變應(yīng)性鼻炎中l(wèi)ncRNA-miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與相關(guān)程序性細(xì)胞死亡基因的分析

王宇婷,姜輝,王嘉璽

(北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院 耳鼻咽喉科,北京 100078)

變應(yīng)性鼻炎(allergic rhinitis, AR) 是耳鼻咽喉科常見疾病之一,屬于機(jī)體免疫系統(tǒng)疾病。然而其發(fā)病機(jī)制的研究仍有不明之處,導(dǎo)致其診斷及針對(duì)性治療存在一定的困難。因此,我們迫切的需要進(jìn)一步研究,并且對(duì)AR的生物學(xué)機(jī)制有更深入的了解。非編碼RNA(ncRNA),包括microRNA(miRNA)、長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)和環(huán)狀RNA(circRNA),在表觀遺傳學(xué)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中發(fā)揮重要作用[1]。越來(lái)越多的研究表明lncRNA廣泛參與AR的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。lncRNA-miRNA-mRNA所形成的內(nèi)源競(jìng)爭(zhēng)RNA(competing endogenous RNA,ceRNA)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在免疫疾病中已有廣泛研究。然而,ceRNA網(wǎng)絡(luò)與AR的發(fā)生發(fā)展之間的關(guān)系仍不清楚。

Zhang等[2]研究表明FOXD3-AS1在AR患者鼻黏膜中下調(diào),其抑制鼻黏膜上皮細(xì)胞(nasal mucosa epithelial cells,NEC)中白細(xì)胞介素-25(interleukin-25,IL-25)的表達(dá)和分泌,從而調(diào)節(jié)AR中的輔助性T淋巴細(xì)胞2(helper T lymphocytes,Th2)的功能。然而,也有證據(jù)表明lncRNA不獨(dú)立發(fā)揮調(diào)節(jié)功能,而通過(guò)與某些ncRNA競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合相互作用,構(gòu)建動(dòng)態(tài)的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò),這以前被稱為競(jìng)爭(zhēng)。ceRNA網(wǎng)絡(luò)被認(rèn)為是解釋轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的重要機(jī)制[3]。有學(xué)者[4]研究發(fā)現(xiàn)在AR患者的鼻黏膜組織和IL-13處理的NEC中LINC00632表達(dá)下調(diào),并負(fù)調(diào)節(jié)miR-498,從而降低其靶基因白介素1受體拮抗劑(interleukin1 recepter antagonist,IL1RN)的表達(dá),以此來(lái)調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞集落刺激因子、嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子等的表達(dá)。然而AR的研究不僅限于此,考慮到程序性細(xì)胞死亡(programmed cell death,PCD)在AR中的重要作用,我們根據(jù)構(gòu)建的ceRNA網(wǎng)絡(luò)進(jìn)一步對(duì)AR的調(diào)控機(jī)制進(jìn)行探討。

本研究選取AR患者與正常人全血樣本進(jìn)行RNA測(cè)序,構(gòu)建lncRNA介導(dǎo)的ceRNA網(wǎng)絡(luò),對(duì)網(wǎng)絡(luò)中的mRNA進(jìn)行基因本體(gene ontology,GO)和KEGG功能富集分析。然后,我們將ceRNA網(wǎng)絡(luò)中差異表達(dá)的mRNA與PCD相關(guān)的基因進(jìn)行交互作用,并構(gòu)建lncRNA介導(dǎo)的ceRNA網(wǎng)絡(luò)中的PCD相關(guān)調(diào)控網(wǎng)絡(luò),分析相關(guān)基因的靶器官定位。該研究進(jìn)一步深入挖掘AR發(fā)病的新的分子機(jī)制,特別是lncRNA介導(dǎo)的ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)與程序性死亡之間的相互作用。

1 材料和方法

lncRNA介導(dǎo)的ceRNA網(wǎng)絡(luò)(lncRNA-miRNA-mRNA)的構(gòu)建及相關(guān)PCD基因分析流程如圖1所示。

圖1 ceRNA網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析流程圖 注:AR(變應(yīng)性鼻炎);GO(基因本體)。下同。

1.1 患者和樣本收集

1.1.1 一般資料 本研究納入4例AR患者,其中男1例,女3例;平均年齡29.3歲,平均病程2.4年。對(duì)照組4例,男2例,女2例;平均年齡30.3歲。兩組均于2021年3月—2021年4月就診于北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院耳鼻咽喉科門診,8例患者均久居于北京市。所有對(duì)照組均為變應(yīng)原特異性IgE陰性。研究對(duì)象均進(jìn)行常規(guī)檢查及靜脈血采集,所有的血液樣本都取自肘部靜脈。該研究所用標(biāo)本通過(guò)北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),并征得患者知情同意。

1.1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn): ①年齡18～55歲;②符合國(guó)內(nèi)《變應(yīng)性鼻炎診斷和治療指南》(2015年)中制定的AR診斷標(biāo)準(zhǔn)[5];③免疫印跡法進(jìn)行的血清變應(yīng)原特異性IgE(specific IgE, sIgE)檢測(cè)陽(yáng)性,主要對(duì)塵螨、動(dòng)物皮屑、蟑螂或霉菌過(guò)敏;④AR病史≥1年;⑤同意參與本研究并簽署知情同意書者。同時(shí)符合以上5條者方可納入。

排除標(biāo)準(zhǔn):①近2周內(nèi)患呼吸道感染或急性鼻竇炎;②慢性鼻竇炎病史或影像學(xué)顯示鼻竇炎;鼻腔手術(shù)史或鼻腔器質(zhì)性病變;③近3個(gè)月曾接受過(guò)西藥抗過(guò)敏治療、中藥治療,可能影響本臨床研究的觀察治療測(cè)定者;④合并全身免疫系統(tǒng)疾病、嚴(yán)重呼吸系統(tǒng)疾病、血液循環(huán)系統(tǒng)疾病、造血系統(tǒng)疾病者;⑤惡性腫瘤患者;⑥精神病患者;⑦妊娠期婦女;符合上述任意一條者均不能入組。

1.1.3 全血樣本采集和保存 應(yīng)用PAXgene血液RNA管(preanagen,Venlo,荷蘭)采集全血2.5 mL,PAXgene采血管內(nèi)含能夠穩(wěn)定體內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄性狀的抗凝劑以避免RNA快速降解,穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)RNA。將PAXgene試管小心倒置8～10次,可確保管內(nèi)保護(hù)劑和血液充分混合均勻,在室溫下放置2 h后,大體積干冰運(yùn)輸至深圳微科盟科技集團(tuán)有限公司實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè),以減少RNA降解。

1.2 RNA測(cè)序分析

1.2.1 全血總RNA提取 在RNA提取前,從干冰中取出試管后,室溫解凍并在孵育2 h。RNA純化按照PAXgene血液RNA試劑盒手冊(cè)中的方案進(jìn)行。利用NanoDrop2000儀(NanoDrop技術(shù)公司,威爾明頓,DE,美國(guó))對(duì)所提 RNA 的濃度和純度進(jìn)行檢測(cè),瓊脂糖凝膠電泳測(cè)RNA完整性,電泳圖片顯示3條清晰的條帶(28 s/18 s/5 s),RNA完整性良好。Qubit測(cè)定濃度。單次建庫(kù)要求RNA總量≥1 ug,濃度≥100 ng/μL,OD260/280≥1.8,OD260/230≥1.0。

1.2.2 RNA測(cè)序?qū)嶒?yàn) 測(cè)序?qū)嶒?yàn)采用Illumina Truseq TM RNA sample prep Kit方法進(jìn)行鏈特異文庫(kù)構(gòu)建,包括去除rRNA,RNA片段化,反轉(zhuǎn)成cDNA,連接adaptor即在雙鏈的 cDNA 在3’末端加上一個(gè) A 堿基,連接Y字形的接頭,UNG酶消化cDNA二鏈,文庫(kù)富集即PCR擴(kuò)增,純化得到最終文庫(kù),并由illumina平臺(tái)上機(jī)測(cè)序。lncRNA是一類轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度超過(guò)200 nt,不編碼 lncRNA的RNA分子。我們基于轉(zhuǎn)錄組拼接結(jié)果,根據(jù) lncRNA 的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)以及不編碼 lncRNA 的功能特點(diǎn),設(shè)置一系列嚴(yán)格的篩選條件,將篩選所得lncRNA進(jìn)行后續(xù)分析。使用StringTie-eB軟件對(duì)lncRNA的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行定量分析,得到各樣本的轉(zhuǎn)錄本readcount 及FPKM信息。同時(shí)對(duì)測(cè)序結(jié)果中的mRNA及miRNA進(jìn)行定量分析,得到readcount 及FPKM值。

1.3 篩選差異表達(dá)lncRNA、miRNA和mRNA

采用R軟件中的“DESeq2”軟件包,對(duì)AR患者與對(duì)照組之間的lncRNA、miRNA和mRNA進(jìn)行差異表達(dá)分析。用P<0.05和|log2FC|>1作為基因表達(dá)顯著性差異的篩選閾值。通過(guò)使用R軟件中的“ggplot2”、“pheatmap”和“ggrepel”軟件包生成熱圖和火山圖來(lái)進(jìn)行差異基因的可視化。

1.4 lncRNA-miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

lncRNA-miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)基于ceRNA假設(shè)構(gòu)建:①應(yīng)用miRmap, miRanda, miRDB, TargetScan和MitarBase數(shù)據(jù)庫(kù)提取miRNA-mRNA的相互作用信息,應(yīng)用 StarBase數(shù)據(jù)庫(kù)提取 miRNA-lncRNA相互作用的信息;②如果lncRNA和mRNA都被同一個(gè)miRNA靶向,并且該miRNA與lncRNA及mRNA表達(dá)負(fù)相關(guān),則該lncRNA-miRNA-mRNA組被確定為共表達(dá)競(jìng)爭(zhēng)三聯(lián)體,故構(gòu)建相應(yīng)的ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。應(yīng)用cytoscape 3.7.1軟件對(duì)ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化。

1.5 GO和KEGG功能富集分析

對(duì)上述步驟中得到的ceRNA網(wǎng)絡(luò)中的mRNA進(jìn)行潛在的生物學(xué)功能富集分析。GO富集分析分為分子功能(molecular function, MF)、生物過(guò)程(biological process,BP)和細(xì)胞組成(cellular component,CC)3個(gè)部分;KEGG分析是應(yīng)用KEGG(京都基因和基因組百科全書)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行mRNA相關(guān)通路的富集分析,利用R軟件中的“clusterprofiler”包預(yù)測(cè)ceRNA網(wǎng)絡(luò)中的mRNA潛在的生物學(xué)功能。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。KEGG分析應(yīng)用R軟件中“GOplot”包篩選GO中3個(gè)部分的前20個(gè)基因集繪制柱狀圖進(jìn)行可視化;并篩選具有顯著差異的KEGG基因集進(jìn)行圈圖繪制。

1.6 ceRNA網(wǎng)絡(luò)中PCD相關(guān)基因的篩選

首先genecards數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.genecards.org)中與PCD相關(guān)的基因,包括“程序性細(xì)胞死亡”、“細(xì)胞凋亡”、“細(xì)胞焦亡”相關(guān)基因。然后,將ceRNA網(wǎng)絡(luò)中差異表達(dá)的mRNA與PCD、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞焦亡相關(guān)的基因相互取交集。結(jié)果通過(guò)在線工具Venny 2.1.0(http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)生成的Venny圖進(jìn)行可視化。

1.7 PCD相關(guān)基因的ceRNA網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

依據(jù)ceRNA假設(shè)構(gòu)建PCD相關(guān)lncRNA-miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò),并應(yīng)用Cytoscape 3.7.1軟件對(duì)ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化。

1.8 ceRNA網(wǎng)絡(luò)中mRNA與靶器官網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

AR作為免疫系統(tǒng)疾病其發(fā)病機(jī)制尚有不明之處,可能有多個(gè)組織和器官參與疾病的發(fā)生進(jìn)展。因此,應(yīng)用BioGPS數(shù)據(jù)庫(kù)(https://biogps.org)在器官組織水平上檢測(cè)每個(gè)mRNA的表達(dá)譜信息[6]。該數(shù)據(jù)庫(kù)提供了通過(guò)微陣列分析直接測(cè)量基因表達(dá)而獲得的基因表達(dá)數(shù)據(jù)[7]。我們首先得到84個(gè)器官和組織中每個(gè)mRNA表達(dá)的分布數(shù)據(jù),然后計(jì)算每個(gè)組織中每個(gè)mRNA的平均值和所有組織中的總體平均值[8]。最后,提取mRNA表達(dá)量高于總體平均值的相關(guān)器官和組織中的前14個(gè)靶器官與mRNA通過(guò)Cytoscape 3.7.1建立mRNA-靶器官定位網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié)果

2.1 差異表達(dá)的lncRNA、miRNA及mRNA的鑒定

對(duì)AR組及對(duì)照組全血樣本測(cè)序,并對(duì)已知序列的lncRNA、miRNA和mRNA進(jìn)行定量分析,以P<0.05和|log2FC|>1為閾值篩選差異表達(dá)的lncRNA、miRNA和mRNA。共鑒定出200個(gè)差異表達(dá)lncRNA(98個(gè)上調(diào),102個(gè)下調(diào));201個(gè)差異表達(dá)mRNA(92個(gè)上調(diào),109個(gè)下調(diào));14個(gè)差異表達(dá)miRNA(7個(gè)上調(diào),7個(gè)下調(diào))。差異表達(dá)的lncRNA、miRNA和mRNA的熱圖和火山圖如圖2所示。

圖2 差異表達(dá)的lncRNA、mRNA和miRNA的火山圖和聚類熱圖 A:差異表達(dá)lncRNA火山圖; B:差異表達(dá)mRNA火山圖; C:差異表達(dá)miRNA火山圖; D:200個(gè)差異表達(dá)lncRNA聚類熱圖; E:201個(gè)差異表達(dá)mRNA聚類熱圖; F:14個(gè)差異表達(dá)miRNA聚類熱圖 注:紅色表示上調(diào)的基因,藍(lán)色表示下調(diào)的基因;淺綠色表示對(duì)照組,淡紅色代表AR組。

2.2 lncRNA、miRNA、mRNA間ceRNA網(wǎng)絡(luò)的分析

我們根據(jù)堿基序列和表達(dá)水平分別預(yù)測(cè)了lncRNA-miRNA和miRNA-mRNA對(duì)?；赾eRNA網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建思路,在lncRNA介導(dǎo)的上調(diào)ceRNA網(wǎng)絡(luò)中鑒定出4對(duì)miRNA-lncRNA和22對(duì)miRNA-mRNA,包括3個(gè)lncRNA節(jié)點(diǎn)、2個(gè)miRNA節(jié)點(diǎn)和22個(gè)mRNA節(jié)點(diǎn);在lncRNA介導(dǎo)的下調(diào)ceRNA網(wǎng)絡(luò)中鑒定出3對(duì)miRNA-lncRNA和24對(duì)miRNA-mRNA,2個(gè)lncRNA節(jié)點(diǎn)、2個(gè)miRNA節(jié)點(diǎn)和24個(gè)mRNA節(jié)點(diǎn)。見圖3。

圖3 lncRNA介導(dǎo)的ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 A:lncRNA介導(dǎo)的上調(diào)ceRNA網(wǎng)絡(luò); B:lncRNA介導(dǎo)的下調(diào)ceRNA網(wǎng)絡(luò) 注:綠色表示LncRNA上調(diào),紅色表示LncRNA下調(diào);淡黃色表示miRNA下調(diào),紫色代表miRNA上調(diào);藍(lán)色代表mRNA上調(diào),橘黃色代表mRNA下調(diào)。

2.3 ceRNA網(wǎng)絡(luò)中差異表達(dá)mRNA功能富集分析

為了進(jìn)一步探索lncRNA介導(dǎo)的ceRNA網(wǎng)絡(luò)相關(guān)的潛在功能,應(yīng)用R中的“clusterprofiler”對(duì)ceRNA網(wǎng)絡(luò)中的mRNA進(jìn)行功能富集分析。GO分析結(jié)果將顯著富集(P<0.05)的前20個(gè)GO條目繪制成柱狀圖(圖4A)。結(jié)果表明,參與ceRNA網(wǎng)絡(luò)中的差異表達(dá)mRNA尤其富集于GO:0051924(鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)的調(diào)節(jié));GO:0070372(ERK1和ERK2級(jí)聯(lián)的調(diào)節(jié));GO:0070371(ERK1和ERK2級(jí)聯(lián));GO:0014065(磷脂酰肌醇 3-激酶信號(hào)傳導(dǎo))等生物學(xué)進(jìn)程中。GO:0016323(基底外側(cè)質(zhì)膜);GO:0016324(頂端質(zhì)膜);GO:0031253(細(xì)胞投射膜)等細(xì)胞成分中。GO:0016651[作用于 NAD(P)H的氧化還原酶活性];GO:0140375(免疫受體活性);GO:0005178(整合素結(jié)合)等分子功能。見圖4B。另外KEGG通路分析表明,ceRNA網(wǎng)絡(luò)中mRNA的功能主要富集于hsa04510(粘附斑激酶通路);hsa05235(在癌癥中PD-L1的表達(dá)和PD-1檢查點(diǎn)通路);hsa04020(鈣信號(hào)通路);hsa04611(血小板活化通路);hsa04151(PI3K-Akt 信號(hào)通路);hsa04022(cGMP-PKG信號(hào)通路);hsa04621(NOD樣受體信號(hào)通路);hsa04060(細(xì)胞因子與受體間相互作用);hsa04080(神經(jīng)活性配體-受體相互作用)。見圖4C。

圖4 ceRNA網(wǎng)絡(luò)中差異表達(dá)mRNA的功能富集分析 A:ceRNA網(wǎng)絡(luò)中差異表達(dá)mRNA的GO分析 注:BP(生物過(guò)程);CC(細(xì)胞成分);MF(分子功能)。X軸:各GO條目;Y軸:校正過(guò)的P值(P<0.05表示顯著富集)。紅色表示在AR中該GO生物學(xué)功能更有可能上調(diào),藍(lán)色表示更有可能下調(diào)。B:篩選可能具有臨床意義且顯著富集的10個(gè)GO條目繪制圈圖 注:藍(lán)色點(diǎn)代表下調(diào)基因,紅色點(diǎn)代表上調(diào)基因;內(nèi)圈條狀的高度代表富集基因的數(shù)目;內(nèi)圈條狀的顏色:紅色表示在AR中該GO生物學(xué)功能更有可能上調(diào),藍(lán)色表示更有可能下調(diào)。C:篩選可能具有臨床意義且顯著富集的9個(gè)KEGG通路繪制圈圖,用于展示基因的差異倍數(shù)與富集到的KEGG通路間的隸屬關(guān)系 注:左側(cè)代表基因,其中紅色上調(diào)基因,藍(lán)色代表下調(diào)基因;右側(cè)代表9個(gè)KEGG通路。

2.4 ceRNA網(wǎng)絡(luò)中PCD相關(guān)基因的鑒定及PCD相關(guān)基因的ceRNA網(wǎng)絡(luò)分析

我們將ceRNA網(wǎng)絡(luò)中的46個(gè)差異表達(dá)的mRNA與GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索到14 004個(gè)自噬相關(guān)基因相互作用,鑒定出ceRNA網(wǎng)絡(luò)中存在25個(gè)自噬相關(guān)基因,于13 473個(gè)PCD相關(guān)基因相互作用,共獲得25個(gè)交集基因;與184個(gè)焦亡相關(guān)基因相互作用,鑒定出1個(gè)交集基因(圖5)。然后,我們對(duì)構(gòu)建了AC008394.1及人類組織相容性白細(xì)胞抗原復(fù)合物P5(human histocompatibility leukocyte antigen comple P5,HCP5) 2個(gè)lncRNA所介導(dǎo)的ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò),探索其對(duì)PCD的調(diào)控作用,結(jié)果如圖6所示。

圖5 韋恩圖,ceRNA網(wǎng)絡(luò)中差異表達(dá)的mRNA與PCD、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞焦亡相關(guān)的mRNA之間的相互作用 注:PCD(程序性細(xì)胞死亡)。下同。

圖6 PCD相關(guān)基因ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 A:lncRNA介導(dǎo)的下調(diào)ceRNA網(wǎng)絡(luò); B:lncRNA介導(dǎo)的上調(diào)ceRNA網(wǎng)絡(luò) 注:黃色表示lncRNA下調(diào),紅色表示lncRNA上調(diào);淺藍(lán)色表示miRNA上調(diào),橘黃色代表miRNA下調(diào);紫色代表mRNA下調(diào),綠色代表mRNA上調(diào)。

2.5 ceRNA網(wǎng)絡(luò)中mRNA與靶器官定位網(wǎng)絡(luò)分析

基因表達(dá)數(shù)據(jù)是基于B和GPS數(shù)據(jù)庫(kù)中的基因表達(dá)芯片分析所得。在查找相關(guān)mRNA在BioGPS數(shù)據(jù)庫(kù)的表達(dá)譜中,NANOGP8和CD247沒(méi)有mRNA表達(dá)譜。故我們分析了44個(gè)mRNA靶蛋白在84個(gè)組織和器官中的表達(dá)譜,選取前14個(gè)靶器官與相應(yīng)的mRNA構(gòu)建mRNA-靶器官定位網(wǎng)路,14個(gè)靶器官包括小腦、顳葉、松果體、下丘腦、背根神經(jīng)節(jié)、骨髓、CD34+等以神經(jīng)免疫系統(tǒng)為主的相關(guān)組織器官。網(wǎng)絡(luò)中包含32個(gè)節(jié)點(diǎn)和328條邊。大多數(shù)靶標(biāo)同時(shí)在多個(gè)器官和組織中高表達(dá),表明這些器官與PCD相關(guān)ceRNA網(wǎng)絡(luò)密切相關(guān),提示其相關(guān)作用機(jī)制可能與神經(jīng)、免疫等功能相關(guān)。見圖7。

圖7 ceRNA網(wǎng)絡(luò)中mRNA與靶器官定位網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 注:黃色代表基因;綠色代表靶器官。節(jié)點(diǎn)大小由degree值決定。

3 討論

AR是一種復(fù)雜的疾病,隨著空氣質(zhì)量日益惡化,人們生活工作壓力的增加及飲食不規(guī)律等原因,使得患病人數(shù)逐年增加,且部分患者伴發(fā)哮喘等下呼吸道疾病,嚴(yán)重影響生活質(zhì)量[9]。雖然常年性 AR患者較少存在生存問(wèn)題,但疾病所產(chǎn)生的附加影響,如對(duì)情緒、睡眠及經(jīng)濟(jì)成本的影響仍值得我們?nèi)パ芯?。然? AR的分子機(jī)制尚不清楚,這為疾病的早期診斷及針對(duì)性治療帶來(lái)困難。

為了更好地認(rèn)識(shí) AR的發(fā)病機(jī)制和發(fā)現(xiàn)潛在的生物標(biāo)志物,本研究利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)對(duì)其進(jìn)行了定量和全面的分析,包括編碼和非編碼轉(zhuǎn)錄組。結(jié)果顯示,常年性 AR患者與正常人中miRNA、lncRNA和mRNA的表達(dá)模式存在顯著差異,而DEmiRNA、DElncRNA和DEmRNA的動(dòng)態(tài)變化也存在顯著差異。近年來(lái),ncRNA 被發(fā)現(xiàn)與廣泛的生物調(diào)節(jié)功能相關(guān)[10]。然而,本研究獲得的DElncRNA大多功能未知,這主要是由于對(duì)它們的研究較少。因此,我們構(gòu)建了常年性 AR由lncRNA介導(dǎo)的ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。基于ceRNA理論構(gòu)建了2個(gè)lncRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò),包括5個(gè)lncRNA、4個(gè)miRNA和46個(gè)mRNA。lncRNA AC004832.1、AC008394.1、TDRG1、HCP5和CHL1-AS1均首次在 AR患者外周血中被鑒定為差異表達(dá)的lncRNA。GO和KEGG富集分析表明,參與ceRNA網(wǎng)絡(luò)的DEmRNA在“鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)的調(diào)節(jié)”、“PI3K-Akt通路”和“免疫受體活性”等中顯著富集。在ceRNA網(wǎng)絡(luò)與PCD相關(guān)基因相互作用后,鑒定到20個(gè)lncRNA介導(dǎo)的ceRNA調(diào)控通路。另外,將鑒定到的ceRNA網(wǎng)絡(luò)中的mRNA進(jìn)行靶器官定位分析發(fā)現(xiàn),大多數(shù)靶標(biāo)在神經(jīng)免疫系統(tǒng)為主的相關(guān)組織器官中表達(dá)。

在上述ceRNA調(diào)控通路中,有幾個(gè)樞紐節(jié)點(diǎn)已被證明在AR及相關(guān)免疫細(xì)胞中發(fā)揮關(guān)鍵作用。人類主要組織相容性復(fù)合體(human major histocompatibility complex,MHC),也被稱為人類白細(xì)胞抗原(human leukocyte antigen,HLA),覆蓋人類基因組的0.13%,跨越6號(hào)染色體短臂6p21位置,該區(qū)域包含超過(guò)250個(gè)注釋基因和假基因[11],lnRNAHCP5基因位于6p21.33區(qū)域中,人白細(xì)胞抗原HLA I類β區(qū)域內(nèi)的ERV16元件中[12]。在一項(xiàng)關(guān)于HCP5與轉(zhuǎn)錄因子相互作用的研究中,Warner等[13]通過(guò)敲除NF-κB1基因失活的研究中發(fā)現(xiàn),HCP5、NOD2和IL-8與細(xì)胞活力下降密切相關(guān)。同時(shí)NF-κB1(位于chr4上)調(diào)控他一些MHC基因的表達(dá),從而影響多種生物學(xué)功能,包括與炎癥疾病相關(guān)的錯(cuò)誤激活、不適當(dāng)?shù)拿庖呒?xì)胞發(fā)育和細(xì)胞生長(zhǎng)延遲。且它可以獨(dú)立于大多數(shù)基因被激活或抑制。另外在探討細(xì)胞因子對(duì)HCP5表達(dá)的影響時(shí)發(fā)現(xiàn),在外周血單核細(xì)胞中IL-10能夠下調(diào)HCP5的表達(dá)[14],而IL-10在AR中低表達(dá)[15],故推測(cè)HCP5可能在AR中表達(dá)增高,這與本研究結(jié)果一致。

目前對(duì)于HCP5通過(guò)ceRNA機(jī)制發(fā)揮作用的研究主要集中在腫瘤研究中,Cheng等[16]在結(jié)直腸癌的研究中,應(yīng)用熒光素酶報(bào)告基因分析,結(jié)果表明miR-139-5p是HCP5的直接靶點(diǎn),HCP5通過(guò)激活ZEB1并與miR-139-5p相互作用,參與上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化。Zhang等[17]研究發(fā)現(xiàn)HCP5通過(guò)靶向miR-140-5p/IGF1R通路促進(jìn)透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌的增殖和轉(zhuǎn)移,HCP5作為一種相互競(jìng)爭(zhēng)的內(nèi)源性RNA,通過(guò)在ccRCC中海綿化miR-140-5p來(lái)調(diào)節(jié)IGF1R的表達(dá)。如在肺腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)蛋白編碼基因CTSS、FGL2和PDL2,miR-106b-5p和miR-17-5b及l(fā)ncRNAHCP5形成了調(diào)控網(wǎng)絡(luò),從而HCP5通過(guò)與免疫檢查點(diǎn)基因PDL2和抑制癌變的治療靶點(diǎn)FGL2競(jìng)爭(zhēng),參與了肺癌的發(fā)生過(guò)程[18]。HCP5通過(guò)海綿化miR-22-3p、miR-186-5p和miR-216a-5p發(fā)揮ceRNA功能,激活ST6GAL2,調(diào)節(jié)濾泡性甲狀腺癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲性和血管生成能力,從而促進(jìn)濾泡性甲狀腺癌進(jìn)展[19]。

ceRNA網(wǎng)絡(luò)中的miRNA是重要的節(jié)點(diǎn),Zhou等[20]通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)患者和小鼠鼻黏膜中miR-31的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)在AR患者中miR-31水平升高。?emeci 等[21]對(duì)鼻息肉組織與鄰近的正常鼻黏膜相比,發(fā)現(xiàn)鼻息肉組織中miR-31的平均水平升高,且在氣道上皮細(xì)胞中高表達(dá)[22]。另有miR-31對(duì)免疫細(xì)胞作用機(jī)制的研究,用miR-31轉(zhuǎn)染CD4+T細(xì)胞可降低IL-2和IL-4的表達(dá)水平[23],上述在 AR及氣道炎癥中對(duì)于miR-31的研究結(jié)果,與本研究結(jié)果相同。在花粉季節(jié)期間和之外獲取SAR患者CD4+T細(xì)胞,使用微陣列分析發(fā)現(xiàn)miR-139為差異表達(dá)的miRNA,結(jié)合共表達(dá)分析結(jié)果顯示miR-139可能通過(guò)調(diào)節(jié)FOS和JUN影響SAR[24]。另外,來(lái)自季節(jié)性AR患者的CD4+T細(xì)胞,應(yīng)用芯片分析,結(jié)果提示miR-139-3p和miR-223可以發(fā)揮互補(bǔ)作用,靶向改變Th2細(xì)胞功能,影響Th2細(xì)胞因子的釋放[25]。既往對(duì)于miR-140的研究發(fā)現(xiàn),在AR患者鼻黏膜中應(yīng)用qRT-PCR檢測(cè)lnc-GAS5、其靶基因miR-21和miR-140及干擾素-γ、IL-2、IL-4 和 IL-10,結(jié)果顯示在AR患者中l(wèi)nc-GAS5升高,而 miR-21和miR-140顯著下調(diào),干擾素-γ和IL-2與lnc-GAS5呈正相,結(jié)果提示miR-140與AR的疾病風(fēng)險(xiǎn)、癥狀嚴(yán)重程度和Th1/Th2失衡相關(guān)[26]。該研究結(jié)果與本研究不同,可能為選取檢測(cè)組織樣本不同,使得miR-140的表達(dá)存在差異,更需要進(jìn)一步的驗(yàn)證。

ceRNA網(wǎng)絡(luò)中的mRNA是最終發(fā)揮效應(yīng)的主要節(jié)點(diǎn),既往研究發(fā)現(xiàn),血栓素 A2 受體 (thromboxane A2 receptor,TBXA2R)是與慢性氣道炎癥有關(guān)的基因。多項(xiàng)研究都提示TBXA2R與呼吸道疾病哮喘間存在密切關(guān)系[27-28],且TBXA2R中的rs8113232 SNP位點(diǎn)與哮喘兒童鼻炎之間存在關(guān)聯(lián)[29]。NOS3缺失導(dǎo)致卵清蛋白致敏小鼠出現(xiàn)中等強(qiáng)度的氣道高反應(yīng)。除了氣道反應(yīng)性的差異,在氣道炎癥程度、卵清蛋白特異性IgE水平方面沒(méi)有差異[30]。

為了進(jìn)一步探討AR中差異表達(dá)的mRNA生物學(xué)功能,我們對(duì)ceRNA中46個(gè)差異表達(dá)mRNA進(jìn)行了GO和KEGG通路分析,我們發(fā)現(xiàn)這些mRNA在“鈣信號(hào)通路”和“PI3K/AKT信號(hào)通路”中顯著富集,這與之前的觀點(diǎn)一致。免疫細(xì)胞中的鈣信號(hào)通路參與細(xì)胞分化,基因轉(zhuǎn)錄和效應(yīng)器功能的調(diào)節(jié)。細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平(Ca2+)的增加是由于免疫感受器的參與,例如T細(xì)胞受體,B細(xì)胞受體和Fc受體,以及趨化因子和共刺激受體。誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞中細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平增加的主要途徑是通過(guò)儲(chǔ)存操作的鈣進(jìn)入和鈣釋放激活的鈣通道[31]。肥大細(xì)胞通過(guò)釋放組胺和炎癥因子在AR的過(guò)敏性炎癥中起關(guān)鍵作用,這一過(guò)程稱為脫顆粒[32],蛋白激酶C激活和胞質(zhì)Ca2+濃度升高的水平這兩種途徑可能共同激活肥大脫顆粒作用,故胞質(zhì)Ca2+濃度增加對(duì)肥大細(xì)胞脫顆粒有重要意義[33]。Nian等[34]在研究過(guò)敏原激發(fā)的NEC與AR中肥大細(xì)胞脫顆粒之間的關(guān)聯(lián)時(shí)發(fā)現(xiàn),IL-33及其受體ST2的表達(dá)在NEC中升高;同時(shí)在肥大細(xì)胞中IL-33降低了LC3-Ⅰ/Ⅱ和Beclin-1水平,增加了p62水平,表明LAD2細(xì)胞的自噬受到抑制,并驗(yàn)證了IL-33是通過(guò)ST2/PI3K/mTOR介導(dǎo)的自噬來(lái)促進(jìn)AR中肥大細(xì)胞的脫顆粒。此外,構(gòu)建的ceRNA網(wǎng)絡(luò)中的mRNA在“ERK1和ERK2級(jí)聯(lián)”中顯著富集。ERK2/ERK1(也被稱為p42/p44MAPK,正式命名為MAPK1和3),是兩種細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)的異構(gòu)體,屬于絲裂原活化蛋白激酶家族成員[35]。Qin等[36]研究發(fā)現(xiàn)AR患者血清中IL-36和Th17細(xì)胞因子(IL-17和IL-23)的表達(dá)顯著上調(diào)。而IL-36α可通過(guò)介導(dǎo)ERK和PI3K/AKT通路,顯著增加Th17細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子RORγt的表達(dá),并上調(diào)PBMCs對(duì)IL-17和IL-23的產(chǎn)生。且IL-17和IL-23可以促進(jìn)IL-36α的產(chǎn)生,形成一個(gè)正反饋回路,從而對(duì)AR發(fā)揮調(diào)控作用。另外有研究稱Ras/Raf/ERK通路可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,其作用機(jī)制包括調(diào)節(jié)Bcl-2蛋白家族控制細(xì)胞色素c的釋放及促進(jìn)caspase-8信號(hào)傳導(dǎo)和激活等[37]。因此,我們有理由假設(shè),新構(gòu)建的ceRNA網(wǎng)絡(luò)可能通過(guò)調(diào)節(jié)Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)在免疫細(xì)胞及細(xì)胞因子相互作用在AR中發(fā)揮作用。

基于對(duì)ceRNA網(wǎng)絡(luò)中mRNA生物學(xué)功能的分析,結(jié)果提示相關(guān)機(jī)制與自噬及凋亡存在一定聯(lián)系,故我們將46個(gè)mRNA與PCD相關(guān)基因相互取交集,探究特征性PCD在調(diào)節(jié)AR中發(fā)揮的作用。細(xì)胞死亡根據(jù)可控性分為PCD和非PCD兩大類。炎癥的發(fā)生多于PCD相關(guān),但近年來(lái)的研究顯示多種細(xì)胞死亡也受到程序性控制,多種PCD也與炎癥發(fā)生相關(guān)。PCD包括凋亡、自噬、壞死性凋亡、焦亡、鐵死亡及細(xì)胞衰老等形式[38]。在我們的研究中發(fā)現(xiàn)ceRNA網(wǎng)絡(luò)中的mRNA主要與凋亡關(guān)系密切。凋亡在形態(tài)上會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞皺縮、染色質(zhì)凝集、凋亡小體形成和細(xì)胞骨架解離等特征。線粒體凋亡途徑受控于BCL2蛋白家族,死亡受體途徑受死亡受體的介導(dǎo)。而線粒體凋亡在特定條件下對(duì)炎癥[39]和天然免疫[40]產(chǎn)生影響。既往研究發(fā)現(xiàn),凋亡與AR相關(guān),包括對(duì)中性粒細(xì)胞凋亡[41]、嗜酸性粒細(xì)胞[42]、嗜堿性粒細(xì)胞[43]和鼻上皮細(xì)胞凋亡[44]等與AR發(fā)生間關(guān)系的研究。HCP5與miR-3619-5p相互作用以調(diào)節(jié)胃癌(gastric cancer,GC)細(xì)胞的凋亡[45]。新構(gòu)建的ceRNA網(wǎng)絡(luò)中的mRNA,如巨噬細(xì)胞凋亡抑制劑又稱 CD5L,主要由巨噬細(xì)胞分泌,其可在炎癥反應(yīng)和免疫抑制相關(guān)病理過(guò)程中重要發(fā)揮作用[46],故我們推測(cè)HCP5可能通過(guò)ceRNA機(jī)制調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡從而對(duì)AR產(chǎn)生影響。最后,我們將新構(gòu)建的ceRNA中的mRNA進(jìn)行靶器官定位網(wǎng)路分析,顯示mRNA主要在神經(jīng)免疫系統(tǒng)為主的相關(guān)組織器官中表達(dá),提示與神經(jīng)、免疫等功能有關(guān)。

本研究通過(guò)RNA測(cè)序確定了來(lái)自AR組及對(duì)照組中差異表達(dá)的lncRNA、miRNA和mRNA數(shù)據(jù),并構(gòu)建了ceRNA網(wǎng)絡(luò),初步探索出HCP5介導(dǎo)的ceRNA網(wǎng)絡(luò)可能通過(guò)影響細(xì)胞凋亡對(duì)AR發(fā)揮作用。研究仍存在一些局限性,首先選取的樣本量較少,可能會(huì)影響結(jié)果的質(zhì)量,且暫未對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行相關(guān)表達(dá)量及功能驗(yàn)證,進(jìn)一步研究應(yīng)擴(kuò)大樣本量并進(jìn)行相關(guān)試驗(yàn)驗(yàn)證。其次,研究選取外周血成分相對(duì)復(fù)雜,結(jié)合既往研究,未來(lái)可針對(duì)相關(guān)免疫細(xì)胞進(jìn)行篩選和驗(yàn)證。這些實(shí)驗(yàn)可能有助于了解AR的病理機(jī)制,幫助尋找AR治療的潛在藥物靶點(diǎn)。