黃帚橐吾乙醇提取物對黏蟲毒力及其解毒酶系活性的影響

李晶 李娜 付麟雲(yún) 劉錦霞 丁品 張建軍 武建榮 王萍

摘要：黏蟲（Mythimna separata）是典型的雜食性遷飛性農(nóng)業(yè)害蟲，每年都給我國的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成極大的經(jīng)濟損失。測定黃帚橐吾（Ligularia virgaurea）乙醇提取物對黏蟲幼蟲的毒力，并從細胞色素P450（CYP450）、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GST）、羧酸酯酶（CarE）、酸性磷酸酯酶（ACP）和堿性磷酸酯酶（ALP）等解毒酶系活性的角度研究黏蟲幼蟲對該藥物的生理生化響應。結(jié)果表明，黃帚橐吾乙醇提取物對黏蟲幼蟲有較強的生物活性，LC₅₀為3.655 mg/mL；CYP450活性在前8 h略有上升，12 h后顯著降低（P<0.05）；GST活性在4 h時被顯著激活，隨后受到極顯著抑制（P<0.01）；3種酯酶活性整體表現(xiàn)出逐漸降低的趨勢。上述酶活性變化表明CYP450和GST可能參與了黏蟲對黃帚橐吾提取物的代謝過程，但其最終被顯著抑制的結(jié)果提示黃帚橐吾源農(nóng)藥較難使黏蟲產(chǎn)生抗藥性，具備被開發(fā)成為新型生物農(nóng)藥的潛力。

關鍵詞：黃帚橐吾；生物農(nóng)藥；黏蟲；代謝酶活性；抗藥性；毒力

中圖分類號：S476文獻標志碼：A文章編號：1003-935X（2023）01-0011-07

Effect of Ethanol Extract from Ligularia virgaurea on Toxicity and Activity of Detoxifying Enzymes of Mythimna separata

LI Jing¹， LI Na¹， FU Lin-yun¹， LIU Jin-xia¹， DING Pin¹， ZHANG Jian-jun¹， WU Jian-rong¹， WANG Ping²

（ 1.Institute of Biology，Gansu Academy of Sciences，Lanzhou 730000，China； 2.The Public Welfare Forest Office of Minqin County，Gansu Province，Minqin 733399，China）

Abstract：Mythimna separata is a typical omnivorous migratory agricultural pest，which causes great economic losses to China's agricultural production every year. We determined the toxicity of ethanol extract of Ligularia virgaurea to M. separata larvae，and studied the physiological responses by measuring detoxifying enzyme activity such as cytochrome P450 （CYP450），glutathione-S-transferase （GST），carboxylesterase （CarE），acid phosphatase （ACP） and alkaline phosphatase （ALP）. The results showed that the ethanol extract from L. virgaurea had a strong bioactivity against M. separata larvae，with LC₅₀of 3.655 mg/mL. The activity of CYP450 increased slightly in the previous 8 hours and then decreased in the next 12 hours（P<0.05）.The activity of GST was significantly activated at 4 hours and then significantly inhibited （P<0.01）. And the activities of 3 kinds of esterase showed a trend of gradual decrease.

收稿日期：2022-08-08

基金項目：甘肅省科學院應用研究與開發(fā)項目（編號：2019JK-10）。

作者簡介：李 晶（1983—），女，碩士，副研究員，研究方向為生物農(nóng)藥研發(fā)。E-mail：eyre326@163.com。

通信作者：劉錦霞，研究員，研究方向為生物農(nóng)藥產(chǎn)品研發(fā)及農(nóng)業(yè)綠色病蟲害防控技術研究。E-mail：liujinx0168@163.com。

All of these results indicated that CYP450 and GST may be involved in the metabolism，but the inhibition indicated that extract from L. virgaurea was difficult to induce resistance of M. separata larvae. Therefore，the extract from L. virgaurea had the potential to be developed as a new biopesticide.

Key words：biopesticide；Mythimna separate；activity of metabolic enzyme；herbicide resistance；toxicity

黏蟲（Mythimna separata）是典型的遠距離遷飛性鱗翅目農(nóng)業(yè)害蟲^［1］，可危害16科104余種植物，尤其喜食小麥、玉米、高粱、水稻等禾本科植物，因其雜食性、遷移性、間歇暴發(fā)性，給我國及世界農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成了嚴重的經(jīng)濟損失。目前，黏蟲仍以化學藥劑防治為主^［2］。由于化學殺蟲劑的連續(xù)使用，黏蟲對擬除蟲菊酯類等化學殺蟲劑已產(chǎn)生較嚴重的抗藥性^［3］，防效降低，且施藥次數(shù)和用藥量增多，增加了防治成本，造成環(huán)境污染和食品安全性降低。因此，施用生物農(nóng)藥等綠色防控技術成為黏蟲防治的研究熱點^［4］。

黃帚橐吾（Ligularia virgaurea）為菊科橐吾屬多年生草本植物^［5］，在我國青藏高原東緣有所分布，尤其是在高寒退化草場，因過度放牧等干擾因素的影響，黃帚橐吾逐漸擴張成為優(yōu)勢種而被稱為“退化指示種”^［6］。一些化學藥劑能夠發(fā)揮清除草原毒雜草的作用^［7-8］，但同時會威脅其他牧草的安全^［9］，且其殘留成分的累積效應^［10］，將對整個草場生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生潛在威脅。近年來，關于黃帚橐吾利用價值開發(fā)的報道越來越多：黃帚橐吾莖葉甲醇提取物對菜粉蝶幼蟲有較強的拒食和觸殺作用^［11］，對水稻紋枯病病菌和玉米大斑病病菌也有較強的抑制作用^［12］。筆者所在團隊的研究顯示，黃帚橐吾乙醇提取物對保護地辣椒4種常見的真菌性病原菌及其所致病害有較好的抑菌及防治效果，防效可達75%以上^［13］；對棉鈴蟲有很強的農(nóng)藥生物活性，主要表現(xiàn)為對受試害蟲較強的胃毒和拒食作用^［14］。開發(fā)黃帚橐吾的綜合利用價值，對于該草原毒雜草的綜合治理有著積極的作用。

植物源化合物作用于昆蟲后，會通過影響昆蟲體內(nèi)不同關鍵酶的活性，從而對昆蟲取食行為、生長發(fā)育或繁殖產(chǎn)生不利影響，甚至對其產(chǎn)生直接毒殺作用^［15-16］。經(jīng)過長期進化，昆蟲通過解毒代謝來分解植物源化合物以減輕其危害^［17］或者通過昆蟲腸道、脂肪體等合成和分泌細胞色素P450（cytochrome P450，CYP450）、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（glutathione S-transferase，GST）、羧酸酯酶（carboxylesterase，CarE）^［18］等眾多解毒酶來代謝有害化合物^［19］。昆蟲體內(nèi)解毒酶的變化可以指示植物源化合物的毒害作用以及昆蟲對毒害的適應，能夠反映植物源化合物與昆蟲的互作機制^［20］。

本研究測定了黃帚橐吾乙醇提取物對黏蟲幼蟲的室內(nèi)毒力以及黏蟲經(jīng)藥物處理后體內(nèi)關鍵解毒酶系的變化，以期明確黃帚橐吾乙醇提取物對黏蟲的生物活性和解毒酶對此的響應，旨在為黏蟲生物防控農(nóng)藥的進一步研發(fā)提供理論依據(jù)，為開發(fā)黃帚橐吾的綜合利用價值奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

黏蟲卵由吉林省農(nóng)業(yè)科學院提供，孵化條件：25～30 ℃，相對濕度60%～70%。孵化后，人工飼養(yǎng)至2～3齡備用。

提取物制備及藥液配制：2021年7—8月于甘肅省甘南藏族自治州退化草場采集黃帚橐吾地上植株。將所采材料清洗干凈，并充分陰干，用粉碎機粉碎。采用冷浸法進行提?。簩⒅仓旮刹牧吓c90%乙醇按照體積比1 ∶10混勻浸泡，每隔12 h翻攪混勻1次，浸泡72 h后，將浸出液用16層紗布濾出。如此反復操作3次。浸出液用2層中速濾紙抽濾后減壓蒸餾，條件為30～35 ℃，0.075～0.080 MPa，最終得到褐色有特異氣味的浸膏。

測定酶活性的酶聯(lián)免疫試劑盒均購自上海優(yōu)選生物科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 藥液配制 將吐溫-80作為助溶劑，與浸膏按照0.1 mL/g的比例混勻，再用水配制成200、10.0、5.0、2.5、1.0 mg/mL的藥液，對照為吐溫-80水溶液，濃度相當于最高濃度藥液所加量。

1.2.2 試蟲室內(nèi)毒力測定 采用浸葉法對黏蟲進行室內(nèi)毒力的測定。選取葉寬、葉色等指標基本一致且完整的玉米葉片洗凈晾干后制成1 cm長的小段，浸入不同濃度的藥液中5 s，取出晾干后，取1段放置在墊有潮濕濾紙的培養(yǎng)皿中。選取大小和活力基本一致、經(jīng)8 h饑餓處理的2～3齡黏蟲幼蟲各15頭，放在相同濃度藥液處理的葉碟上，每個葉碟1頭蟲，每組處理重復3次。對照組喂食經(jīng)對照溶液處理的葉片。48 h后調(diào)查死亡蟲數(shù)，計算半致死濃度（LC₅₀）。

1.2.3 酶液制備 按照LC₅₀配制好藥液，將寬度、葉色等指標基本一致且完整的玉米葉片剪成等長小段，浸入藥液5 s，取出晾干。將人工飼養(yǎng)至2～3齡的黏蟲幼蟲進行12 h饑餓處理，然后用處理好的葉片喂養(yǎng)試蟲，分別于處理后2、4、8、12、24、48 h隨機取10頭幼蟲，投入液氮速凍。隨后用0.01 mol/L磷酸緩沖液研磨，3 000 r/min、4 ℃ 離心20 min，取上清，-80 ℃冷凍備用。

1.2.4 解毒酶活性測定 細胞色素P450（CYP450）、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GST）、羧酸酯酶（CarE）、酸性磷酸酯酶（ACP）和堿性磷酸酯酶（ALP）的活性按照試劑盒中的檢測方法進行測定，最終反應液于450 nm處測定吸光度并計算酶活性。蛋白含量按照BCA試劑盒中的檢測方法進行測定，最終反應液于562 nm處測定吸光度并計算。酶活性計算公式如下：

式中：C_U表示測定管酶活性濃度，U/mL；V_U表示酶活性待測液體積，mL；N表示稀釋倍數(shù)（5倍）；C_P表示測定管蛋白質(zhì)濃度，μg/mL；V_P表示蛋白待測液體積，mL。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 22.0軟件對所測數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，用平均值和標準誤表示測定結(jié)果，用One-Way ANOVA中的Duncan's新復極差法對植物提取物不同濃度間的數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，并進行多重比較；用One-Way ANOVA中的LSD法分析不同處理時間下的酶活數(shù)據(jù)差異；用Regression中的Probit計算LC₅₀；采用Excel 2019制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃帚橐吾乙醇提取物對黏蟲幼蟲的毒力

黃帚橐吾乙醇提取物對黏蟲幼蟲具有較強的毒力，其大小與藥物濃度呈正相關（表1）。藥物濃度為20.0 mg/mL時，試蟲校正死亡率達到9762%，與其余濃度處理的試蟲校正死亡率相比具有極顯著差異；隨著藥物濃度的降低，校正死亡率也逐漸下降。黃帚橐吾乙醇提取物對黏蟲幼蟲的LC₅₀為3.655 mg/mL。

2.2 黃帚橐吾乙醇提取物對黏蟲幼蟲體內(nèi)解毒酶系活性的影響

2.2.1 細胞色素P450活性

經(jīng)提取物處理4 h時，黏蟲幼蟲體內(nèi)的細胞色素P450（CYP450）活性呈現(xiàn)被激活的趨勢（圖1），但僅略微上升，且與對照相比未表現(xiàn)出顯著差異。隨即CYP450活性迅速下降，雖有波動，但整體表現(xiàn)為被顯著抑制（P<0.05）的狀態(tài)，在12、24、48 h時，酶活性分別下降了41.8%、18.3%、73.8%。

2.2.2 谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶活性

黃帚橐吾乙醇提取物對黏蟲幼蟲的GST活性表現(xiàn)出抑制-激活-抑制的作用（圖2）。用藥2 h時，GST活性被極顯著（P<0.01）抑制；用藥4 h時，GST活性表現(xiàn)為極顯著（P<0.01）激活，活性增長了18.2%；隨后GST活性受到較強抑制，至用藥48 h時，提取物使GST的活性降低了77.0%。

2.2.3 羧酸酯酶活性

經(jīng)藥物處理后，黏蟲幼蟲的CarE活性迅速被抑制，用藥2、4 h時，酶活性分別降低了25.2%和25.9%，與未處理試蟲的CarE活性差異極顯著（P<0.01）。用藥8 h及12 h時，CarE活性回升至對照水平，但未表現(xiàn)出激活效應，24 h和48 h酶活性急劇降低了42.6%和65.0%（圖3）。

2.2.4 酸性磷酸酯酶活性

藥物處理2 h，黏蟲幼蟲的ACP活力下降，與對照相比表現(xiàn)出極顯著（P<0.01）差異；4 h和8 h時，ACP活性均在較低水平波動。至12 h時，ACP活性有所回升；24、48 h 時，ACP活性急劇下降，48 h時ACP活性下降了72.3%（圖4）。

2.2.5 堿性磷酸酯酶活性

黃帚橐吾乙醇提取物對黏蟲幼蟲的ALP活性抑制作用較為明顯。藥物處理后，隨著時間的延長，ALP活性呈下降趨勢。至24 h時，ALP活性開始急速降低，24、48 h的酶活性分別降低42.8%、65.3%（圖5）。

3 討論與結(jié)論

黃帚橐吾是高寒退化草場中的標志性毒雜草，因其含有多種植物次生代謝物質(zhì)和難聞氣味，家畜不采食^［21］。從而使其在高寒退化草場中的種群不斷擴大，已成為青藏高原高寒草場中分布最廣、危害極大的優(yōu)勢毒草，嚴重影響了該地區(qū)的群落結(jié)構和草場質(zhì)量^［22］。開發(fā)利用其生物農(nóng)藥價值，一方面可以為生物農(nóng)藥資源的發(fā)掘貢獻新生力量，另一方面也為退化草場毒雜草的綜合治理提供了新途徑。

胡冠芳等研究發(fā)現(xiàn)，黃帚橐吾甲醇提取物的10倍稀釋液對4齡菜粉蝶幼蟲的觸殺死亡率為83.33%，拒食率為82.23%^［11］；劉錦霞等研究黃帚橐吾乙醇提取物對3齡棉鈴蟲幼蟲的生物活性時，發(fā)現(xiàn)其有較強的觸殺和胃毒活性，濃度為 10 mg/mL 時，觸殺和胃毒校正死亡率分別為8467%和81.36%，其LC₅₀在3.00 mg/mL左右^［14］。本研究結(jié)果顯示，黃帚橐吾乙醇提取物對2齡黏蟲幼蟲的毒力較強，藥物濃度大于 5.0 mg/mL 時，校正死亡率均在50%以上，LC₅₀為3.655 mg/mL，此結(jié)果表明黃帚橐吾乙醇提取物可以有效防控黏蟲幼蟲的危害。黏蟲、菜粉蝶幼蟲和棉鈴蟲均為鱗翅目昆蟲，這提示黃帚橐吾乙醇提取物可能對鱗翅目昆蟲有相似的農(nóng)藥活性，此觀點還需更詳盡的試驗予以驗證。以此為切入點，黃帚橐吾源農(nóng)藥的作用譜和更精準的作用方式與機制還需要進一步的深入研究。

植物源化合物作用于試蟲后，通過影響其體內(nèi)的各個關鍵酶系活性，從而影響其生長、代謝的關鍵節(jié)點，并最終阻礙試蟲的正常生命活動。各種解毒酶對藥物處理作出的反應可能與該藥物的作用途徑和毒性強弱有關。本試驗結(jié)果表明，經(jīng)半致死濃度的黃帚橐吾乙醇提取物處理后，黏蟲幼蟲的CYP450活性在前8 h和對照組處于同一水平，略微有所上升；GST活性在4 h時極顯著高于對照（P<0.01），說明黃帚橐吾乙醇提取物對這2種酶有激活作用，也表明這2種酶參與了試蟲體內(nèi)對于黃帚橐吾乙醇提取物的代謝過程。Birnbaum等的研究表明，昆蟲攝入有毒化合物后其體內(nèi)CYP450和GST的表達和催化活性會升高，以協(xié)助其度過毒物脅迫，維持個體發(fā)育和生存^［20］，本研究結(jié)果與此觀點一致。此外，解毒代謝是一個高耗能的過程^［23］，從長遠來看，黏蟲幼蟲通過升高解毒酶活性以代謝黃帚橐吾提取物需要消耗大量能量，是一個不利于試蟲正常生存發(fā)育的過程。

GST會促使谷胱甘肽與外源物質(zhì)形成共軛解毒物質(zhì)^［24］，CYP450是昆蟲代謝外源性化合物的中心酶，具有活化氧分子和與底物結(jié)合的雙重功能^［25］。這2種酶活性的改變與昆蟲對藥物的抗性代謝密切相關，外源性物質(zhì)誘導GST和CYP450活性增加，從而使其解毒能力提高，抗藥性也得到增強^［26］。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)黃帚橐吾乙醇提取物處理后，試蟲的GST和CYP450活性被短暫激活以抵御外源物質(zhì)，隨后即被顯著抑制，抑制率達到70%以上，說明黃帚橐吾源農(nóng)藥可能較難使黏蟲幼蟲產(chǎn)生抗藥性，具備開發(fā)成為新型生物農(nóng)藥的潛力，在黏蟲的綠色防控中有較高的應用價值和良好的開發(fā)前景。

CarE等酯酶是昆蟲體內(nèi)三大解毒酶系之一，大量研究表明昆蟲受到外源藥物影響時，其體內(nèi)的酯酶均會有所響應。黃敏燕等研究發(fā)現(xiàn)，喂食0.5%單寧、0.2%蕓香苷以及1%沒食子酸后，斜紋夜蛾體內(nèi)的CarE活性顯著提升^［27］；化麗丹等研究報道經(jīng)蓖麻堿處理的甜菜夜蛾幼蟲，其體內(nèi)的ACP和ALP活性均受到顯著抑制^［28］；朱春亞等發(fā)現(xiàn)，苦瓜葉乙酸乙酯萃取物能夠顯著抑制ACP和ALP的活性，對CarE活性的影響表現(xiàn)為抑制、誘導、再恢復^［29］。本研究結(jié)果顯示，黏蟲幼蟲經(jīng)黃帚橐吾乙醇提取物處理后，體內(nèi)的CarE、ACP和ALP活性整體呈現(xiàn)被抑制的趨勢，說明該藥物可能通過降低上述3種酯酶的活性，造成黏蟲對外源刺激物的代謝阻滯，從而延長了藥物在黏蟲體內(nèi)的作用時間，給黏蟲帶來了相對更大的傷害。

本研究中，48 h內(nèi)黏蟲幼蟲經(jīng)高于半致死濃度的藥物處理，即處理濃度在5.0 mg/mL及以上時，試蟲的校正死亡率均大于50%，此現(xiàn)象與試蟲體內(nèi)代謝酶系的變化相吻合。

黃帚橐吾乙醇提取物處理黏蟲后對代謝酶系均有一定的影響，這表明黃帚橐吾乙醇提取物的生物農(nóng)藥活性與多種代謝酶的變化有關，本研究探討了蛋白水平上各種代謝關鍵酶活性對藥物的反應，而調(diào)控這些酶活性的分子機制還有待進一步深入探究。

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