犬、貓犬小孢子菌感染研究進展

郭 沛,矯曉倩,單 虎,劉家國,秦志華*

(1.南京農(nóng)業(yè)大學 動物醫(yī)學院,江蘇 南京210095;2.青島農(nóng)業(yè)大學 動物醫(yī)學院,山東 青島 266109)

犬小孢子菌(Microsporumcanis)是一種常見的致病性皮膚癬菌[1],根據(jù)生存環(huán)境,皮膚癬菌分為親人性、親土性和親動物性[2]。犬小孢子菌屬于皮膚癬菌小孢子菌屬,其在SDA培養(yǎng)基上呈淡黃色和白色絨毛狀,2周后產(chǎn)生大量菌絲呈羊毛狀,中央趨向于粉末化。犬小孢子菌菌絲有隔,可產(chǎn)生紡錘形大分生孢子及少許棒狀小分生孢子,其中大分生孢子是其最明顯的特征之一。犬小孢子菌在人與人之間的感染常有報道,而約有50%受感染的人是經(jīng)由無癥狀的動物傳染的[3],犬、貓犬小孢子菌感染也帶來了人畜共患病的危險[4],因此犬、貓犬小孢子菌的防治對于公共衛(wèi)生也具有舉足輕重的意義。寵物犬、貓犬小孢子菌屬于親動物性真菌,大多存在于自然界及犬、貓等動物毛皮上,主要通過動物與動物或動物與人接觸等途徑直接傳染,也可通過帶菌的物品間接傳染。犬小孢子菌可以在犬、貓等動物體上長時間存在而不致病[5-6],但當犬、貓抵抗力下降時,則會發(fā)生真菌性皮膚病。病發(fā)時,患病部位會呈現(xiàn)出不規(guī)則的鱗屑狀隆起,同時會出現(xiàn)掉毛、斷毛、丘疹、瘙癢、膿包等癥狀。犬、貓一經(jīng)感染犬小孢子菌,不僅病程較長,而且較難根治,愈后易復(fù)發(fā)[7],對寵物健康造成很大危害?；谀壳皣鴥?nèi)外犬小孢子菌的研究現(xiàn)狀,現(xiàn)對犬小孢子菌感染犬、貓的流行情況、發(fā)病機制、診斷技術(shù)和治療手段進行系統(tǒng)綜述,以期為寵物犬小孢子菌的科學研究提供理論基礎(chǔ),為今后犬小孢子菌的診斷和治療提供新思路。

1 流行情況

在寵物臨床上,犬、貓皮膚真菌病是一種很常見且多發(fā)的疾病。皮膚真菌主要入侵皮膚、毛發(fā)或趾甲等部位,大量增殖而引起皮膚病變,而犬小孢子菌是引起皮膚真菌病的主要病原菌[1-2,5-6]。在世界其他地區(qū),例如伊朗[8]、意大利[2]、尼日利亞[9]、巴西[10]、英國[11]等的研究均證實了犬小孢子菌在引發(fā)犬、貓皮膚真菌病中的重要地位。犬小孢子菌引發(fā)的犬、貓皮膚真菌病不僅嚴重影響寵物自身的生長發(fā)育,也可能威脅人類健康。

研究表明,季節(jié)、年齡、品種、營養(yǎng)狀況以及自身抵抗力等因素很大程度上影響犬小孢子菌的發(fā)病和流行[12]。趙彬等[13]對2017年6月―2019年6月句容地區(qū)某動物醫(yī)院收集的皮膚真菌病有效病例388例進行臨床調(diào)查分析,發(fā)現(xiàn)犬小孢子菌為247株,占63.66%,經(jīng)調(diào)查犬小孢子菌感染在3―9月份多發(fā)。張永東等[14]調(diào)查北京8家動物醫(yī)院245例皮膚真菌病,發(fā)現(xiàn)犬小孢子菌是導致犬皮膚病的主要病原真菌,且幼齡犬、母犬、6―11月份、病犬頭部和四肢發(fā)病率最高。翟曉虎等[15]對溫州地區(qū)某動物醫(yī)院2015年4月-2016年3月期間就診的120例疑似皮膚真菌病患犬,采集患處被毛進行鑒別培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)犬小孢子菌檢出率最高。安錫忠等[16]調(diào)查了2013年1―12月份期間,河北農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)院共接診保定市皮膚病患犬266例,其中以感染犬小孢子菌為主,占真菌性皮膚病總數(shù)的53.23%,犬小孢子菌感染最多的品種是京巴犬和金毛獵犬,主要感染部位為四肢,雌雄患犬比率為1.2∶1.0,犬小孢子菌主要發(fā)生在0～2歲(含2歲)。

KATIRAEE等[8]對2015年3月-2018年3月就診的308只患皮膚病的犬貓進行檢測,發(fā)現(xiàn)真菌病103例,其中犬小孢子菌的檢出率最高為78.5%,1歲以下的貓和犬的感染率(61.5%)顯著高于1歲以上的犬、貓(P<0.05)。LONG等[11]整理了1991-2017年間向英國皇家獸醫(yī)學院診斷實驗室提交的犬、貓皮膚癬菌培養(yǎng)記錄,使用常規(guī)方法鑒定皮膚真菌,結(jié)果發(fā)現(xiàn)犬小孢子菌在犬、貓上的分離率為91.9%,且在2歲以下的犬、貓中分離數(shù)量最多,品種以杰克羅素犬、杰克夏犬、波斯貓更常見。DETAR等[17]回顧了2年內(nèi)在美國西北部動物收容所內(nèi)被診斷為犬小孢子菌感染的貓病例,幼貓患病的幾率是成貓的8倍,且夏季和秋季有更多貓患病。

國內(nèi)外研究均證實了犬、貓皮膚真菌病的高發(fā)因素是犬小孢子菌,犬小孢子菌流行情況表現(xiàn)在春末至夏、秋初季多發(fā),這一時期高溫悶熱、陰雨潮濕適宜真菌孳生,也成為犬小孢子菌感染高峰;幼齡犬、貓患病率明顯高于成年犬、貓,究其原因是犬、貓皮膚皮脂腺分泌不飽和脂肪酸可抑制犬小孢子菌在皮膚及其附屬結(jié)構(gòu)的生長與繁殖,幼齡犬、貓皮膚分泌較少且免疫力較弱,對皮膚真菌病更加易感;多發(fā)品種主要與當?shù)刂饕曫B(yǎng)品種及頻繁洗澡有關(guān),例如國內(nèi)有些地區(qū)京巴犬和金毛獵犬多發(fā),國外某地區(qū)杰克夏犬、波斯貓多發(fā)。

2 發(fā)病機制

感染初始,犬小孢子菌附著在犬、貓毛發(fā)、趾甲等組織的角蛋白上[18-19],真菌的毒力、宿主的免疫狀態(tài)在該病的進展中起著重要作用。犬、貓感染途徑是通過皮膚傷口、疤痕或燒傷[20],這種感染通過直接接觸患病犬、貓,或者間接通過患病犬、貓接觸的毛毯、床罩、玩具、籠子、衣服和其他被孢子污染的物品發(fā)生[20-21]。犬小孢子菌的潛伏期為1～4周[21],在感染后6 h分生孢子與角蛋白附著最多[20],犬小孢子菌定殖導致宿主內(nèi)的各種免疫反應(yīng),包括炎癥[22],在感染皮膚區(qū)域看到明顯的炎癥反應(yīng),如發(fā)紅、腫脹和掉毛[23-24]。犬小孢子菌產(chǎn)生角蛋白水解酶,角蛋白在犬小孢子菌定殖后成為唯一的營養(yǎng)來源,促進角質(zhì)層中的真菌生長,并導致表皮角質(zhì)化[19-20,24]。通過釋放絲氨酸蛋白酶而產(chǎn)生蛋白分解活性,從而導致宿主的外部蛋白受損,造成皮膚損傷[20,24]。犬小孢子菌感染途徑如圖1所示[24]。

圖1 犬小孢子菌進入宿主的示意圖

目前,犬小孢子菌發(fā)病機制的研究普遍認為與蛋白酶的分泌和宿主的免疫反應(yīng)有關(guān)[26-27]。研究發(fā)現(xiàn),犬小孢子菌感染有關(guān)的蛋白酶包括角蛋白酶、彈性蛋白酶、膠原酶、酯酶、神經(jīng)酰胺酶、磷酸酶等[28],其中角蛋白酶的致病性比較明確。VIANI等[29]通過比較有癥狀和無癥狀犬、貓產(chǎn)生的蛋白酶的區(qū)別,結(jié)果發(fā)現(xiàn)有癥狀組的角蛋白酶和彈性蛋白酶的活性高于無癥狀組,角蛋白酶和彈性蛋白酶活性高的菌株感染動物模型的臨床癥狀重。皮膚的物理屏障在感染的第一階段免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[30-31],通過表皮細胞增殖和消除角質(zhì)層上的真菌滲透發(fā)揮作用。當犬、貓免疫能力較強時犬小孢子菌在皮膚屏障、炎癥過程及細胞免疫中就被清除。研究報道,皮膚真菌細胞壁成分可被宿主細胞模式識別受體(PRRs)識別,例如Toll樣受體(toll-like receptor,TLRs)[32],TLR2信號誘導炎性細胞因子如TNF、IL-1β和IL-10[33-34]的產(chǎn)生。在炎癥過程中,PRRs激活中性粒細胞和巨噬細胞,通過擾亂真菌細胞的滲透平衡而起到保護作用。SHA等[35]發(fā)現(xiàn),真菌感染初期引起的體液免疫反應(yīng)能夠誘導IL-17的產(chǎn)生,IL-17是一種促炎細胞因子,介導真菌感染的炎癥反應(yīng)中心。據(jù)報道,IL-17在犬小孢子菌感染中抑制真菌生長和促進炎癥反應(yīng),IL-17缺陷的病人更易感染皮膚真菌[36-37]。

3 診斷技術(shù)

犬小孢子菌臨床診斷通過臨床癥狀、伍德氏燈檢查和實驗室鏡檢進行初步診斷,以SDA等進行接種純培養(yǎng)和鏡檢分離鑒定致病真菌病原。臨床上犬、貓感染犬小孢子菌導致面部、腿部、尾部局部皮膚損害[38],如多灶性掉毛、紅斑、瘙癢、丘疹、膿皰疹、鱗屑和結(jié)痂,犬小孢子菌感染會導致犬、貓感染區(qū)域皮膚掉毛(1～3 mm),在長期感染后引發(fā)炎癥反應(yīng)發(fā)生永久性掉毛[39]。

伍德氏燈檢查法是寵物臨床上的一種快速有效地診斷真菌性皮膚病的方法[40],通過在暗室內(nèi)直接照射患犬病變區(qū)的毛發(fā)、皮屑或皮損區(qū)(也可取患犬被毛或皮膚刮取物在暗室里用伍德氏燈照射),觀察熒光反應(yīng),如果出現(xiàn)黃綠色熒光,則可判為真菌感染。這種方法操作簡單,同時能夠快速準確地得出診斷結(jié)果,確定病原,而且檢查時不會引起犬、貓應(yīng)激反應(yīng),也不會造成二次損傷,是目前國內(nèi)寵物臨床上廣泛使用的一種真菌感染的診斷方法,但是該方法不能確診是否為犬小孢子菌感染,還需要配合其他實驗室診斷。

實驗室診斷方法是對臨床樣本進行顯微鏡檢來檢查菌落的大體形態(tài)特征(例如生長速度、菌落形態(tài)、色素)、顯微形態(tài)(例如大孢子、小孢子和菌絲的形狀和大小)、生理指標等[41]。圖2展示了顯微鏡下犬小孢子菌的菌落形態(tài)。

A.菌落呈棉狀,白色到淺黃色;隨培養(yǎng)時間延長呈棕黃色;B.顯微鏡下的犬小孢子菌乳酸酚棉藍染色圖(a.大分生孢子;b.小分生孢子;c.菌絲;d.衣原體分生孢子[42])

分子生物學的最新進展和技術(shù)的進步使微生物學中物種確定和菌株分型的新技術(shù)得以發(fā)展,開發(fā)了可靠的皮膚真菌鑒定方法。聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)、限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)和/或直接測序技術(shù)、基質(zhì)輔助激光解吸電離-飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)等技術(shù)已被用于鑒定和區(qū)分真菌的物種或基因類型。犬小孢子菌的PCR檢測方法一直是研究中的熱點,以18S rDNA、ITS區(qū)等序列來設(shè)計引物,擴增片段長度從176～620 bp不等,都可以在幾小時內(nèi)快速準確地鑒定是否為犬小孢子菌感染[43-44]。有學者利用PCR-RFLP技術(shù)對伊朗地區(qū)臨床標本中重要皮膚真菌的種間和種內(nèi)基因組變異進行鑒定,證明該方法快速、靈敏,是一種有益的鑒定工具,通過瓊脂糖凝膠電泳上產(chǎn)生特征條帶,可在5 h內(nèi)成功鑒定真菌種類[41]。MALDI-TOF MS對于發(fā)現(xiàn)疾病生物標志物和研究藥物代謝等方面具有重要意義,并具有良好的臨床應(yīng)用前景,近期一些研究發(fā)現(xiàn)MALDI-TOFMS也可以作為鑒定臨床病原體的技術(shù),用于真菌鑒定,檢測速度快、準確度高[45-46]。

4 治療策略

由于犬小孢子菌感染的高度傳染性,一經(jīng)發(fā)現(xiàn)必須配合良好的治療,以防止傳染其他犬、貓或?qū)櫸镏魅薣47]。犬小孢子菌病的傳統(tǒng)治療方法主要分為內(nèi)服和外用,外用藥一般有克霉唑軟膏、咪康唑軟膏等,而內(nèi)服藥一般有灰黃霉素、酮康唑、特比萘芬、伊曲康唑、氟康唑等[47-49]。ABASTABAR等[50]從伊朗、法國和土耳其的皮膚真菌病患者和動物身上獲得的大量犬小孢子菌臨床分離株(n=208),比較了15種抗真菌藥物的抑菌效果,結(jié)果如表1所示,所有藥物都表現(xiàn)出良好的抗真菌活性,其中,氟康唑的MIC范圍最寬(0.064～128.000 mg/L),其次是酮康唑和克霉唑(0.016～32.000 mg/L)[48]。WANG等[51]研究了酮康唑(KTZ)等咪唑類藥物在治療犬小孢子菌感染中的作用,RNA聚合酶、類固醇生物合成和核糖體生物發(fā)生3條通路與KTZ的作用機制密切相關(guān),結(jié)果表明,KTZ可能通過3個途徑中的CYP51、SQL、ERG6、ATM、ABCB1、SC、KER33、RPA1和RNP基因改變細胞膜通透性,破壞細胞壁,抑制有絲分裂和轉(zhuǎn)錄調(diào)控。特比萘芬作為臨床上常用的抗真菌藥物對犬小孢子菌的作用機制已有報道[52]。通過實時定量PCR研究特比萘芬對4種耐藥基因(PDR1、MDR1、MDR2、MDR4)表達的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對照組相比,有特比萘芬存在的培養(yǎng)組4種基因表達水平升高2～4倍,同時顯示特比萘芬對犬小孢子菌的抗菌活性與編碼ABC轉(zhuǎn)運蛋白的基因過表達有關(guān)。臨床數(shù)據(jù)表明,部分抗真菌藥物在治療人類和動物真菌感染時無效果[1],這很可能是出現(xiàn)了對藥物具有耐藥性的菌株,當臨床病例持續(xù)感染或在適當劑量的抗真菌藥物治療后4周內(nèi)復(fù)發(fā)時,通常懷疑為臨床耐藥[48],這是因為抗真菌藥物的皮膚藥代動力學(PK)結(jié)果顯示藥物在停藥后3～4周才會滲透到角質(zhì)層[53]。針對臨床犬小孢子菌耐藥性出現(xiàn),研究人員也研究了其他具有抗真菌活性的物質(zhì),例如抗菌肽、植物提取物、植物精油等。TUNSAGOOL等[54]研究了從枯草芽孢桿菌(B.subtilis)中提取的環(huán)狀脂肽(CLPs)對從貓皮膚上分離的犬小孢子菌的抑制作用,所有純化的芽孢桿菌提取物均具有抑制犬小孢子菌生長的活性,藥物共培養(yǎng)72 h后,CLPs對犬小孢子菌的抑制率為62.21%。李志等[55]為了評價中草藥復(fù)方治療犬小孢子菌的效果,組方白蘚皮、苦參、蛇床子等藥材煎湯熱敷患部,結(jié)果發(fā)現(xiàn)藥浴可明顯消減犬皮膚真菌病的臨床病理變化,對犬皮膚致病真菌具有較高的清除率,說明中藥組方對犬皮膚真菌病治愈率高、療效快、療效確實。經(jīng)試驗證明具有明顯抗真菌活性的植物精油有山蒼子、八角茴香、小茴香、天竺葵精油混合物,百里香、牛至、迷迭香、八角茴香和檸檬柑橘精油混合物等[56-57]。

表1 15種抗真菌藥物對208株犬小孢子菌的抑菌效果

5 小結(jié)

犬小孢子菌作為親動物性真菌,在寵物犬、貓身上可以長期存在而不致病,隨著寵物事業(yè)的發(fā)展,人類與寵物犬、貓的關(guān)系日益密切,導致犬小孢子菌在寵物與人之間傳播,對人們的身體健康造成嚴重威脅。寵物臨床上犬小孢子菌多在高溫悶熱、陰雨潮濕的季節(jié)多發(fā),幼齡犬、貓多發(fā),在寵物飼養(yǎng)過程中應(yīng)注意提高犬、貓免疫力,適度保持皮毛干凈,減少犬小孢子菌感染的可能性。隨著分子生物學發(fā)展,犬小孢子菌的診斷也從傳統(tǒng)的菌株培養(yǎng)鑒定,逐漸發(fā)展到利用PCR、ITS、MS等方法彌補傳統(tǒng)方法中主觀經(jīng)驗的不足,但是由于這些方法復(fù)雜、儀器要求高、檢測費用增加等原因,在寵物臨床上沒有廣泛應(yīng)用,因此,需要開發(fā)一種便攜式、價格低、操作簡便的診斷方法輔助臨床快速診斷。

寵物臨床上犬小孢子菌高度傳染,一經(jīng)發(fā)現(xiàn)必須配合良好的治療,以防止傳染其他犬、貓或?qū)櫸镏魅?傳統(tǒng)治療方法是使用各種化學藥物,例如酮康唑、特比萘芬等,用藥過程中需特別注意規(guī)范用藥,防止出現(xiàn)犬小孢子菌耐藥的情況。因此,需要更多的研究以深入探究犬、貓犬小孢子菌耐藥機制,以減少臨床上耐藥菌株的出現(xiàn);同時開發(fā)新的寵物專用治療犬、貓犬小孢子菌的化學藥物或天然藥物。