mRNA疫苗
——一種新的疫苗策略

王佳敏,時小雙,杜壽文,李樂天,李 昌*,金寧一*

(1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 動物科技學(xué)院,黑龍江 大慶 163319;2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 長春獸醫(yī)研究所,吉林 長春 130122)

1990年,WOLFF等[1]將通過體外轉(zhuǎn)錄獲得的mRNA,注射到小鼠體內(nèi),檢測后發(fā)現(xiàn),mRNA在小鼠體內(nèi)具有表達活性,能夠產(chǎn)生相關(guān)蛋白且具有劑量依賴性。通過直接注射mRNA可以使機體表達特定蛋白,從而產(chǎn)生相應(yīng)的免疫反應(yīng),由此mRNA療法進入到人們的視線中。

在隨后十多年的研究中,研究人員通過動物試驗驗證了mRNA可以發(fā)揮類似疫苗的作用,從而達到治療目的[2-4]。但受限于當(dāng)時不成熟的技術(shù),mRNA穩(wěn)定性、藥物遞送、安全性等方面的進一步研究陷入了瓶頸,大多數(shù)研究者認為mRNA疫苗技術(shù)是“科學(xué)上的一潭死水”,將目光轉(zhuǎn)向DNA和替代蛋白領(lǐng)域,mRNA技術(shù)逐漸淡出主流。

隨著生物技術(shù)的發(fā)展,mRNA合成、修飾和遞送技術(shù)也隨之進步,一些研究團隊看到了這項技術(shù)的巨大潛力,組建了專門開發(fā)基于mRNA疫苗的生物技術(shù)公司。2019年,新冠疫情暴發(fā)后,Moderna、BioNTech等公司便開始用這一技術(shù)快速研制新冠肺炎疫苗。與傳統(tǒng)疫苗相比,mRNA疫苗具有更高的安全性,不向宿主細胞中插入基因,可以被正常細胞降解,且通過調(diào)節(jié)mRNA的修飾和遞送載體可以延長其半衰期[5-8]。更重要的是,傳統(tǒng)疫苗在應(yīng)對新發(fā)傳染病時存在缺陷,也無法治療癌癥。而mRNA 疫苗利用目的蛋白的核酸序列編碼信使 RNA,再經(jīng)由特定的遞送系統(tǒng)使細胞攝取并表達編碼的目的蛋白,從而激活機體的體液和細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng),可以迅速研發(fā)疫苗并投入使用。

1 mRNA類型與體外轉(zhuǎn)錄

mRNA疫苗中的mRNA通常以含有目的蛋白開放閱讀框(open reading frame,ORF)的質(zhì)粒DNA或其他DNA片段為模板,通過體外轉(zhuǎn)錄技術(shù)合成獲得[9]。在mRNA疫苗中,體外轉(zhuǎn)錄(invitrotranscribed,IVT)mRNA通過編碼抗原蛋白誘導(dǎo)宿主的體液免疫反應(yīng)和細胞免疫反應(yīng)。IVT mRNA的結(jié)構(gòu)同真核細胞自有的內(nèi)源性mRNA結(jié)構(gòu)相似[10],盡管線性mRNA是IVT mRNA的代表性結(jié)構(gòu),但基于不同的目的蛋白表達模式還設(shè)計了新類型的mRNA結(jié)構(gòu),包括:自擴增型mRNA(self-amplifying mRNA,SAM)和環(huán)狀mRNA(circ mRNA)[11-12]。

線性IVT mRNA結(jié)構(gòu)類似于內(nèi)源性mRNA,由5′端帽子結(jié)構(gòu)、5′端非翻譯區(qū)(5′UTR)、開放閱讀框(ORF)、3′端非翻譯區(qū)(3′UTR)和3′端的Poly A尾結(jié)構(gòu)組成。在mRNA的5′端有1個5′帽子結(jié)構(gòu),天然內(nèi)源性mRNA有1個7-甲基鳥苷帽結(jié)構(gòu),與5′-三磷酸橋相連。5′帽子結(jié)構(gòu)對翻譯起始至關(guān)重要,因為真核翻譯起始因子4E(eIF4E)與mRNA的5′帽子結(jié)合。mRNA衰變酶如DCP1、DCP2和DCPS也與5′端結(jié)合,以調(diào)節(jié)mRNA衰變。Poly A尾調(diào)節(jié)mRNA的穩(wěn)定性和翻譯效率[13]。此外,在真核生物中,許多高表達的基因被發(fā)現(xiàn)有1個短的Poly A尾,這似乎與mRNA的尾部修剪有關(guān),以形成閉環(huán)[14]。有趣的是,1個5′端帽子和1個Poly A尾協(xié)同工作,形成閉環(huán)RNA結(jié)構(gòu)。在閉環(huán)RNA模型中,mRNA的兩端通過轉(zhuǎn)錄起始因子和聚A結(jié)合蛋白(PABP)相互作用。因此,可以保護mRNA免受酶降解,并促進核糖體的重新進入[15]。

自擴增mRNA(SAM)包括α病毒的RNA復(fù)制機制,能夠以較低的mRNA疫苗劑量實現(xiàn)高水平的抗原蛋白表達[16]。SAM與線性IVT mRNA之間的主要區(qū)別在于插入了非結(jié)構(gòu)基因以產(chǎn)生RNA依賴性RNA聚合酶,通常使用甲病毒的非結(jié)構(gòu)基因(nsP1-4)[17-18]。當(dāng)機體注射SAM時,SAM可以在細胞中自我擴增并誘導(dǎo)高水平的靶蛋白表達,且不會產(chǎn)生病毒結(jié)構(gòu)蛋白。因此即使接種劑量低于傳統(tǒng)線性mRNA,理論上SAM也可以產(chǎn)生相當(dāng)?shù)拿庖叻磻?yīng)[19]。此外,自擴增mRNA由于其固有的佐劑作用,特別適合用于mRNA疫苗開發(fā)。 在細胞自我擴增的過程中,會形成1個短暫的雙鏈 mRNA (dsRNA) 結(jié)構(gòu),觸發(fā)模式識別受體 (PRR)。 這會在宿主體內(nèi)產(chǎn)生強烈的抗原特異性免疫反應(yīng)[10,20]。過去,利用病毒載體合成自擴增型mRNA 作為疫苗[21-22]。后來,科學(xué)家們使用脂質(zhì)納米顆粒 (LNP) 進行自擴增型mRNA 的非病毒遞送[23-24]。最近,用于SARS-CoV-2疫苗的自擴增型mRNA已研發(fā)成功,在小鼠的免疫中顯示可誘導(dǎo)高抗體水平[25]。自擴增型mRNA 可以像線性IVT mRNA一樣用于 mRNA 疫苗生產(chǎn),許多臨床和臨床前自擴增型mRNA疫苗研究目前正在進行中[16,26]。然而,人們一直擔(dān)心自擴增型mRNA的安全性問題。由于其固有的佐劑作用,難以控制自擴型mRNA的免疫調(diào)節(jié)特性,需要進一步地研究通過PRR所觸發(fā)的先天免疫反應(yīng)。使用反式擴增RNA (taRNA)的二分載體系統(tǒng)可能會提供解決這些問題的方案[27]。

環(huán)狀RNA是一種天然內(nèi)源性RNA,其翻譯的蛋白質(zhì)在動物體內(nèi)發(fā)揮重要的生命作用。環(huán)狀mRNA由于缺乏可以被外切酶識別的自由端,其在細胞中存活的時間比線性mRNA要長得多[28-29]。因此,研究人員開發(fā)了一種環(huán)狀I(lǐng)VT mRNA,提高mRNA的穩(wěn)定性,解決線性IVT mRNA半衰期短的問題[12]。通常使用自剪接內(nèi)含子的核酶實現(xiàn)外援IVT mRNA的環(huán)化[30]。在置換內(nèi)含子-外顯子 (PIE) 中存在的外顯子片段 E1 和 E2 之間插入內(nèi)部核糖體進入位點 (IRES) 和目的蛋白的基因序列[12]。與線性mRNA相比,環(huán)狀mRNA在更長的時間內(nèi)表現(xiàn)出穩(wěn)定的蛋白質(zhì)表達水平,證實其穩(wěn)定性增強[12]。然而,環(huán)狀mRNA的產(chǎn)量較低,仍需要對其進行進一步的研究。

2 mRNA疫苗制備過程

開發(fā)mRNA疫苗包括兩個部分,一是制備IVT mRNA;二是選擇合適的mRNA疫苗遞送系統(tǒng)。制備IVT mRNA的一般過程包括:抗原選擇、線性DNA模板合成、體外轉(zhuǎn)錄和mRNA純化這4個步驟。在對病原體的基因組進行測序后選擇目標抗原時,將其插入質(zhì)粒 DNA 模板中。生產(chǎn) DNA 模板應(yīng)包含抗原序列、5′和3′ UTR以及5′UTR上游的T7啟動子。 體外轉(zhuǎn)錄過程需要 DNA 模板、修飾或未修飾的核苷和 T7 RNA 聚合酶。 對于DNA模板,通常使用線性化的質(zhì)粒DNA或PCR產(chǎn)物。對于體外轉(zhuǎn)錄,主要使用T7 RNA聚合酶。 然而,一些研究也使用了T3或SP6 RNA聚合酶。 T7 RNA聚合酶識別DNA 模板的T7啟動子并啟動 mRNA 的轉(zhuǎn)錄。IVT mRNA的5′帽子可以通過兩種方式產(chǎn)生。一種是在體外轉(zhuǎn)錄過程中通過加帽類似物一步制備;另一種是在mRNA體外轉(zhuǎn)錄后通過酶促反應(yīng)加帽反應(yīng)合成。同樣,IVT mRNA的Poly A尾可以通過兩種不同的方法合成。 使用多聚A聚合酶的酶促加尾方法已被廣泛用于產(chǎn)生Poly A尾。然而,這種方法的缺點是poly A尾的長度在產(chǎn)生的IVT mRNA中不均勻[10,15]。

在體外轉(zhuǎn)錄后,必須進行純化以獲得全長的 IVT mRNA。DNA 模板通過DNase去除,如果需要,可以去除未加帽mRNA的免疫原性5′ ppp并通過磷酸酶轉(zhuǎn)化為5′-OH mRNA[31]。此外,通過高效液相色譜 (HPLC) 去除dsRNA,這些dsRNA是在體外轉(zhuǎn)錄過程中產(chǎn)生的,它們具有高度的免疫刺激性。因此,用 HPLC去除dsRNA會增加抗原蛋白的整體表達并減少過度的免疫反應(yīng)[32]。然而,用HPLC純化的問題是使用有機溶劑,如乙腈,而且工藝成本高。使用HPLC純化IVT mRNA需要花費大量時間,最終產(chǎn)率僅為50%左右。到目前為止,大規(guī)模生產(chǎn)IVT mRNA的最大問題是純化步驟[33]。

mRNA疫苗只有穿過帶負電荷的細胞膜并進入到細胞質(zhì)中才能發(fā)揮作用, 而mRNA分子較大且?guī)ж撾姾?不能通過被動擴散進入到細胞質(zhì)中,需要借助載體系統(tǒng)才能進入到細胞內(nèi),因此遞送載體對于mRNA疫苗非常重要,理想的遞送載體要保護mRNA免受酶的降解,可以被靶細胞特異性識別并攝取,進入細胞質(zhì)后能夠及時從內(nèi)體中釋放出來。mRNA疫苗的遞送載體包括病毒載體和非病毒載體兩種:病毒載體以慢病毒、腺病毒相關(guān)病毒[34]和仙臺病毒[35]等為主,病毒載體在進行核酸遞送的同時也可能會引起免疫反應(yīng),從而影響疫苗的效果[36];非病毒載體主要包括脂質(zhì)體、樹突狀細胞(dendritic cell,DC)、無機納米粒子、陽離子細胞穿膜肽等[37-38]。另外有研究機構(gòu)最近報道了lipopolyplex(LPP)納米遞送技術(shù)[39],脂質(zhì)體運載技術(shù)和聚合物運載技術(shù)[40]。脂質(zhì)載體是目前應(yīng)用最廣的非病毒載體,其易與受體細胞融合、轉(zhuǎn)染效率高、能夠抵御核酸酶的作用、且不受宿主限制[41-42]。納米脂球(LNP)是目前唯一工業(yè)化使用的核酸遞送技術(shù)[43],廣泛應(yīng)用于基于mRNA技術(shù)的癌癥免疫治療和預(yù)防病毒感染的疫苗等領(lǐng)域。Moderna、輝瑞/BioNTech等均已將LNPs 用于新冠的mRNA疫苗研發(fā)。

3 mRNA疫苗作用機制

早在20世紀90年代,研究人員就提出并研究了mRNA疫苗。mRNA疫苗經(jīng)過理論、技術(shù)和經(jīng)濟投入不斷完善?？茖W(xué)家們越來越多地闡明了它們的潛在機制,并更好地理解了它們。作用機制的突破使作為第三代疫苗技術(shù)的新型冠狀病毒mRNA疫苗在這次大流行中發(fā)揮了重要作用[44]。

mRNA疫苗不僅能像滅活疫苗一樣激活CD4+T細胞的外源性免疫途徑,而且還能激活大量涉及CD8+T細胞的內(nèi)源性免疫反應(yīng)途徑,從而激活效應(yīng)性和記憶CD8+T細胞(圖1)[45]。此外,mRNA疫苗還可以激活抗原遞呈細胞(APC),mRNA進入APC細胞質(zhì)后可以翻譯許多目的蛋白片段,從而激活MHCⅠ類分子的內(nèi)源性抗原加工遞呈途徑。mRNA疫苗可以在人體內(nèi)合成,因此具有兩個獨特的優(yōu)點:一是可以減少直接注射病毒蛋白的不良反應(yīng);二是mRNA疫苗可通過聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)快速擴增,在體內(nèi)而不是在體外誘導(dǎo)目的抗原,從而節(jié)省疫苗研發(fā)的時間和資金。

圖1 mRNA疫苗的作用機制

mRNA疫苗的外源性免疫反應(yīng)途徑如下: mRNA疫苗在人體注射后被肌肉細胞攝取。肌肉細胞翻譯許多目的抗原蛋白片段并在短時間內(nèi)將其運輸出細胞,這使它們能夠與不同類型的APC結(jié)合,例如巨噬細胞和樹突狀細胞 (DC),以激活人體的免疫力。未成熟的DC細胞吞噬目的抗原蛋白片段并激活成熟的DC細胞。同時,巨噬細胞可以處理合成的蛋白質(zhì)抗原信息,分泌細胞因子,促進DC細胞成熟。成熟的DC細胞剪接目的抗原蛋白片段,并將其呈遞給CD4+T細胞,通過MHCⅡ類分子進行識別和結(jié)合[46]。CD4+T細胞通過直接結(jié)合和分泌細胞因子激活B細胞,產(chǎn)生漿細胞和記憶B細胞,從而產(chǎn)生一系列以抗體為主的體液免疫效應(yīng)。mRNA疫苗還可以激活內(nèi)源性免疫應(yīng)答途徑:APC細胞和其他有核組織細胞都可以剪接mRNA疫苗中的目的抗原蛋白,然后通過膜表面的MHC Ⅰ類分子將其呈現(xiàn)給CD8+T細胞,從而激活CD8+T細胞,產(chǎn)生記憶和效應(yīng)性T細胞。當(dāng)再次感染時,細胞免疫和體液免疫同時被激活[47-49]。身體產(chǎn)生的記憶免疫細胞,如記憶B細胞和抗原特異性細胞毒性T細胞,可以快速識別病毒,產(chǎn)生額外抗體,準確殺死感染細胞,消滅病毒,防止感染繼續(xù)。

4 mRNA疫苗研究進展

mRNA疫苗的mRNA不會與宿主基因組混合,是一種安全的、迅速表達的信息載體。與其他常規(guī)疫苗相比,mRNA可以快速設(shè)計和制造。mRNA的這種快速制備潛力為開發(fā)用于傳染病的疫苗提供了廣泛的靈活性。因為mRNA疫苗在治療效果、安全性、經(jīng)濟性和大規(guī)模生產(chǎn)方面更具優(yōu)勢,基于mRNA的疫苗在臨床上的應(yīng)用越來越廣泛,這些優(yōu)勢使mRNA疫苗有望成為傳統(tǒng)疫苗的替代品。自從1990年首次突破使用IVT mRNA在小鼠中表達外源蛋白[50-53]以來,由于mRNA的多功能性,各種預(yù)防和治療領(lǐng)域已經(jīng)廣泛應(yīng)用mRNA。迄今為止,已采用和開發(fā)了不同的策略來傳遞mRNA來治療傳染病和癌癥[54]。

mRNA療法是目前預(yù)防傳染病的新興技術(shù)。在2019 年,針對傳染病開發(fā)了 15 種基于mRNA的疫苗,但不幸的是,沒有一種進入Ⅲ期試驗。因此,人們認為基于mRNA的疫苗技術(shù)可能還需要5到6年才能進入市場。但機緣巧合的是,COVID-19疫情在全球的肆虐為mRNA疫苗首次在人類身上進行終期測試奠定了基礎(chǔ)。截至2021年底,約有200種候選疫苗處于臨床前試驗階段。此外,已有100多種候選疫苗處于臨床試驗階段,其中約20種候選疫苗是基于mRNA的疫苗,只有兩個獲得了美國食品和藥物管理局(US FDA)的緊急批準。這兩種基于mRNA的疫苗BNT162b2和mRNA-1273已獲準在全球范圍內(nèi)用于人類的大規(guī)模接種[55]。

BNT162b2mRNA COVID-19疫苗由輝瑞和BioNTech共同開發(fā)[56],該mRNA疫苗在恒河猴的動物試驗結(jié)果中顯示,可以使機體產(chǎn)生高水平的中和抗體,并且可以激活CD4+T細胞和CD8+T細胞活性[57]。類似地,另一種基于mRNA的COVID-19疫苗,稱為mRNA-1273,由Moderna與美國國家衛(wèi)生研究所下屬的國家過敏和傳染病研究所和生物醫(yī)學(xué)高級研究與發(fā)展局合作開發(fā)。mRNA-1273還使用包含可電離脂質(zhì)SM-102的LNP,其中封裝了N1-甲基假尿苷修飾的mRNA[58]。

與SARS-CoV-2相比,1918年的流感大流行在全球造成4 000萬人死亡。 已經(jīng)開發(fā)了幾種流感疫苗,包括減毒活疫苗、滅活疫苗和重組血凝素 (HA),這些疫苗針對的是負責(zé)病毒進入宿主的血凝素 (HA) 蛋白。 然而,由于流感病毒具有快速且持續(xù)的突變,其仍會導(dǎo)致嚴重的呼吸道疾病,尤其是在冬季[59-60]。各種流感mRNA疫苗正在進行臨床試驗,例如修飾的mRNA可編碼全長VAL-506440,VAL-506440是一種H10N8流感毒株和H7N9流感毒株中分離出來的膜結(jié)合形式的HA糖蛋白[61-62]。該疫苗接種后,在接種疫苗的志愿者體內(nèi)檢測到高滴度水平的中和抗體,表明候選流感mRNA疫苗在預(yù)防流感病毒感染方面具有很大的前景[62-63]。

除此之外,還有多種處于臨床試驗階段或研究階段的mRNA疫苗表現(xiàn)出良好的預(yù)防效果。針對狂犬病的CV7201和CV7202 mRNA疫苗在德國開展了Ⅰ期臨床試驗[64-66];編碼埃博拉病毒包膜糖蛋白 (EBOV GP) 的mRNA疫苗在兩組豚鼠上進行了測試,以檢測中和抗體水平,結(jié)果顯示,在治療后 21,42 d后誘導(dǎo) EBOV GP 滴度增加[67]。此外,愛潑斯坦-巴爾病毒 (EBV)[68]、呼吸道合胞病毒(RSV)[69-70]、寨卡病毒 (ZIKV)[71-72]、人類免疫缺陷病毒 (HIV)[73]、肩突硬蜱[74]以及某些抗癌、抗腫瘤[75-76]的mRNA疫苗也處于研發(fā)中,正處于動物試驗或臨床試驗階段。

5 討論

mRNA疫苗技術(shù)在過去30年間經(jīng)過科學(xué)家的不斷探索和持續(xù)努力,使得其可以應(yīng)用在人類身上。病毒是具有高度變異性的病原體,基于mRNA的疫苗技術(shù)可以迅速地對目的蛋白基于進行修改并實現(xiàn)快速且大量的制造生產(chǎn),對于病毒性疾病感染的預(yù)防具有積極的作用。COVID-19為基于mRNA的疫苗和其他主要疾病的mRNA疫苗預(yù)防方法打開了大門,推廣基于mRNA的疫苗技術(shù)的影響和意義可能遠遠超出預(yù)防 COVID-19本身。

與傳統(tǒng)疫苗相比,mRNA 疫苗在一些方面更具優(yōu)勢:1)抗原選擇范圍廣;2)具備自我佐劑特點,有更強的免疫原性;3)安全性更高,不進入細胞核內(nèi)部,只在細胞質(zhì)內(nèi)表達抗原;4)存在多種修飾方法,能夠使mRNA疫苗更加穩(wěn)定,翻譯效率更高。納米脂質(zhì)體遞送技術(shù)使mRNA疫苗能夠快速遞送到細胞內(nèi)從而表達出目的蛋白,發(fā)揮相應(yīng)的功能;5)不依賴于細胞或雞胚培養(yǎng)技術(shù),疫苗的構(gòu)建更為快速。mRNA的體外轉(zhuǎn)錄技術(shù)能夠進行快速、廉價、大規(guī)模地生產(chǎn)mRNA疫苗,與傳統(tǒng)活疫苗 5～6個月的生產(chǎn)周期相比,只需病毒的基因序列,mRNA疫苗在40 d內(nèi)即可完成疫苗樣品的生產(chǎn)制備;且在不同區(qū)域進行疫苗毒株運送時,不需要通過運輸生產(chǎn)疫苗所用的細胞或雞胚,通過計算機就可以發(fā)送相應(yīng)的基因序列,能更快地對突發(fā)傳染病疫情做出響應(yīng);6)通過生物化學(xué)技術(shù)即可合成,生產(chǎn)過程無病毒感染風(fēng)險。

但是,mRNA疫苗的未來發(fā)展還有很多難題亟待攻克。與傳統(tǒng)疫苗相比,IVT mRNA的制造更安全快速,但目前研究過程中所使用的材料較為昂貴。此外,疫苗的下游加工需要改進,IVT可以實現(xiàn)疫苗的小規(guī)模生產(chǎn),但對于大規(guī)模生產(chǎn)卻無法達到所需的產(chǎn)量。盡管mRNA疫苗在多個國家都獲批,但mRNA疫苗的大規(guī)模推廣還是存在難題。以輝瑞/BioNTech 的新冠疫苗為例,該疫苗必須在-70℃以下的溫度進行運輸和儲存。在標準冷藏溫度(2～8℃)下,它最多只能存儲 5 d。建立完整的疫苗冷鏈體系,包括疫苗的儲存和配送,具備一定的難度。此外,如果要實現(xiàn)疫苗的大批量供應(yīng),需要有相應(yīng)的灌裝能力,僅通過1個國家完成灌裝,是難以供應(yīng)全球所需的。最后,對于mRNA疫苗的效果評價,應(yīng)當(dāng)有適當(dāng)?shù)谋O(jiān)管指南,在COVID-19 mRNA疫苗接種后就已發(fā)現(xiàn)副作用和不良反應(yīng),如心肌炎和心包炎[77],出現(xiàn)氣短、胸痛、心悸的癥狀[78]。

總的來說,盡管目前mRNA疫苗技術(shù)還存在許多缺陷,但隨著研究人員的進一步探索,隨著大家對于mRNA疫苗的作用更清楚地認識,相信在技術(shù)的進步和監(jiān)管體系的不斷完善下,可以開發(fā)出更多更安全有效的針對病毒、細菌、寄生蟲以及癌癥的mRNA疫苗,這些疫苗在疾病的預(yù)防和治療領(lǐng)域可以發(fā)揮更大的作用,更好地保護人類健康。