樹突狀細胞(DCs)交叉遞呈疫苗抗原分子途徑研究進展

楊蘇珍,劉運超,尚延麗,張改平,2,3*

(1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 動物免疫學(xué)重點實驗室,河南 鄭州 450002;2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 牧醫(yī)工程學(xué)院,河南 鄭州 450000;3.江蘇高校動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇 揚州 225009)

探索抗原遞呈和免疫應(yīng)答的分子機制,研制安全、高效的豬用疫苗和佐劑,做好豬病防控對穩(wěn)定生豬養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展和肉類食品供應(yīng)具有重要意義。理想的疫苗應(yīng)該在保證安全的前提下,同時激活體液免疫反應(yīng)和細胞免疫反應(yīng),進而產(chǎn)生快速而持續(xù)的免疫保護。疫苗免疫動物機體后通過固有免疫系統(tǒng)和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)做出免疫應(yīng)答,起到免疫保護作用。固有免疫系統(tǒng)包括單核/巨噬細胞、天然殺傷細胞(NK)、樹突狀細胞(dendritic cells,DCs)、粒細胞和先天類T細胞等。這些免疫細胞在激活后可直接執(zhí)行免疫清除作用或通過分泌細胞因子,如IFN-g等,在刺激體液免疫應(yīng)答和免疫調(diào)控中發(fā)揮重要作用。DCs是專職抗原遞呈細胞(antigen presenting cells,APC),能有效地誘導(dǎo)CD8+T淋巴細胞的免疫應(yīng)答。通常,外源抗原經(jīng)過DC細胞遞呈的MHCⅡ途徑可激活體液免疫應(yīng)答,經(jīng)過交叉遞呈MHCⅠ途徑,外源抗原能夠激活細胞毒性T淋巴細胞( cytotoxic T lymphocytes,CTL)起到清除感染細胞的作用?，F(xiàn)從疫苗設(shè)計角度對豬樹突狀細胞(DCs)介導(dǎo)的交叉遞呈外來抗原的分子機制進行綜述。

1 DCs介導(dǎo)的抗原交叉遞呈概述

DCs是目前已知功能最強大的APC,它能高效地攝取、加工處理和遞呈抗原,成熟DCs能有效激活初始T細胞,處于啟動、調(diào)控、并維持免疫應(yīng)答的中心環(huán)節(jié)[1]。通常情況下,內(nèi)源性抗原,如病毒感染宿主細胞產(chǎn)生的病毒抗原以及細胞基因突變后產(chǎn)生的腫瘤抗原等,被DCs攝取后進入主要組織相容性復(fù)合體Ⅰ(major histocompatibility complexⅠ,MHCⅠ)遞呈途徑,刺激CD8+T細胞活化,成為細胞毒性T淋巴細胞(CTL),直接參與病毒清除。外源性抗原,如滅活疫苗和亞單位疫苗中的蛋白抗原,經(jīng)DCs處理后通常會通過主要組織相容性復(fù)合體Ⅱ(major histocompatibility complexⅡ,MHCⅡ)遞呈途徑,結(jié)合MHCⅡ的多肽抗原可以被抗原特異性CD4+T細胞識別,激活輔助性T細胞(helper T cells,Th),啟動B細胞免疫應(yīng)答[2]。但是,在某些情況下,外源性抗原可以進入MHCⅠ類分子遞呈途徑,激活CD8+T細胞,啟動CTL反應(yīng),這一遞呈途徑被稱為抗原交叉遞呈(cross-presentation)[3]。交叉遞呈對外源性抗原激活CTL,促進B細胞和T細胞免疫協(xié)同應(yīng)答,進而引發(fā)抗腫瘤、抗病毒免疫反應(yīng)有重要意義。

抗原通過經(jīng)典的抗原遞呈途徑和交叉遞呈會分別啟動不同的免疫應(yīng)答模式,兩種遞呈途徑的分子機制也存在較大差異[4]。經(jīng)典MHCⅡ抗原遞呈途徑,內(nèi)化的抗原分子在內(nèi)體(endosome)或溶酶體內(nèi)被蛋白酶(如組織蛋白酶)降解成多肽。新合成的MHCⅡ分子通過與不變鏈(invariant chain,Ii,CD74)結(jié)合保持穩(wěn)定,并從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)被轉(zhuǎn)運到內(nèi)體或溶酶體隔室,Ii被溶酶體內(nèi)蛋白酶降解為CLIP(與MHC類分子穩(wěn)定相聯(lián)的最小的Ii片段),MHCⅡ分子與CLIP結(jié)合。隨后,來自于抗原加工的多肽在伴侶蛋白HLA-DM(human leukocyte antigen DM)的協(xié)助下取代CLIP與MHCⅡ結(jié)合,進而展示在細胞表面,激活Th細胞,主要參與B細胞免疫應(yīng)答[5-6]。在交叉遞呈途徑,外源性抗原通過進入細胞后以另一種方式進行加工和遞呈,激活CD8+T細胞免疫應(yīng)答。

許多細胞能夠遞呈外源抗原到MHCⅠ類分子激活CD8+T淋巴細胞,但DCs是最主要的交叉呈遞細胞[8]。DCs分為傳統(tǒng)的DCs(classic or tissue-resident DCs,cDCs)和漿細胞樣DCs(plasmacytoid DCs,pDCs),cDCs進一步被分為cDC1和cDC2[9]。在小鼠和人體內(nèi),cDC1以趨化因子受體XCR1的表達為特征,其發(fā)育依賴于轉(zhuǎn)錄因子IRF8和Batf3的表達,而cDC2的發(fā)育主要受IRF4的調(diào)控[10]。cDC1被認為是一種高效的交叉呈遞細胞,小鼠cDC1表達CD8(在淋巴組織中)或CD103(在非淋巴組織中),而人類cDC1表達BDCA-3(CD141)。因此,在小鼠淋巴組織中,和細胞相關(guān)的可溶性抗原通過駐留在淋巴組織的CD8+DCs交叉遞呈,而在肺、腸道和皮膚的抗原則通過遷移的CD103+DCs實現(xiàn)交叉遞呈[11]。

單核細胞來源的DCs(monocyte-derived DCs,MoDCs)也稱為炎性DCs,在疫苗刺激的獲得性免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。在動物的外周血、肌肉和皮下組織中含有大量的單核細胞,這些單核細胞可以分化為向CD4+和CD8+T細胞呈遞抗原的MoDCs[12]。在缺乏炎癥的情況下,腸道、肌肉和皮膚等外周組織中也發(fā)現(xiàn)了MoDCs,研究顯示MoDCs表達轉(zhuǎn)錄因子ZBTB46[13]。在病原體誘導(dǎo)或疫苗接種的情況下,募集到炎癥部位的單核細胞原位分化成表達CD11c、MHCⅡ/Ⅰ等的MoDCs,發(fā)揮抗原遞呈或交叉遞呈作用,啟動獲得性免疫應(yīng)答反應(yīng)[14]。MoDCs可以進行交叉遞呈和MHCⅡ限制性遞呈,并且可以根據(jù)炎癥環(huán)境誘導(dǎo)Th1、Th2或Th17應(yīng)答[15]。有研究顯示,在疫苗接種環(huán)境中,MoDCs促進抗原特異性T細胞產(chǎn)生和濾泡輔助性T細胞分化,在特異性免疫應(yīng)答和免疫記憶中發(fā)揮重要作用[16]。在體外,血液中的單核細胞在粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor,GM-CSF)和白細胞介素4(IL-4)的共同刺激下分化成MoDCs,表面標志物為CD1、CD14、CD16、CD80/86、CD1721、MHCⅠ和MHCⅡ等[12,17]。高效的疫苗能夠通過誘導(dǎo)交叉遞呈同時激活T細胞免疫應(yīng)答和B細胞免疫應(yīng)答,充分理解DCs介導(dǎo)的交叉遞呈分子機制,對理解疫苗的起效機制,開發(fā)高效的豬用疫苗和佐劑具有重要的指導(dǎo)意義。

2 MoDCs交叉遞呈外源性抗原的途徑

交叉遞呈外源性抗原的分子途徑主要有內(nèi)體-胞質(zhì)途徑(endosome-to-cytosol pathway)、液泡途徑(vacuolar pathway),以及縫隙連接途徑(gap junction pathway)[18]。

2.1 內(nèi)體-胞質(zhì)途徑內(nèi)體-胞質(zhì)途徑是最早被發(fā)現(xiàn)的抗原交叉遞呈途徑,顆粒性抗原通過巨噬細胞誘導(dǎo)的CD8+T細胞反應(yīng)依賴于蛋白酶體、抗原加工相關(guān)轉(zhuǎn)運體(transporter associated with antigen processing,TAP)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基體轉(zhuǎn)運通路,但是不依賴溶酶體[19-20]。這一通路也參與可溶性抗原的交叉遞呈[21]。在內(nèi)體-胞質(zhì)途徑中,外源抗原被DCs內(nèi)化形成吞噬泡,吞噬泡與早期內(nèi)體融合,抗原在轉(zhuǎn)運復(fù)合體SEC61協(xié)助下從內(nèi)體轉(zhuǎn)運到細胞質(zhì)溶液中,并在細胞質(zhì)內(nèi)被蛋白酶降解成多肽[22]。事實上,在抗原由內(nèi)體轉(zhuǎn)運到胞質(zhì)之前先進行了去蛋白折疊和部分水解?？乖坏┒ㄎ挥诎|(zhì)內(nèi),就會被泛素化進而靶向蛋白酶體。隨后,這些多肽被TAP轉(zhuǎn)運到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或者回到內(nèi)體,并在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或內(nèi)體中被裝載到MHCⅠ,隨后MHCⅠ多肽復(fù)合體被轉(zhuǎn)運到DCs表面[23]。被轉(zhuǎn)運到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的多肽在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與MHCⅠ結(jié)合,隨后經(jīng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基體途徑轉(zhuǎn)運到高爾基體,并從高爾基體轉(zhuǎn)運到細胞膜。但是被轉(zhuǎn)運回到內(nèi)體的多肽在內(nèi)體與來自內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的MHCⅠ結(jié)合,并最終被轉(zhuǎn)運到細胞膜(圖1)[24]。盡管有大量證據(jù)顯示,某些抗原確實可以不依賴于蛋白酶降解和TAP介導(dǎo)的肽轉(zhuǎn)運而通過液泡途徑進行抗原交叉遞呈,但是大部分的交叉遞呈都是通過內(nèi)體-胞質(zhì)途徑實現(xiàn)的[25]。

A.MoDC細胞經(jīng)液泡途徑交叉遞呈抗原示意圖;B.MoDC細胞經(jīng)內(nèi)體-胞質(zhì)途徑交叉遞呈抗原示意圖

2.2 液泡途徑除了內(nèi)體-胞質(zhì)途徑,還存在另一種對蛋白酶抑制劑和TAP抑制劑不敏感的途徑,不依賴于胞質(zhì)的抗原降解活性,即液泡途徑。在液泡途徑中,抗原被DCs吞噬,進入內(nèi)體,隨后在內(nèi)體中被組織蛋白酶(cathepsin S,Cat S)降解成短肽片段,短肽片段被裝載到細胞表面的MCHⅠ,最后MCHⅠ-多肽復(fù)合體通過早期內(nèi)體相關(guān)的液泡轉(zhuǎn)運到DCs表面?？乖募庸ず脱b載于MHCⅠ分子發(fā)生在內(nèi)體或溶酶體區(qū)。在液泡途徑中,由于內(nèi)體和蛋白酶體的水解作用能夠被亮抑蛋白酶肽(leupeptin)、半胱氨酸蛋白酶抑制劑E-64和蛋白酶抑制劑Z-FA-FMK所抑制,因此這種水解作用被認為是半胱氨酸酶在發(fā)揮作用,尤其是Cat S;相反,蛋白酶抑制劑胃蛋白酶A對液泡交叉遞呈的影響很小[3]。液泡途徑在顆粒性抗原和細胞相關(guān)抗原的交叉遞呈中發(fā)揮重要作用,包括那些重組融合蛋白、多聚物修飾形成的聚合蛋白和VLPs等,以及非顆粒性抗原,如OVA抗原和腫瘤來源的多肽抗原等[11]。隨著豬瘟E2蛋白亞單位疫苗、豬偽狂犬亞單位疫苗和口蹄疫病毒病毒樣顆粒疫苗等通過上市或臨床試驗審批,基因工程亞單位疫苗成為未來豬病疫苗的一個重要研發(fā)方向,深入研究抗原交叉遞呈的液泡途徑對開發(fā)新型豬用基因工程亞單位疫苗具有重要意義。

2.3 縫隙連接途徑另有一種研究較少的交叉遞呈途徑,縫隙連接途徑(gap junction pathway),受病毒感染或者病變細胞的抗原多肽分子通過縫隙連接進入DCs的胞質(zhì),并被轉(zhuǎn)運到粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與MHCⅠ結(jié)合,隨后被轉(zhuǎn)運到細胞表面[26]。細胞間的縫隙連接由高度有序化的Cx43組成,是重要的細胞通訊方式,允許細胞間各種分子交換,縫隙連接途徑主要遞呈來自相鄰細胞的抗原[27]。

DCs交叉遞呈激活CTL的過程對抗病毒和抗腫瘤免疫治療至關(guān)重要,抗原交叉遞呈能夠激活抗原特異性CTL,這些CTL向感染部位遷移后具備殺死潛在靶細胞的能力,例如病毒感染細胞和腫瘤細胞。在當前生豬養(yǎng)殖業(yè)面臨巨大疫病防控壓力的情況下,利用豬抗原交叉遞呈的分子機制或為非洲豬瘟等重大動物疫病疫苗設(shè)計的關(guān)注點。

3 影響抗原遞呈的因素

DCs的交叉遞呈存在多種機制,抗原進入DCs方式和抗原在內(nèi)體的定位是影響抗原交叉遞呈的重要因素。DCs內(nèi)吞抗原是抗原遞呈的開始,內(nèi)吞效率在免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)中扮演重要角色。不同的內(nèi)吞機制決定了抗原降解的差異,導(dǎo)致抗原遞呈效率差異。研究顯示,用來內(nèi)化抗原的內(nèi)吞作用受體決定了抗原的內(nèi)吞路線和降解途徑[28]。由胞飲作用或清道夫受體介導(dǎo)的抗原內(nèi)化后迅速靶向溶酶體,被溶酶體蛋白酶有效降解,導(dǎo)致抗原交叉遞呈降低。然而,如果由DCs通過甘露糖受體(mannose receptor,MR)內(nèi)化相同的抗原,則其靶向的是一個不同的早期內(nèi)體池,這些內(nèi)體不與溶酶體快速融合,且抗原在內(nèi)體中受到保護不被降解,從而導(dǎo)致甘露糖受體內(nèi)化抗原的有效交叉遞呈[29]。

3.1 抗原進入DCs的方式抗原進入DCs的方式對抗原遞呈有著重要的影響。通常情況下,細胞的內(nèi)吞作用可以分為吞噬作用(phagocytosis)和胞飲作用(pinocytosis)。在哺乳動物中有3種白細胞具有吞噬作用,它們是巨噬細胞、嗜中性粒細胞(neutrophils)和DCs,這些細胞能通過吞噬作用吞噬侵入機體的病原微生物。胞飲作用發(fā)生在幾乎所有的真核細胞中,是一種快速的內(nèi)吞作用。細胞胞飲作用的內(nèi)吞機制可以分為4種:(1)網(wǎng)格蛋白型內(nèi)吞途徑(clathrin-dependent endocytosis,CDE);(2)小窩蛋白依賴的內(nèi)吞途徑(caveolae-dependent endocytosis,CaDE);(3)網(wǎng)格蛋白、小窩蛋白非依賴型內(nèi)吞途徑(the non-clathrin-,non-caveolae-dependent pathways)和(4)巨胞飲作用(macropinocytosis)[30]。藥理阻斷是研究細胞內(nèi)吞作用的常用方法,許多藥物可以阻斷細胞內(nèi)吞作用,針對細胞內(nèi)吞方式的認知主要來自藥物阻斷的研究成果。氯丙嗪 (chlorpromazine,CPZ)可引起網(wǎng)格蛋白網(wǎng)絡(luò)在內(nèi)體膜上的組裝并阻止細胞內(nèi)表面上的被膜小窩組裝,進而抑制網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用,因此常被用來研究網(wǎng)格蛋白在某種抗原內(nèi)吞過程中的作用[31]。同樣,甲基-β-環(huán)糊精(MβCD)、制霉菌素等可通過減少或隔離膽固醇抑制脂筏/胞膜窖介導(dǎo)的內(nèi)吞作用[32];鹽酸阿米洛利(amiloride)可通過抑制Na+/H+交換,進而抑制巨胞飲作用[33];細胞松弛素D(cytochalasin D)可通過抑制肌動蛋白的聚合反應(yīng),從而抑制吞噬作用和巨胞飲作用;Dynamin作為一種GTPase對包括CDE、CaDE以及網(wǎng)格蛋白和小窩蛋白獨立的內(nèi)吞作用途徑都是必不可少的,而Dynasore(C18H14N2O4)可通過抑制動力蛋白Ⅰ和Ⅱ的GTP酶活性抑制Dynamin依賴的內(nèi)吞途徑[33]。不同種類的抗原,甚至同一類抗原因聚集形態(tài)、電荷分布等的差異也會引起內(nèi)吞方式和效率的不同,進而引起交叉遞呈和免疫應(yīng)答的差異。

3.2 抗原在DCs的定位抗原在DCs的定位對抗原遞呈有著重要的影響。內(nèi)體是抗原的儲藏室,抗原在內(nèi)體的穩(wěn)定性以及內(nèi)體本身的穩(wěn)定性都對抗原遞呈和免疫應(yīng)答強度有著重要的影響。內(nèi)體是細胞內(nèi)吞作用運載途徑的一個區(qū)室,提供了細胞外物質(zhì)進入細胞內(nèi)的運載途徑[34]。很多病毒抗原首先與細胞膜吸附,其后被細胞內(nèi)吞囊泡包裹進入細胞與內(nèi)體融合,進入抗原遞呈途徑。不同時期內(nèi)體的超微結(jié)構(gòu)、密度、pH、所含酶類、MHC分子濃度存在差異。根據(jù)細胞內(nèi)吞作用的不同時間階段,可以將內(nèi)體分為早期內(nèi)體(early endosome)、晚期內(nèi)體(late endosome)以及再循環(huán)體(recycling endosome)。一旦在內(nèi)吞作用中的囊泡被釋放,它們首先與初級內(nèi)體融合,之后再成長為次級內(nèi)體并與溶酶體融合。初級內(nèi)體成長形成次級內(nèi)體,其酸度通過V-ATPase的活動而增加,其大小通過融合同類型的內(nèi)體成為更大的囊泡而增加,次級內(nèi)體或以多泡體(multivesicularbody,MVB)的形式呈現(xiàn)。最終,次級內(nèi)體釋放RAB5而獲取RAB7,為其與溶酶體的融合做好準備[35]。早期內(nèi)體包含囊泡-小管網(wǎng)絡(luò),囊泡的直徑可大至1 μm,周圍連接著直徑大約50 nm的小管。標記物包括運鐵蛋白RAB5,RAB4和它的運鐵蛋白受體以及EEA1。晚期內(nèi)體也被稱為多泡體,形態(tài)為球形,管狀結(jié)構(gòu)較少,主要包含密集的空腔狀囊泡,標記物包括RAB7,RAB9以及M6P受體[3]。再循環(huán)內(nèi)體主要集中在微管組織中心,包含管網(wǎng)結(jié)構(gòu),標記物為RAB11。

3.3 抗原的駐留時間抗原的降解過程影響抗原交叉遞呈效率?？乖目焖俳到鈺诳乖贿m當?shù)募庸ず脱b載到MHCⅠ之前其表位被迅速而大量的破壞[36]。此外,負載多肽的MHCⅠ分子在細胞膜上的壽命有限,因此,使DCs在向淋巴結(jié)遷移后能夠持續(xù)而高效的活化T細胞,持續(xù)的向DCs表面轉(zhuǎn)運MHCⅠ抗原復(fù)合物,同時延長復(fù)合物在DCs表面展示的時間對CTL激活非常重要[37]。在小鼠的CD8a+DCs中,轉(zhuǎn)錄因子EB(transcription factor EB,TFEB)可以促進溶酶體的成熟和溶酶體蛋白酶活化,是交叉遞呈的重要負向調(diào)控因子。因此,APC中限制抗原降解可能是一種產(chǎn)生細胞內(nèi)抗原庫的機制[38]。這種機制確保了抗原庫(溶酶體或內(nèi)體)中的抗原可以被持續(xù)加工和呈遞,進而保證負載多肽的MHCⅠ分子在細胞表面較長時間的存在,保證對T細胞的連續(xù)刺激。這種細胞內(nèi)抗原儲存庫也出現(xiàn)在人類單核細胞中,這些長肽段抗原可以在單核細胞的非溶酶體間室中積累超過5 d而不會迅速降解[39]。

4 展望

我國養(yǎng)豬業(yè)的疫情防控形勢復(fù)雜嚴峻,新型疫苗研發(fā)如火如荼,但目前對疫苗抗原分子交叉遞呈途徑研究的針對性和系統(tǒng)性不足,導(dǎo)致T細胞疫苗研究缺乏理論指導(dǎo)和技術(shù)支撐,影響疫苗免疫效力的提升和新型疫苗產(chǎn)品的開發(fā)。隨著外源性抗原交叉遞呈分子途徑及相關(guān)影響因素研究的深入,對于疫苗抗原經(jīng)MoDC細胞交叉遞呈的途徑和影響T細胞免疫激活相關(guān)因素的認知逐漸豐富,為疫苗T細胞免疫效力提升和新型亞單位疫苗的開發(fā)提供了新的思路。DCs交叉遞呈異源抗原分子是疫苗抗原啟動T細胞免疫應(yīng)答的主要途徑,深入理解抗原交叉遞呈分子機制和影響因素,對設(shè)計T細胞疫苗抗原,促進疫苗在誘發(fā)體液免疫和細胞免疫方面的協(xié)調(diào)作用,具有重要的指導(dǎo)意義。近年來,豬細小病毒病毒樣顆粒疫苗(PPV VLPs)[40-41]、豬圓環(huán)病毒(PCV)亞單位疫苗、犬細小病毒[42]和禽法氏囊病毒亞單位疫苗[43]等新型亞單位疫苗的研究發(fā)展迅速,開展疫苗抗原交叉遞呈途徑的探索性研究對高效疫苗抗原設(shè)計和疫苗產(chǎn)品開發(fā)具有重要指導(dǎo)意義。