自噬抑制劑通過氧化應(yīng)激誘導(dǎo)人頭皮毛乳頭細(xì)胞早衰進(jìn)程

萬梅,鐘意,翁祖銓,吳亞光,宋瀟,楊希川

雄激素源性脫發(fā)(androgenetic alopecia, AGA)是由受累區(qū)域的毛囊生長期縮短所致,而非毛發(fā)生長完全停止。生長期縮短會導(dǎo)致毛干更短更細(xì),稱為毛囊微型化[1]。毛乳頭細(xì)胞(dermal papilla cells, DPC)為位于毛囊基底部的特殊間質(zhì)成分,在毛囊發(fā)育和周期性再生調(diào)控中起主導(dǎo)作用[2]。誘導(dǎo)毛囊形成及再生為毛乳頭細(xì)胞最顯著的功能特征,其功能異常是毛囊疾病發(fā)生的關(guān)鍵因素。有研究證實(shí)AGA 患者脫發(fā)區(qū)(前額,雄激素敏感部位)的DPC較非脫發(fā)區(qū)(枕部,雄激素非敏感部位)表現(xiàn)出早衰表型,并且發(fā)現(xiàn)衰老標(biāo)志物 p16 的上調(diào)和 DNA 損傷標(biāo)志物的表達(dá)增加[3-4]。這表明DPC的早衰是毛囊微型化的重要因素,因此,防止DPC早衰可能是治療AGA的新方向。

自噬是一個保守的過程,它分解代謝細(xì)胞內(nèi)成分以維持能量穩(wěn)態(tài)并保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷[5]。自噬通常被認(rèn)為是一種積極的長壽調(diào)節(jié)因子,但自噬也可能在健康中發(fā)揮有害作用。自噬不僅對皮膚形成本身至關(guān)重要,而且延長了毛囊生長期[6],因此,自噬是脫發(fā)發(fā)展過程中的一個保護(hù)過程。因此,了解自噬機(jī)制為防止DPC早衰提供了一種有希望的策略。

U0126是一種小分子MEK1/2抑制劑,可通過MEK途徑影響細(xì)胞存活、分化、增殖、凋亡等生物學(xué)效應(yīng)。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均表明U0126可抑制細(xì)胞自噬和線粒體自噬并具有抗病毒的活性[7]。因此,本研究利用U0126處理DPC建立自噬抑制模型,通過分析DPC早衰表型、評估DPC生物活性因子的變化,初步探討自噬對DPC早衰的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1材料 本研究經(jīng)陸軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)[(倫理審批號(A)KY202240]。所有實(shí)驗(yàn)均按照相關(guān)指南和規(guī)定進(jìn)行。患者/受試者均簽署書面知情同意書。標(biāo)本來自陸軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚科頭皮術(shù)后含毛囊的皮膚組織,大小為0.5 cm×2 cm～1 cm×4 cm,采集后立即置于4 ℃無菌生理鹽水中保存。采用改良二步酶消化法分離毛乳頭[8]。

1.2方法

1.2.1DPC培養(yǎng) 原代DPC用含10% 胎牛血清(Gibco,10091148)和100 U/L青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。本研究將采用三代DPC進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2SA-β-gal 采用SA-β-gal染色試劑盒(Beyotime,C0602)測定DPC衰老活性。分別采用0、10、20、30 μmol/L濃度的U0126處理DPC 后,β-半乳糖苷酶染色固定液固定細(xì)胞。PBS洗滌3次,加入染色液。37 ℃過夜后,顯微鏡下觀察SA-β-gal染色情況。計(jì)數(shù)染色的細(xì)胞數(shù)。

1.2.3細(xì)胞遷移 小室(corning, 353097)上層分別添加0、10、20、30 μmol/L濃度的U0126,下層添加無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)DPC 24 h。4%多聚甲醛固定細(xì)胞30 min,0.1%結(jié)晶紫染色液染色20 min,用棉簽拭去上室未遷移的細(xì)胞。正置顯微鏡觀察并拍照。用PS軟件計(jì)數(shù)遷移的細(xì)胞數(shù)。

1.2.4活性氧檢測 采用ROS檢測試劑盒(Beyotime,S0033S)測定ROS濃度。分別采用0、10、20、30 μmol/L濃度的U0126刺激細(xì)胞后移除細(xì)胞培養(yǎng)基,加入適量稀釋的DCFH-DA。用無血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌DPC 3次。用Varioskan Flash Reader在激發(fā)波長488 nmol/L,發(fā)射波長525 nmol/L處測定光密度(OD)值。

1.2.5Western blot DPC經(jīng)藥物處理后,裂解細(xì)胞。SDS-PAGE分離蛋白并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。封閉液封閉,用稀釋的一抗在4 ℃孵育過夜。一抗為Actin(BBI,D191047)、GAPDH(Santa,sc32233)、LC3(MBL,PM036)、C-myc(Santa,sc-40)、Survivin(Santa,sc-17779)、Rb(Santa,sc102)、p16(Santa,sc-56330)。洗滌后,將膜與HRP標(biāo)記的二抗孵育。Evolution-Capt Edge成像系統(tǒng)用于收集和量化圖像。

1.2.6qPCR RNA提取試劑盒(Takara,日本)提取經(jīng)不同濃度 (0、10、20、30 μmol/L) U0126處理后的DPC總RNA,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。定量聚合酶鏈反應(yīng)序列見表1。

表1 定量PCR引物序列表Tab.1 Real-time PCR primer sequences

1.2.7ELISA 根據(jù)試劑盒說明書測定不同濃度U0126處理DPC的培養(yǎng)基中TGF-β1(R&D,DB100B)、TGF-β2(R&D,DB250)、IGF-1(R&D,DG100B)和8-oxo-dG(R&D4380-096-K、4380-192-K)的濃度。通過Varioskan Flash檢測在450 nmol/L處光密度(OD)。

1.2.8透射電鏡 本實(shí)驗(yàn)分為四組,分別為對照組、自噬激活劑雷帕霉素(rapamycin, RPM) 組、RPM+U0126組和U0126組。RPM組和U0126組分別單獨(dú)用100 nmol/L RPM和20 μmol/L U0126 處理DPC 24 h,RPM+U0126組先用100 nmol/L RPM處理DPC 24 h后再用20 μmol/L U0126處理24 h。藥物處理DPC結(jié)束后采用胰酶消化法收集DPC,進(jìn)行固定、切片,再用透射電鏡(日立ht7800)進(jìn)行掃描。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)統(tǒng)一使用Microsoft Excel 2008 與 Graphpad Prism 8.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)采集、記錄、運(yùn)算與分析。差異比較采用one-way ANOVA分析,P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1U0126抑制DPC自噬 透射電鏡觀察U0126對自噬小體數(shù)的影響,結(jié)果顯示,與對照組相比,RPM顯著增多了DPC自噬小體數(shù);與RPM處理組相比,RPM+U0126處理組顯著減少了細(xì)胞內(nèi)的自噬小體(圖1a, 1d)。Western blot結(jié)果表明,與對照組相比,RPM顯著升高了LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值;與RPM處理組相比,RPM+U0126處理組的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值顯著降低(圖1b, 1c)。這些結(jié)果提示U0126抑制了DPC自噬。

Note:**P<0.01,***P<0.001 compared with the control;#P <0.05 compared with the RPM group. Transmission electron microscopy scanning of with U0126-treated and rapamycin-treated DPC, bar=500 μm;～ Western blot results of LC3-Ⅱ and LC3-Ⅰ in U0126-treated DPC; Number of autophagic vacuoles in Fig.1a圖1 U0126對DPC自噬的影響Fig.1 Changes of DPC autophagy after treated with U0126

2.2抑制自噬后DPC早衰表型變化 采用SA-β-gal、Transwell等方法評估抑制自噬后對DPC表型的影響。SA-β-gal結(jié)果顯示,20 μmol/L和30 μmol/L U0126處理DPC后,DPC衰老陽性率顯著增加(圖2a,2c)。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,經(jīng)U0126處理后DPC 遷移能力顯著降低(圖2b,2d)。Western blot和qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,經(jīng)U0126處理后衰老相關(guān)蛋白p16的表達(dá)顯著升高(圖2e～2g)。這些結(jié)果提示DPC自噬被抑制后出現(xiàn)早衰表型。

Note:*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001 when compared with the control group. The effect of U0126 on positive rate of DPC was detected by SA-β-gal, bar=200 μm; The effect of U0126 on cell migration was detected by transwell, bar=10 μm;The staining-positive DPC of SA-β-gal ; The color ration of transwell staining;～ Wes-tern blot results of p16 in U0126-treated DPC; The expression levels of p16 in U0126-treated DPC圖2 U0126對DPC早衰的影響Fig.2 U0126-treated DPC exhibit senescent phenotype

2.3抑制自噬后DPC分泌生物活性因子和毛囊生長周期因子的能力變化 與對照組相比,經(jīng)U0126處理的DPC中C-myc、Survivin的蛋白表達(dá)和mRNA水平顯著降低,此外還發(fā)現(xiàn)U0126處理DPC后視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白(retinoblastoma protein,Rb)的表達(dá)降低(圖3a～3c)。與對照組相比,經(jīng)U0126處理的細(xì)胞上清中IGF-1濃度顯著降低,TGF-β1和TGF-β2濃度顯著升高(圖3d)。這些結(jié)果提示DPC自噬被抑制后分泌影響毛囊生長周期因子的能力下降。

Note:*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001 when compared with the control group.～ Western blot results of C-myc, Survivin, Rbin U0126-treated DPC; qPCR results of C-myc, Survivin, Rbin U0126-treated DPC; ELISA analysis was used to determine the levels of IGF-1,TGF-β1 and TGF-β2 in the culture supernatant of U0126-treated DPC圖3 U0126對DPC分泌生物活性因子和毛囊生長周期因子能力的影響Fig.3 Effect of U0126 on the ability of DPC to secrete bioactive factors and hair follicle growth cycle factors

2.4抑制自噬后活性氧和DNA損傷的變化 為了驗(yàn)證U0126調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激過程,通過熒光探針DCFH-DA檢測細(xì)胞內(nèi)ROS水平變化。結(jié)果顯示,經(jīng)U0126處理后DPC內(nèi)ROS水平顯著升高(圖4a)。有證據(jù)證實(shí)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的DNA損傷是細(xì)胞衰老的驅(qū)動因素之一,因此,為了研究U0126處理后的細(xì)胞DNA損傷狀態(tài),通過ELISA分析目前公認(rèn)的用于評估DNA氧化損傷的生物標(biāo)志物8-oxo-dG變化,結(jié)果表明,經(jīng)U0126處理后DPC內(nèi)8-oxo-dG濃度顯著升高(圖4b)。

Note:*P<0.05 when compared with the control. ROS levels determined by the DCFH-DA fluorescence assay in U0126-treated DPC; Measurement of DNA oxidative damage using ELISA圖4 U0126對DPC ROS和DNA損傷的影響Fig.4 U0126 affects ROS and DNA oxidative damage in DPC

3 討論

衰老是一種生物學(xué)過程,其特征是細(xì)胞和功能的依賴性下降,導(dǎo)致生物體的質(zhì)量下降。衰老的細(xì)胞會在衰老的組織和器官中積累,從而損害包括再生在內(nèi)的生理過程,并導(dǎo)致機(jī)體衰老。細(xì)胞衰老可導(dǎo)致前列腺癌、肺癌、肝癌等疾病的發(fā)生,還可能加速雄激素脫發(fā)疾病的進(jìn)程。

許多證據(jù)表明自噬的調(diào)節(jié)已成為不同物種衰老的一個特征。自噬底物以及受損的自噬調(diào)節(jié)對組織穩(wěn)態(tài)的時(shí)間和空間影響方面的進(jìn)展研究揭示了自噬與衰老之間的復(fù)雜和多因素關(guān)系[9]。由于自噬可以去除與衰老相關(guān)的受損細(xì)胞成分,這一過程在延緩衰老和衰老相關(guān)疾病方面發(fā)揮著重要作用。目前已有研究證實(shí)自噬通過氧化應(yīng)激減少DPC炎癥[10],自噬也可延緩雄激素誘導(dǎo)的DPC凋亡[11]。有證據(jù)表明,自噬在調(diào)節(jié)衰老中也有直接作用,比如抑制自噬加速了血管衰老[12],自噬激活劑誘導(dǎo)了乳腺癌細(xì)胞衰老[13]。因此,本研究為了驗(yàn)證自噬與DPC早衰之間的關(guān)系,選用U0126處理DPC建立自噬模型。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與自噬激活劑組相比,經(jīng)U0126處理的DPC組自噬小體數(shù)和自噬相關(guān)蛋白表達(dá)降低,表明U0126在DPC中成功建立自噬抑制模型。本研究抑制DPC自噬后發(fā)現(xiàn)SA-β-gal衰老陽性率和衰老相關(guān)蛋白p16的表達(dá)增加,細(xì)胞遷移能力降低,這些結(jié)果提示U0126促進(jìn)了DPC早衰。

DPC早衰主要表現(xiàn)為非凝集性生長,細(xì)胞增殖能力下降或喪失,維持毛囊特性等因子表達(dá)減弱或喪失。具有凝集性生長的DPC分泌高水平的生長因子,如Survivin、C-myc,以維持其生長特性。本研究的結(jié)果發(fā)現(xiàn)DPC自噬被抑制后降低了Survivin和C-myc的表達(dá)。TGF-β信號是毛囊發(fā)育所必需的,DPC分泌的TGF-β1和TGF-β2可促進(jìn)毛囊向退行期轉(zhuǎn)變[14]。IGF-1是一種多功能調(diào)節(jié)生長因子,控制DPC增殖和毛囊干細(xì)胞的存活。DPC自噬被抑制后降低了分泌IGF-1的能力,增強(qiáng)了分泌TGF-β1和TGF-β2的能力,這使得毛囊生長周期縮短。這些結(jié)果提示抑制自噬導(dǎo)致DPC降低了誘導(dǎo)毛囊生長的能力。因此,進(jìn)一步明確自噬失調(diào)促進(jìn)DPC早衰的作用機(jī)制對于開發(fā)安全有效的藥物具有十分重要的意義。

自噬失調(diào)驅(qū)動衰老主要通過氧化應(yīng)激途徑,也就是線粒體功能障礙后過度產(chǎn)生ROS的過程。近期有研究發(fā)現(xiàn)肌醇1,4,5-三磷酸受體和電壓依賴性陰離子選擇通道蛋白之間相互作用的增加導(dǎo)致粒體過度產(chǎn)生ROS從而驅(qū)動DPC早衰[15]。為了探討抑制自噬后DPC是否也通過氧化應(yīng)激途徑驅(qū)動早衰,本研究檢測了經(jīng)U0126處理后DPC內(nèi)ROS和DNA損傷,發(fā)現(xiàn)抑制自噬后DPC內(nèi)ROS水平及DNA損傷程度增加,由此說明自噬失調(diào)驅(qū)動的DPC早衰與超過其生理抗氧化能力的ROS過度積累密切相關(guān)。

綜上所述,本研究初步探討了抑制自噬對DPC早衰的影響,發(fā)現(xiàn)自噬失調(diào)通過氧化應(yīng)激途徑促進(jìn)了DPC早衰。了解抑制自噬誘導(dǎo)的DPC早衰的機(jī)制有望為AGA治療提供新的策略,最大限度地減少暴露于雙氫睪酮(DHT)水平升高的DPC衰老。