(nèi)參與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、RNA代謝和DNA損傷修復(fù)等多種生理功能［76］。FUS蛋白包含兩個結(jié)構(gòu)域：位于N端的低復(fù)雜結(jié)構(gòu)域（LCD）和位于C端的RNA結(jié)合域，其中LCD對FUS蛋白的聚集具有至關(guān)重要的作用。2017年Murray等［22］在大腸桿菌中表達(dá)，并進(jìn)一步得到了FUS全長LCD（氨基酸1～214）的纖維，并通過ssNMR方法解出了其核心片段（FUS37-97）的纖維空間結(jié)構(gòu)；2018年Luo等［77］采用X射線衍射方法解出了FUS37-42與FUS54-59片段的纖維結(jié)構(gòu)（PDB ID：5XSG、5XRR）。這些研究發(fā)現(xiàn)FUS形成的纖維具有熱可逆性（升高溫度纖維溶解，降低溫度纖維重新形成）。2020年Lee等［78］采用冷凍電鏡方法得到了FUS112-150片段的纖維結(jié)構(gòu)（PDB ID：6XFM），其形貌具有U型的特征。最近Sun等［79］采用冷凍電鏡方法，解析出了LCD區(qū)域34-124片段的纖維結(jié)構(gòu)（PDB ID：7VQQ），該纖維片段由具有V型、S型和N型特征的3個區(qū)域組合而成。

TDP-43 LCD片段和FUS LCD片段以及全長TDP-43 LCD纖維結(jié)構(gòu)的成功解析，為進(jìn)一步理解TDP-43、FUS蛋白質(zhì)的異常聚集和纖維化以及肌萎縮側(cè)索硬化癥等疾病的分子機制奠定了基礎(chǔ)。

2.4 多種神經(jīng)退行性疾病相關(guān)蛋白的異質(zhì)相互作用

研究表明，兩種不同神經(jīng)退行性疾病相關(guān)蛋白的錯誤折疊和聚集存在關(guān)聯(lián)。例如，①αSyn和Tau蛋白存在強病理性關(guān)聯(lián)：在患有路易小體癡呆的病人中，編碼αSyn和Tau蛋白的基因（SNCA和MAPT）具有強相關(guān)性［80］；②錯誤折疊的αSyn和Tau蛋白均具有細(xì)胞間傳遞的能力［81］；③在患有阿爾茲海默病、ALS等多種神經(jīng)退行性疾病的患者腦組織中αSyn和Tau蛋白存在共定位［82-83］。研究人員已經(jīng)通過體外實驗深入研究了αSyn和Tau的相互作用模式：如將αSyn加入到Tau蛋白液態(tài)凝聚物中時，αSyn帶負(fù)電的C端能與Tau帶正電的聚脯氨酸結(jié)構(gòu)域P2（198-243殘基）結(jié)合，加速凝聚物向固態(tài)纖維轉(zhuǎn)變（圖2）［84］。Aβ的N端可以與αSyn的N/C端結(jié)構(gòu)域相互作用形成異質(zhì)二聚體［85］。另外，阿爾茨海默病和Prion疾病也存在病理關(guān)聯(lián)［86］，病理學(xué)研究表明Prion蛋白能與阿爾茨海默病患者腦組織中的Aβ淀粉樣蛋白發(fā)生免疫共沉淀現(xiàn)象［87］。淀粉樣纖維的多形性，以及多種蛋白質(zhì)異質(zhì)相互作用的實驗發(fā)現(xiàn)，為神經(jīng)退行性疾病的機理研究和藥物開發(fā)帶來了新的挑戰(zhàn)。

圖2 神經(jīng)退行性疾病相關(guān)的四種蛋白的單體、淀粉樣纖維和共聚集形成的異質(zhì)凝聚體［84-87］Fig.2 Monomer conformations, amyloid fibrils of proteins related to neurodegenerative diseases and their heterogeneous aggregates[84-87]

3 神經(jīng)退行性疾病相關(guān)蛋白構(gòu)象分布、相互作用和病理性聚集微觀機理的模擬研究

雖然實驗研究在纖維結(jié)構(gòu)解析方面取得了重大進(jìn)展，但通常只能得到纖維的靜態(tài)結(jié)構(gòu)，再加上蛋白質(zhì)低聚體構(gòu)象高度動態(tài)變化及其不穩(wěn)定性，因此實驗方法很難識別纖維的最小穩(wěn)定單元、揭示抑制劑分子與纖維相互作用的微觀機理，以及表征聚集早期蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化和低聚體結(jié)構(gòu)特征。隨著蛋白質(zhì)力場的發(fā)展與完善，分子動力學(xué)等計算機模擬方法能夠在原子/分子水平研究蛋白質(zhì)/多肽的聚集過程［88］?；诜肿觿恿W(xué)模擬的軌跡，一方面，計算二級結(jié)構(gòu)含量和分布可以與實驗給出的CD譜、化學(xué)位移結(jié)果對比，而計算氨基酸間距離能與FRET實驗結(jié)果等對比，驗證模擬結(jié)果的可靠性；另一方面，可以實現(xiàn)對纖維熱力學(xué)和動力學(xué)性質(zhì)、蛋白質(zhì)相互作用以及聚集機理的表征。分子動力學(xué)模擬的流程見圖3。

圖3 通過計算模擬研究蛋白質(zhì)相互作用及病理性聚集的流程圖Fig.3 Flow sheet for studying protein interactions and pathological aggregation by computational simulation

3.1 纖維最小穩(wěn)定單元的確定和纖維-抑制劑相互作用的計算模擬

以纖維結(jié)構(gòu)為初始構(gòu)型作分子動力學(xué)模擬可以用來確定纖維最小穩(wěn)定單元，表征纖維熱力學(xué)和動力學(xué)性質(zhì)、纖維內(nèi)部分子間/內(nèi)相互作用以及纖維與溶劑之間相互作用。如針對Aβ42的L-S型纖維結(jié)構(gòu)，全原子分子動力學(xué)模擬發(fā)現(xiàn)四聚體是其最小穩(wěn)定單元［89］；而對于TDP-43288-319片段的纖維結(jié)構(gòu)，模擬表明七聚體是其最小穩(wěn)定單元［90］。針對同種蛋白不同纖維結(jié)構(gòu)的模擬，可以比較它們各自的穩(wěn)定性，給出穩(wěn)定它們空間構(gòu)型的重要物理相互作用類型。例如，Natesh等［91］針對三種Aβ纖維結(jié)構(gòu)（PDB ID：2M4J、2LMN、2LMP）進(jìn)行了分子動力學(xué)模擬，發(fā)現(xiàn)這三種纖維具有不同的穩(wěn)定性，并揭示了穩(wěn)定各自纖維結(jié)構(gòu)的分子間相互作用。另外，針對抑制劑（如小分子、抗體等）抑制纖維化或破壞纖維結(jié)構(gòu)的實驗發(fā)現(xiàn)，研究人員開展了一系列模擬工作，旨在揭示相應(yīng)的抑制和破壞機理，為進(jìn)一步篩選或設(shè)計新型藥物分子提供理論指導(dǎo)。比如利用常規(guī)或增強采樣的分子動力學(xué)模擬，研究了不同分子對Aβ原纖維的破壞機制，發(fā)現(xiàn)：桑黃素破壞鹽橋和氫鍵［92］；辣椒提取物wgx-50通過疏水相互作用［93］、aducanumab抗體通過特異性結(jié)合纖維N端［94］來破壞纖維；手性小分子（+）-Catechin和（-）-Catechin構(gòu)象差異引起空間位阻效應(yīng)的不同，呈現(xiàn)出對Aβ原纖維不同的破壞效果［95］。最近本文作者所在的課題組采用分子動力學(xué)模擬研究了黃芩素對多種不同形貌αSyn纖維的破壞，發(fā)現(xiàn)黃芩素對不同纖維具有不同的破壞效果和機理［96］。這些模擬結(jié)果為相關(guān)疾病藥物的篩選和設(shè)計提供理論指導(dǎo)。

3.2 蛋白質(zhì)寡聚體構(gòu)象分布的模擬研究

模擬蛋白質(zhì)分子的自發(fā)聚集過程和低聚體構(gòu)象分布，是理解蛋白質(zhì)聚集微觀機理的有效手段。限于模擬時間尺度和計算資源，很難從全原子水平直接模擬大量蛋白分子自發(fā)組裝成纖維的過程，目前研究主要側(cè)重于聚集早期低聚體的構(gòu)象分布和蛋白間相互作用模式。

以Aβ及其短肽為例，國內(nèi)外多個課題組分別采用副本交換分子動力學(xué)研究了Aβ40和Aβ42的二聚體構(gòu)象分布，發(fā)現(xiàn)二聚體構(gòu)象結(jié)構(gòu)多樣，既包含無序結(jié)構(gòu)，也包含多種富含β片層的構(gòu)象，并給出了穩(wěn)定二聚體的相互作用類型［97-98］。除了構(gòu)象熱力學(xué)特性，Cao等［99］將分子動力學(xué)模擬與馬爾可夫態(tài)模型結(jié)合，研究了Aβ蛋白二聚化的動力學(xué)過程。與Aβ相比，αSyn、Tau等蛋白的氨基酸序列較長，現(xiàn)有工作大都針對它們的重要片段進(jìn)行研究。例如，Yamauchi等［100］通過增強采樣方法給出了NAC核心短肽片段68GAVVTGVTAVA78二聚體的構(gòu)象分布；Yoon等［101］采用常規(guī)分子動力學(xué)模擬揭示了短肽71VTGVTAVAQKTV82四聚體的自發(fā)組裝過程。微管結(jié)合域是Tau蛋白纖維化的關(guān)鍵區(qū)域。Ganguly等［102］通過副本交換方法揭示了位于微管結(jié)合域的R2和R3片段形成的同源和異源二聚體的分子間相互作用模式和構(gòu)象分布。最近，我們針對R3片段二聚體和肝素的混合物開展了副本交換分子動力學(xué)模擬，結(jié)果表明肝素能增強PHF6片段（306VQIVYK311）之間疏水、芳香堆積相互作用，從而促進(jìn)R3的自聚集［103］。

3.3 機器學(xué)習(xí)方法結(jié)合分子動力學(xué)模擬實現(xiàn)對蛋白構(gòu)象的高效采樣

近年來，隨著蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫的不斷增大，以及計算機算力的提升，機器學(xué)習(xí)方法也開始被用于研究神經(jīng)退行性疾病相關(guān)蛋白的構(gòu)象特性。例如周煥祥課題組［104］以聚谷氨酰胺Q15、Aβ40和細(xì)胞壁水解酶ChiZ三種天然無序蛋白為研究對象，根據(jù)短時間分子動力學(xué)模擬得到的構(gòu)象，利用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和自編碼器方法生成更加完整的構(gòu)象空間，其預(yù)測結(jié)果得到了長時間分子模擬結(jié)果的驗證［104］。Jin等［105］結(jié)合分子動力學(xué)模擬、主成分分析和機器學(xué)習(xí)方法預(yù)測了聚丙氨酸Ala13和鈣調(diào)蛋白在原訓(xùn)練集中不存在的合理構(gòu)象。這些工作為進(jìn)一步利用機器學(xué)習(xí)方法實現(xiàn)蛋白質(zhì)（尤其是無序蛋白）構(gòu)象空間高效采樣邁出了重要一步。

4 神經(jīng)退行性疾病相關(guān)蛋白液液相分離的研究進(jìn)展

蛋白質(zhì)除了能夠聚集形成固態(tài)病理性纖維外，還能發(fā)生液液相分離形成液態(tài)凝聚物。生物分子的液液相分離是細(xì)胞核仁、應(yīng)激顆粒等多種無膜細(xì)胞器形成的主要驅(qū)動力，具有重要生物學(xué)意義。2009年，Brangwynne等［106］發(fā)現(xiàn)重要細(xì)胞器P顆粒具有流動、融合、熒光恢復(fù)等液態(tài)性質(zhì)。2012年Li等［107］和Kato等［108］分別在體外實驗中觀察到了蛋白質(zhì)和RNA通過液液相分離形成的小液滴。之后，該領(lǐng)域迎來了爆發(fā)式發(fā)展，越來越多的蛋白被發(fā)現(xiàn)具有相分離能力。此外，蛋白質(zhì)相分離的生理功能被不斷發(fā)現(xiàn)，例如適應(yīng)性和先天性免疫信號傳導(dǎo)、應(yīng)激顆粒組裝、異染色質(zhì)形成和轉(zhuǎn)錄等［109］。除此之外，越來越多的研究表明，神經(jīng)退行性疾病相關(guān)蛋白（如αSyn、TDP-43、Tau等）具有較強的液液相分離能力，且它們的液態(tài)凝聚物會在病理條件下發(fā)生液固相變，形成有細(xì)胞毒性的固態(tài)淀粉樣纖維。蛋白質(zhì)的液液相分離及其與病理性聚集的關(guān)系已成為當(dāng)今物理學(xué)和生命科學(xué)等交叉領(lǐng)域的研究前沿和熱點。圖4給出了幾種無膜細(xì)胞器及幾種典型蛋白形成的小液滴的形貌。

圖4 無膜細(xì)胞器與蛋白質(zhì)通過液液相分離形成的小液滴［4-6，9，106，110-115］Fig.4 Membrane-free organelles and liquid droplets formed by liquid-liquid phase separation of proteins[4-6,9,106,110-115]

4.1 研究蛋白質(zhì)液液相分離的實驗方法

判斷蛋白質(zhì)溶液發(fā)生相分離的常見實驗方法包括濁度（turbidity）試驗和微分干涉差（differential interference contrast， DIC）顯微鏡。濁度可以用于表征蛋白分子形成凝聚物的能力，而DIC常用于觀察蛋白質(zhì)相分離形成的小液滴形貌。在這些實驗中，通常需要添加例如聚蔗糖（ficoll）、聚乙二醇（PEG）、葡聚糖（dextran）等聚合物作為擁擠劑，以模擬細(xì)胞中的擁擠環(huán)境［116］。濁度和顯微實驗操作簡單，可以實現(xiàn)高通量篩選特定蛋白發(fā)生液液相分離的環(huán)境條件。例如，劉聰課題組［117］建立了一種高通量篩選蛋白質(zhì)相分離能力的方法（HiPPS），并系統(tǒng)研究了溶液環(huán)境對30多種蛋白質(zhì)相分離能力的影響。TEM、AFM等方法不僅能用于觀察小液滴形貌，還能在納米尺度精確測量其尺寸。隨著共聚焦顯微（confocal microscopy）和超分辨率成像（super-resolution imaging）技術(shù)的不斷發(fā)展，可以直接觀察細(xì)胞中形成的蛋白質(zhì)凝聚物的位置和形貌，例如hnRNPA1［118］、C9orf72編碼的二肽重復(fù)片段（PR20、GR20）［119］、FUS［115］、Tau［120］、TDP-43［121-122］、αSyn［123］等。值得注意的是，上述方法要求冷凝物中的蛋白質(zhì)必須先經(jīng)過抗體染色或熒光標(biāo)記。

表征蛋白質(zhì)液態(tài)凝聚物的物化性質(zhì)（包括黏度、表面張力、流動性、密度、蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)等），對理解蛋白質(zhì)液液相分離的物理機制具有重要意義。在體外實驗中，確定聚集體物態(tài)性質(zhì)的最直接的途徑是測量小液滴的黏度和表面張力［124］。光成像的技術(shù)可以用來表征凝聚物流動性的強弱，例如光漂白熒光損失實驗（fluorescence loss in photobleaching， FLIP）、光漂白熒光恢復(fù)實驗（fluorescence recovering after photobleaching，F(xiàn)RAP）、熒光關(guān)聯(lián)光譜（fluorescence correlation spectroscopy， FCS）等［10］。其中最常用的是FRAP實驗［125］，它已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于區(qū)分蛋白質(zhì)聚集形成的液態(tài)和固態(tài)聚集體，以及表征小液滴的成熟（即由液態(tài)向固態(tài)轉(zhuǎn)變）過程［109，126］。FRET方法常用來表征蛋白質(zhì)發(fā)生相分離過程中的構(gòu)象變化；ThT熒光和CD譜用來研究蛋白質(zhì)在發(fā)生相分離過程中二級結(jié)構(gòu)的變化。此外，拉曼光譜［127-128］也被用于表征蛋白質(zhì)在發(fā)生相分離前后的構(gòu)象轉(zhuǎn)變。

4.2 神經(jīng)退行性疾病相關(guān)蛋白液液相分離的實驗研究

多種神經(jīng)退行性疾病相關(guān)蛋白既能發(fā)生病理性聚集形成固態(tài)淀粉樣纖維，也能發(fā)生液液相分離形成液態(tài)凝聚物。例如αSyn、TDP-43和Tau蛋白均同時具有纖維化和相分離能力。生理條件下αSyn蛋白以富含螺旋的單體形式與神經(jīng)囊泡結(jié)合，參與囊泡形狀調(diào)節(jié)、神經(jīng)遞質(zhì)釋放、化學(xué)信號傳遞等生理功能；在病理情況下它會發(fā)生異常聚集，形成具有毒性的寡聚體或纖維。2020年Ray等［5］首次在體外實驗中觀察到了αSyn形成的小液滴，并發(fā)現(xiàn)液滴流動性隨時間逐漸降低，最終轉(zhuǎn)變成固態(tài)聚集體。同年，Hardenberg等［123］在細(xì)胞實驗和試管實驗中分別觀察到了αSyn的液態(tài)凝聚物及其進(jìn)一步轉(zhuǎn)變成的凝膠狀聚集體。上述結(jié)果表明αSyn不僅能發(fā)生液液相分離，且其相分離與聚集密切相關(guān)。進(jìn)一步研究表明，pH值、鹽濃度、擁擠劑等微環(huán)境［129］，乙?；?29］和截短［130］等翻譯后修飾，黃酮類小分子［131］等均能調(diào)控αSyn的相分離。

2015年Molliex等［9］通過添加類泛素蛋白修飾分子標(biāo)記（SUMO）降低蛋白質(zhì)溶解度的方法，首次觀察到了全長TDP-43蛋白的相分離。2016年，Conicella等［6］觀察到了TDP-43 LCD區(qū)域的相分離，并發(fā)現(xiàn)位于321～340區(qū)域的6個ALS突變對LCD相分離能力具有破壞作用。黃介嶸課題組［132］利用NMR和光學(xué)顯微技術(shù)研究了G298S等三個ALS相關(guān)突變體的相分離能力，提出疏水相互作用驅(qū)動LCD的相分離。吝易等［133］的研究表明該區(qū)域只在酸性條件下才有較高的螺旋傾向性，而在中性或堿性條件（pH>6.5）下螺旋傾向性降低，β傾向性升高［133］。最近，McKnight課題組［134］將位于316～339的螺旋區(qū)域、能形成側(cè)鏈氫鍵的氨基酸分別突變成甘氨酸，系統(tǒng)研究了23種突變對TDP-43 LCD相分離能力的影響，發(fā)現(xiàn)只有P320G突變能夠完全抑制LCD的相分離。除突變外，翻譯后修飾也能調(diào)控TDP-43的相分離，如C端磷酸化能增加TDP-43小液滴的流動性、抑制其纖維化［135］。

2017年Ambadipudi等［15］首次在試管實驗中觀察到Tau蛋白微管結(jié)合域的液態(tài)凝聚物，并發(fā)現(xiàn)磷酸化能增強其相分離能力；2018年，Wegmann等［8］首次觀察到了帶GFP標(biāo)記的全長Tau蛋白形成的小液滴，該液滴隨時間失去流動性，轉(zhuǎn)變?yōu)楣虘B(tài)聚集體。2020年，Zhang等［136］在體外細(xì)胞實驗中觀察到了全長Tau蛋白的液態(tài)凝聚物。除此之外，研究人員還通過多種實驗手段研究了Tau蛋白相分離的微觀機制。Ambadipudi等［137］通過NMR實驗找到了對Tau微管結(jié)合域K18相分離重要的3個六肽片段和4個KXGS片段。Boyko等［138］通過研究多個Tau蛋白截短體的相分離能力，提出Tau蛋白的相分離主要由N端負(fù)電荷與C端正電荷之間的靜電吸引所驅(qū)使；Majumdar等［139］測量了K18溶液在相分離不同階段的熒光光譜，發(fā)現(xiàn)K18單體在凝聚相中比在溶液中具有更伸展的構(gòu)型，由此提出，單體構(gòu)象的轉(zhuǎn)變以及單體-水相互作用的增強是K18相分離的驅(qū)動力之一。氨基酸突變能影響Tau的相分離：K274Q突變能顯著降低Tau蛋白相分離的臨界濃度［140］；雖然疾病相關(guān)突變體P301L、G272V、ΔK280對Tau的相分離能力沒有顯著影響，卻能加速液-固相變［141］。

2015年P(guān)atel等［142］通過體外重組實驗發(fā)現(xiàn)，全長FUS蛋白能夠通過液液相分離形成小液滴，且這些液滴隨時間會發(fā)生液固相變形成固態(tài)聚集體。Kang等［143］通過DIC方法發(fā)現(xiàn)LCD區(qū)域單獨也可以發(fā)生相分離，對FUS相分離的發(fā)生具有驅(qū)動作用。Avni等［128］采用一種基于拉曼散射光譜的高靈敏單液滴振動方法，表征了FUS蛋白液滴內(nèi)部的分子間相互作用，并提出陽離子-π與π-π相互作用對FUS的液液相分離起到重要作用。磷酸化、甲基化等翻譯后修飾可以調(diào)控FUS的相分離，其效果與翻譯后修飾位點有關(guān)。例如FUS LCD區(qū)域中四個絲氨酸（Ser26、Ser42、Ser61和Ser84）各自的磷酸化均能抑制LCD的液液相分離［144］；位于纖維核心片段（37~97）上的絲氨酸或蘇氨酸磷酸化能顯著抑制液滴的形成［22］；而Y526氨基酸的磷酸化卻能促進(jìn)FUS在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的相分離［145］。體外試驗發(fā)現(xiàn)精氨酸的甲基化修飾可以抑制FUS的液液相分離［115］。此外，鹽離子和RNA也可以調(diào)節(jié)FUS LCD的相分離能力［146］。

一種蛋白的液液相分離會受到另一種蛋白或RNA的調(diào)控。例如αSyn能分別與TDP-43、Tau蛋白發(fā)生相互作用從而調(diào)節(jié)后者的相行為：αSyn能促使TDP-43 LCD與RNA共同形成的小液滴發(fā)生液固相轉(zhuǎn)變，且形成的纖維相較于TDP-43單獨形成的纖維具有更強的病理毒性［147］；αSyn也能夠調(diào)控Tau凝聚物的液固相變［148］。顆粒體蛋白（granulin）也能調(diào)控TDP-43 LCD的相分離，其效果依賴于顆粒體蛋白的種類［149］。Lin等［150］發(fā)現(xiàn)RNA能促進(jìn)hnRNPA1、FUS等固有無序蛋白的液液相分離。Maharana等［151］發(fā)現(xiàn)RNA在低和高濃度下分別能促進(jìn)和抑制TDP-43/FUS蛋白的相分離。進(jìn)一步的研究還表明RNA與TDP-43的特異性結(jié)合能抑制TDP-43凝聚體的液-固相變［121，152］。

4.3 研究蛋白質(zhì)液液相分離的理論和計算研究

隨著蛋白質(zhì)相分離的實驗報道不斷涌現(xiàn)，國內(nèi)外多個課題組開始用理論和計算手段闡釋其背后的物理機制，但該領(lǐng)域仍處于起步階段。由于相分離現(xiàn)象涉及大量蛋白分子，體系巨大，目前大都采用連續(xù)場近似或高度簡化的粗?；Ｐ停@些方法能定性給出相圖，幫助理解相分離的熱力學(xué)特性，但缺乏對凝聚物內(nèi)部分子結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)、物理相互作用的精確描述。僅有少量工作嘗試采用全原子分子模擬，從單體構(gòu)象分布的角度來研究相分離的微觀機制。

4.3.1 基于平均場的理論和計算研究

Flory-Huggins理論是高分子物理中研究聚合物相分離的理論模型之一。Overbeek和Voorn［153］在該理論的基礎(chǔ)上引入靜電項，實現(xiàn)對帶電聚合物相圖的計算。該方法被用于蛋白質(zhì)相分離的研究，首次給出了Ddx4蛋白N端區(qū)域的相圖，并提出驅(qū)使其相分離的主要相互作用是靜電作用［154］。Chan課題組［155］在上述平均場理論的基礎(chǔ)上引入隨機項近似，發(fā)現(xiàn)電荷分布模式能影響蛋白的相分離能力［圖5（a）］。結(jié)合平均場理論描述的體系能量函數(shù)和體系密度分布的時間演化方程進(jìn)行模擬采樣（即場理論模擬），可以獲得蛋白體系的相圖［圖5（b）］［156-157］。

圖5 研究蛋白質(zhì)液液相分離的相關(guān)計算模擬方法［155，157，159，171，175-176］Fig.5 Computational methods for studying protein liquid-liquid phase separation[155,157,159,171,175-176]

4.3.2 粗粒化分子模擬研究

粗?；Ｐ统１挥脕碇苯幽M蛋白的相行為。目前最常用的是Mittal課題組［158-159］開發(fā)的基于長條形模擬盒子的方法——slab模擬（slab simulation）［圖5（c）］。該方法將蛋白質(zhì)簡化為由彈簧勢相連的粗粒小球鏈，每個小球代表一個氨基酸，采用氨基酸疏水性指數(shù)（hydrophobic-scale， HPS）［160］或Kim-Hummer勢函數(shù)［161］來描述小球間的范德華相互作用，采用Debye-Hückel勢函數(shù)來描述靜電相互作用。slab模擬主要優(yōu)點是可以方便地計算高、低密度相的密度。Mittal課題組用這一方法研究了多種蛋白的相分離，例如FUS蛋白LCD域［162］、TDP-43蛋白LCD區(qū)域及多個突變體［163］、LAF-1蛋白RGG結(jié)構(gòu)域［164］等，并系統(tǒng)研究了35種無序蛋白相分離能力的溫度依賴性，區(qū)分了具有上/下臨界溶解溫度（UCST/LCST）相分離行為的蛋白，發(fā)現(xiàn)它們具有不同的氨基酸組成特征［158］。之后，多個課題組采用slab模擬方法，或?qū)ζ鋭莺瘮?shù)及參數(shù)作修正，研究了LAF-1、Ddx4、hnRNA1等蛋白的相分離行為［165-169］。也有課題組借用此粗?；鞍踪|(zhì)模型，在立方盒子中模擬蛋白質(zhì)的相分離［170］，但由于計算兩相密度存在困難，通常無法給出相圖。另一種研究蛋白質(zhì)液液相分離并計算相圖的方法是周煥祥課題組［171］開發(fā)的基于Gibbs系綜的模擬方法［圖5（d）］。該方法采用蒙特卡洛方法同時模擬處于兩個獨立盒子（具有不同初始密度）中的蛋白質(zhì)，在模擬過程中允許盒子間粒子交換，直到達(dá)到穩(wěn)定共存的兩相，他們用該方法研究了RNA調(diào)控蛋白質(zhì)液液相分離的微觀機理［171］，區(qū)分了三種對蛋白質(zhì)相分離具有不同影響的調(diào)控因子（regulator）［172］。

上述模擬方法雖然能研究蛋白質(zhì)的兩相共存狀態(tài)，并給出相圖，但其模型過于簡化，無法精確描述對相分離重要的物理相互作用（比如π堆積相互作用等），以及溶劑對相行為的影響?；趯蝹€氨基酸簡化為多個小球的粗粒化蛋白模型和顯式溶劑模型相結(jié)合的方法，Hummer課題組［173］采用修正的Martini 2.2力場研究了FUS蛋白LCD區(qū)域的相分離，計算得到了凝聚相的表面張力和剪切黏度［173］；Marrink課題組［174］采用Martini 3.0力場模擬了鏈長為30的聚賴氨酸和聚谷氨酰胺的相分離，并給出了鹽離子和RNA對它們相分離能力的影響。本課題組基于Martini 2.2力場，開發(fā)了一套能精準(zhǔn)計算兩相密度、表征蛋白質(zhì)聚集體流動性的計算方法，并系統(tǒng)研究了所有400種二肽的聚集和相分離能力，給出它們的液液相分離傾向性評分（LLPS score），其中對4種典型二肽（QW、GF、WW、VI）相分離能力的預(yù)測得到了實驗驗證，此外，模擬還給出了QW液液相分離的相圖［圖5（e）］［175］。

4.3.3 全原子分子模擬研究

雖然粗粒化模擬已被廣泛應(yīng)用于研究蛋白質(zhì)和短肽的相分離能力和相行為，但不能描述對相分離過程具有重要作用的蛋白構(gòu)象特征。全原子模型可以精確表征蛋白的構(gòu)象分布、二級結(jié)構(gòu)特性，預(yù)測對相分離重要的物理相互作用。本課題組［176］通過對Tau蛋白K18單體進(jìn)行全原子副本交換分子動力學(xué)模擬，發(fā)現(xiàn)K18單體的構(gòu)象特征和物理特性（例如單體塌縮度、二級結(jié)構(gòu)含量和相互作用強度）具有非線性的溫度依賴關(guān)系，與其相分離行為的溫度依賴性一致，表明該蛋白質(zhì)的液液相分離能力編碼在其單體構(gòu)象中，從而為用全原子模型研究蛋白質(zhì)的相分離行為提供了一種新的思路和方法。通過計算蛋白質(zhì)不同區(qū)域二級結(jié)構(gòu)含量的溫度依賴關(guān)系，從K18中找出了對液液相分離和纖維化重要的六肽片段，并得到實驗驗證［圖5（f）］。Zheng等［177］通過將粗粒化分子模擬得到的蛋白質(zhì)高密度相還原成全原子模型，表征了液滴中氫鍵、鹽橋等物理相互作用。

4.3.4 蛋白質(zhì)液液相分離數(shù)據(jù)庫和機器學(xué)習(xí)預(yù)測方法

目前已有多個蛋白質(zhì)相分離相關(guān)的數(shù)據(jù)庫被構(gòu)建，例如，DrLLPS儲存了在真核細(xì)胞內(nèi)與相分離有關(guān)的43萬多個蛋白質(zhì)，并將它們分為scaffold、regulator、client三類［178］；LLPSDB［179］和PhaSepDB［180］儲存了文獻(xiàn)中報道的具有相分離能力的蛋白質(zhì)序列及相分離實驗條件等信息；MloDisDB儲存了無膜細(xì)胞器及與它們相關(guān)的疾病［181］。Chu等［182］基于LLPSDB給出蛋白質(zhì)信息，測試了采用支持向量機（SVM）、決策樹（DT）、K近鄰（KNN）、梯度提升決策樹（GBDT）等機器學(xué)習(xí)方法，以及詞向量（w2v）等蛋白質(zhì)序列編碼方法，根據(jù)蛋白質(zhì)序列預(yù)測其相分離能力，發(fā)現(xiàn)采用GBDT和w2v方法預(yù)測準(zhǔn)確度最高，并用這兩種方法開發(fā)了PSPredictor預(yù)測工具。van Mierlo等［183］提出一種相分離分析和預(yù)測機器學(xué)習(xí)分類器PSAP，成功預(yù)測了DAZAP1、CPEB3等新的具有相分離能力的蛋白。這些數(shù)據(jù)庫和相分離能力預(yù)測工具，為預(yù)測新型蛋白質(zhì)的相分離能力提供了一種簡易方便的手段。

5 總結(jié)與展望

本文簡要介紹了表征蛋白質(zhì)聚集過程、聚集體形貌、相分離能力的實驗和模擬方法，以及多種典型的神經(jīng)退行性疾病相關(guān)蛋白聚集和相分離的研究進(jìn)展，并簡述了機器學(xué)習(xí)方法在蛋白質(zhì)構(gòu)象空間和相分離能力預(yù)測方面的應(yīng)用。蛋白質(zhì)的可逆液液相分離具有重要生理功能，而不可逆的液固相轉(zhuǎn)變卻能導(dǎo)致疾病，蛋白質(zhì)液液相分離和液固相變微觀機制的闡釋對深入理解神經(jīng)退行性疾病的致病機理具有重要理論意義，同時也是開發(fā)具有潛在治療效果的新型藥物的前提和分子基礎(chǔ)。盡管目前已經(jīng)有大量蛋白質(zhì)聚集和液液相分離的實驗研究，但相關(guān)的模擬研究工作還相對較少，人們對蛋白質(zhì)共聚集和液液相分離的微觀機理、液液相分離與病理性聚集關(guān)聯(lián)的理解還非常有限。表征凝聚體內(nèi)部蛋白質(zhì)的構(gòu)象特征及其關(guān)鍵物理相互作用、液固相變的動力學(xué)和熱力學(xué)特征，對計算模擬和實驗都是一個很大的挑戰(zhàn)。實驗手段和模擬方法相結(jié)合來深入、全面地揭示蛋白質(zhì)相分離和聚集背后的分子機制，是該領(lǐng)域未來重要的研究方向。微觀機制的闡釋對深入理解神經(jīng)退行性疾病的致病機理、開發(fā)具有潛在治療效果的新型藥物有重要理論意義和應(yīng)用價值。