四川牦牛ACOT12基因多態(tài)性及其與肉品質(zhì)性狀的相關(guān)分析

阮夢(mèng)茹,王浩鑄,謝 濤,陸惠嫻,于海濱,姜 平*,趙志輝,2*

(1.廣東海洋大學(xué) 濱海農(nóng)業(yè)學(xué)院,廣東 湛江 524000;2.粵西地區(qū)畜禽資源與種質(zhì)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東 湛江 524000)

牦牛屬于大型反芻動(dòng)物,體格高大、被毛厚密,心肺功能發(fā)達(dá),抗逆性強(qiáng),是唯一起源于青藏高原且在高海拔地區(qū)繁衍至今的珍稀牛種[1]。具有高海拔地區(qū)適應(yīng)能力強(qiáng)、耐粗飼、抗寒耐勞等優(yōu)良特性。與普通黃牛肉相比,牦牛肉的蛋白質(zhì)含量高達(dá)22.52%,脂肪含量約為3.15%,且礦物質(zhì)元素含量豐富,氨基酸結(jié)構(gòu)比例與人更相近,有著較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值與經(jīng)濟(jì)價(jià)值[2]。截至2019年全世界牦?？倲?shù)量約為1 700萬(wàn)頭,其中中國(guó)牦牛存欄數(shù)為1 600多萬(wàn)頭,占比90%以上[3],主要分布于青海、四川、西藏等地區(qū)。牦牛肉的高經(jīng)濟(jì)價(jià)值,改善了人們的生活環(huán)境與膳食結(jié)構(gòu),因此推動(dòng)牦牛產(chǎn)業(yè)的發(fā)展,對(duì)加強(qiáng)經(jīng)濟(jì)建設(shè)有著重要意義。隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步,人們對(duì)分子遺傳育種的知識(shí)更加完善,有關(guān)分子標(biāo)記的研究日益增多,單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)是分子標(biāo)記最常用的方法之一,SNP是基因組水平上單個(gè)核苷酸變異所導(dǎo)致的DNA堿基序列的多態(tài)性[4],可用于快速基因型分型,是研究遺傳育種相關(guān)的分子標(biāo)記常用的技術(shù)之一。

?；o酶A硫脂酶(acyl-CoA thioeaterase,ACOT)是一類水解酶,可催化酯酰輔酶A水解成自由脂肪酸和輔酶A,廣泛存在于哺乳動(dòng)物組織中[5]。目前已知的ACOT家族成員有15個(gè)[6],根據(jù)酶的相對(duì)分子質(zhì)量大致被分為Ⅰ型和Ⅱ型,兩種類型的ACOT無(wú)結(jié)構(gòu)相似性和序列同源性,因此被稱為類似物而非同系物。Ⅰ型和Ⅱ型ACOT均含有保守的催化三聯(lián)體氨基酸序列,該序列在催化反應(yīng)和調(diào)節(jié)酶活性中發(fā)揮重要作用。?；o酶A硫脂酶12(acyl-CoA thioeaterase 12,ACOT12)是ACOT家族Ⅱ型酶成員之一,主要在肝、腎和小腸中表達(dá)[7]。ACOT12基因相關(guān)的研究主要集中在小鼠、大鼠和人上。有研究表明,在大鼠中,饑餓和過(guò)氧化物酶體增殖等代謝刺激可誘導(dǎo)ACOT12的表達(dá),再次喂食和施加胰島素可降低ACOT12的表達(dá)[8]。ACOT12基因與牦牛相關(guān)的研究未見(jiàn)報(bào)道,本課題組在前期進(jìn)行的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析中發(fā)現(xiàn),ACOT12是影響牛肉質(zhì)代謝的差異表達(dá)基因。因此本試驗(yàn)采用DNA測(cè)序技術(shù)研究四川牦牛ACOT12基因的多態(tài)性,并應(yīng)用SPSS 23.0軟件分析SNPs位點(diǎn)及其單倍型與肉品質(zhì)性狀的相關(guān)性,以期為優(yōu)質(zhì)肉牛的早期選育提供理論依據(jù),為構(gòu)建高品質(zhì)肉質(zhì)性狀的核心牛群奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)樣品所選用的102頭四川牦牛,在相同的飼養(yǎng)條件下飼養(yǎng)于四川阿壩州某牛場(chǎng),收集每頭牛相同部位的頸靜脈血液經(jīng)抗凝劑處理后,于-80℃ 保存。

1.2 主要試劑血液基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司;Green Taq PCR Mix、TAE Buffer購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司;DL2000 DNA Marker購(gòu)自北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司;瓊脂糖購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司;DNA Loading Buffer、核酸染色劑購(gòu)自Meilunbio公司。

1.3 主要儀器PCR擴(kuò)增儀購(gòu)自Bio-Rad公司;電子天平購(gòu)自梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易(上海)有限公司;電泳儀購(gòu)自北京六一生物科技有限公司;凝膠成像分析儀購(gòu)自廣州譽(yù)維生物科技儀器有限公司;微量分光光度計(jì)購(gòu)自Thermo公司。

1.4 DNA提取按說(shuō)明書(shū)使用血液基因組DNA提取試劑盒提取四川牦牛血液樣本DNA,使用微量分光光度計(jì)檢測(cè)DNA的質(zhì)量濃度和純度,通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的質(zhì)量。

1.5 引物設(shè)計(jì)根據(jù)Ensembl中公布的牛ACO-T12基因序列(ENSBTAT00000014753.6),利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)1對(duì)引物,引物序列為F:5′-ATGGGAGGAGTGATTGC-3′和R:5′-CCTGACTTCTGCCTTACTGA-3′,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.6 PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物測(cè)序以四川牦牛血液DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系(總體積為20 μL):Taq PCR Mix 10 μL,上、下游引物各 0.5 μL,DNA模板2 μL,ddH2O 7 μL。PCR擴(kuò)增程序:95℃預(yù)變性5 min;95℃變性30 s,52.6℃退火30 s,72℃延伸1 min,共35個(gè)循環(huán);72℃再延伸5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并確認(rèn)目的條帶正確后,送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。

1.7 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析采用SeqMan軟件觀察重疊峰;使用Popgene 32軟件計(jì)算等位基因的基因頻率、基因型頻率、遺傳雜合度(H)、有效等位基因數(shù)(Ne);使用PIC 0.6軟件計(jì)算多態(tài)信息含量(PIC);使用Haploview 4.2軟件進(jìn)行連鎖不平衡分析;使用SPSS 23.0軟件的單因素方差中的多重比較對(duì)四川牦牛肉品質(zhì)性狀和基因型間的關(guān)系進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn),以P<0.05作為差異顯著性的判斷標(biāo)準(zhǔn)。試驗(yàn)數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖1。擴(kuò)增產(chǎn)物大小為845 bp,電泳條帶明亮、清晰,無(wú)引物二聚體、抹帶和非特異性擴(kuò)增條帶,可用于后續(xù)的測(cè)序試驗(yàn)。

M.DL2000 DNA Marker;1～9.ACOT12基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

2.2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序?qū)y(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),在ACOT12基因的5′UTR和外顯子1上共發(fā)現(xiàn)3個(gè)SNPs位點(diǎn),分別為E1-285 T>C、E1-603 T>A、E1-675 C>G,不同基因型的測(cè)序圖譜如圖2～4所示。

圖2 ACOT12基因E1-285 T>C位點(diǎn)3種基因型的測(cè)序圖譜

圖3 ACOT12基因E1-603 T>A位點(diǎn)3種基因型的測(cè)序圖譜

圖4 ACOT12基因E1-675 C>G位點(diǎn)3種基因型的測(cè)序圖譜

2.3 ACOT12基因的3個(gè)SNPs位點(diǎn)的群體遺傳特性ACOT12基因的3個(gè)SNPs位點(diǎn)的群體遺傳特性見(jiàn)表1。由表1可以看出,E1-285 T>C、E1-603 T>A、E1-675 C>G中優(yōu)勢(shì)基因型分別為TC、TA、CC,優(yōu)勢(shì)等位基因分別為T、A、C,頻率均大于0.5;E1-285 T>C、E1-603 T>A位點(diǎn)的遺傳雜合度(H)和多態(tài)信息含量(PIC)均處于0.25～0.50之間,表明以上位點(diǎn)呈現(xiàn)為中度多態(tài)。χ2檢驗(yàn)說(shuō)明,3個(gè)SNPs位點(diǎn)在四川牦牛群體中均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)(P>0.05)。

表1 ACOT12基因的3個(gè)SNPs的群體遺傳特性分析結(jié)果

2.4 ACOT12基因的SNPs與四川牦牛肉品質(zhì)性狀的相關(guān)分析ACOT12基因的3個(gè)SNPs與四川牦牛肉品質(zhì)性狀的相關(guān)分析見(jiàn)表2。由表2可以看出,E1-603 T>A位點(diǎn)的TT基因型個(gè)體的pH45 min值顯著低于TA、AA基因型個(gè)體(P<0.05);E1-675 C>G位點(diǎn)的CG基因型個(gè)體的背膘厚顯著高于CC基因型個(gè)體(P<0.05),3個(gè)SNPs位點(diǎn)的不同基因型與pH24 h、肉色(L*,a*,b*)均無(wú)顯著相關(guān)性(P>0.05)。

表2 ACOT12基因3個(gè)SNPs位點(diǎn)與四川牦牛肉品質(zhì)性狀相關(guān)性分析

2.5 ACOT12基因SNPs的單倍型與四川牦牛肉品質(zhì)的相關(guān)性分析由圖5可知,3個(gè)SNPs位點(diǎn)存在強(qiáng)連鎖遺傳,并構(gòu)成了一個(gè)結(jié)構(gòu)域,圖5A表示SNPs位點(diǎn)之間的連鎖程度,數(shù)值為D′值,常用來(lái)度量連鎖不平衡;圖5B代表3個(gè)位點(diǎn)之間組成的5種單倍型的頻率,共組成15種單倍型組合,其中7種單倍型組合具有生物學(xué)統(tǒng)計(jì)意義(n≥3),分別為H1H1(CC-TT-CC)、H1H2(TC-TA-CC)、H1H3(TC-TA-CG)、H1H4(TC-TT-CC)、H2H2(TT-AA-CC)、H2H3(TT-AA-CG)和H3H3(TT-AA-GG)。由表3可知,H2H2單倍型組合的pH45min值顯著高于H1H4(P<0.05),其他單倍型組合與背膘厚、pH24h值和肉色無(wú)顯著差異(P>0.05)。

表3 四川牦牛ACOT12基因的單倍型與肉品質(zhì)的相關(guān)性分析結(jié)果

A.3個(gè)SNPs位點(diǎn)的連鎖不平衡的熱圖(格子中數(shù)值為R2值);B.5種單倍型的頻率

3 討論

中國(guó)牦牛屬肉乳役兼用牛,產(chǎn)乳量高,產(chǎn)肉性能比普通牛品質(zhì)優(yōu)異,且能適應(yīng)高海拔地區(qū)的惡劣天氣,在提高肉產(chǎn)量及提升肉品質(zhì)上有著巨大的潛能。如何提高牦牛肉的質(zhì)量和產(chǎn)量已成為畜牧業(yè)生產(chǎn)中不可忽視的問(wèn)題。近年來(lái),有關(guān)ACOT12基因與牛相關(guān)的研究較少,其主要研究方向集中于人類醫(yī)學(xué)方面。邢建曉等[9]研究表明,ACOT12的突變頻率與皮膚慢性炎癥性疾病銀屑病顯著相關(guān),在1 027個(gè)樣本中非銀屑病個(gè)體中的突變頻率較高;LU等[10]研究表明,ACOT12調(diào)節(jié)HCC細(xì)胞中的細(xì)胞乙酰輔酶A水平和組蛋白乙?；?并且通過(guò)下調(diào)ACOT12誘導(dǎo)TWIST2表達(dá)和促進(jìn)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化從而促進(jìn)肝細(xì)胞癌(HCC)轉(zhuǎn)移,表明ACOT12與肝癌轉(zhuǎn)移和肝癌患者的不良生存密切相關(guān)。目前SNP在牛育種的研究中應(yīng)用廣泛,但有關(guān)ACOT12基因與四川牦牛肉質(zhì)性狀關(guān)聯(lián)的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。因此本研究使用直接測(cè)序法對(duì)102頭四川牦牛進(jìn)行SNP篩選及其與肉品質(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)分析。

四川牦牛ACOT12基因的群體遺傳特性分析顯示,E1-285 T>C、E1-603 T>A位點(diǎn)的遺傳雜合度(H)和多態(tài)信息含量(PIC)均處于0.25～0.50之間,表明以上位點(diǎn)呈現(xiàn)為中度多態(tài)。3個(gè)SNPs位點(diǎn)在四川牦牛群體中均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)(P>0.05),表明個(gè)體受到人工選擇的影響較小,群體遺傳性較好。

動(dòng)物宰后糖酵解速度快,乳酸含量增加,造成肌肉pH值下降,pH值可直接影響嫩度、肉色、蒸煮損失和保存期,是衡量肉質(zhì)酸化的重要指標(biāo)[11]。pH值常用簡(jiǎn)便快捷的pH值計(jì)測(cè)定,宰前牛肉為中性,隨著宰后時(shí)間的增加,pH值下降,從而導(dǎo)致肉色變差,持水力下降。背膘厚可客觀、科學(xué)地評(píng)判某一個(gè)體的生長(zhǎng)發(fā)育狀況,成為評(píng)判個(gè)體質(zhì)量?jī)?yōu)劣的依據(jù),在畜牧業(yè)生產(chǎn)中有著重要意義[12],在評(píng)估屠宰加工、檢驗(yàn)飼喂成效和生產(chǎn)育種上也有著重要作用。四川牦牛ACOT12基因E1-603 T>A位點(diǎn)的TT基因型個(gè)體的pH45 min值顯著低于TA、AA基因型個(gè)體,一般認(rèn)為宰后肌肉長(zhǎng)時(shí)間維持較高的pH值,則說(shuō)明肌肉持水力強(qiáng),食用品質(zhì)好。因此TA、AA基因型個(gè)體的pH45 min優(yōu)于TT基因型個(gè)體。突變純合型AA基因型是該位點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)基因型,因此可推測(cè)ACOT12基因有關(guān)pH45 min的優(yōu)勢(shì)性狀可在日后的基因突變中得到穩(wěn)定遺傳;E1-675 C>G位點(diǎn)的CG基因型個(gè)體的背膘厚顯著高于CC基因型個(gè)體,有研究表明,背膘厚與優(yōu)質(zhì)肉重呈負(fù)相關(guān)[13-14],但對(duì)繁殖性能具有一定正向影響[15]。pH45 min值、背膘厚是衡量牛肉質(zhì)的重要檢測(cè)指標(biāo),可直接用于判斷肉質(zhì)的風(fēng)味和口感,因此以上2個(gè)SNPs位點(diǎn)可作為四川牦牛肉質(zhì)性狀的相關(guān)分子標(biāo)記。

本研究使用Haploview 4.2軟件對(duì)ACOT12基因的多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行連鎖不平衡分析(linkage disequilibrium,LD),LD又稱等位基因關(guān)聯(lián),可用于評(píng)估連鎖不平衡的程度[16],隨著科學(xué)的發(fā)展其應(yīng)用越來(lái)越廣泛,在疾病的預(yù)測(cè)和治療中發(fā)揮著重要作用[17]。LD分析發(fā)現(xiàn)3個(gè)位點(diǎn)存在強(qiáng)連鎖遺傳,并構(gòu)成了1個(gè)結(jié)構(gòu)域,共有15種單倍型組合,其中7種單倍型組合具有生物學(xué)統(tǒng)計(jì)意義。單倍型組合與肉品質(zhì)性狀的相關(guān)分析發(fā)現(xiàn),H2H2單倍型組合的pH45 min值顯著高于H1H4,因此H2H2單倍型組合是pH45 min性狀的最優(yōu)單倍型組合。

綜上所述,四川牦牛ACOT12基因的3′UTR和外顯子1上共存在3個(gè)SNPs位點(diǎn),分別為E1-285 T>C、E1-603 T>A、E1-675 C>G,其中E1-603 T>A、E1-675 C>G位點(diǎn)分別與pH45 min值、背膘厚性狀顯著相關(guān),說(shuō)明以上2個(gè)SNPs可作為四川牦牛宰后pH45 min和背膘厚性狀的相關(guān)分子標(biāo)記;H2H2單倍型組合的宰后pH45 min值高于其余單倍型組合,因此可作為四川牦牛宰后pH45 min值性狀的最優(yōu)單倍型組合,為未來(lái)優(yōu)質(zhì)肉牛早期選育提供分子理論依據(jù)。