中國荷斯坦奶牛PDE10A基因多態(tài)性及其與乳品質(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)分析

陳佳怡,李嘉靈,劉娟,吳昊宸,范靜,姜平,趙志輝,尹福泉

(廣東海洋大學(xué) 濱海農(nóng)業(yè)學(xué)院,廣東 湛江 524000)

中國荷斯坦奶牛是19世紀(jì)末由中國的黃牛與當(dāng)時(shí)引進(jìn)中國的荷斯坦牛雜交,并通過不斷選育逐漸形成的品種,其產(chǎn)奶性狀(產(chǎn)奶量、乳蛋白、乳脂和乳糖等)是重要的經(jīng)濟(jì)性狀,這類性狀受微效多基因控制,并受到環(huán)境因素的影響[1]。傳統(tǒng)的選育方法側(cè)重于表型選擇,世代間隔較長,選育進(jìn)展緩慢。記錄奶牛產(chǎn)奶量和測定相關(guān)乳品質(zhì)性狀進(jìn)行數(shù)據(jù)收集,將其與現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)結(jié)合,找出真正地可用于分子標(biāo)記輔助選擇的關(guān)鍵基因SNPs位點(diǎn)應(yīng)用于奶牛分子育種的標(biāo)記輔助選擇,可以加快中國荷斯坦奶牛分子育種和品種選育進(jìn)程。

磷酸二酯酶10A基因(phosphodiesterase 10A,PDE10A)是PDE第10家族中的唯一成員,能夠參與水解第二信使環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)和環(huán)磷酸鳥苷(cyclic guanosinc monophosphate,cGMP)。由于第二信使在細(xì)胞內(nèi)普遍存在且廣泛地參與細(xì)胞內(nèi)各種功能,使得PDE10A基因也能夠通過調(diào)節(jié)第二信使進(jìn)而參與細(xì)胞內(nèi)許多信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。早在1975年就有研究表明,cAMP激活劑能夠有效刺激母羊、兔和牛乳腺組織中酪蛋白的分泌[2-3],之后又有研究報(bào)道了靜脈注射咖啡因(一種非特異性PDE抑制劑)能夠提高奶山羊乳脂含量[4]。PDE10A被發(fā)現(xiàn)在大腦紋狀體中高表達(dá),因此大部分研究都集中于PDE10A抑制劑在各種精神和神經(jīng)退行性疾病上的應(yīng)用,包括神經(jīng)分裂癥[5-6]、亨廷頓病[7-8]等。但也有人提出PDE10A可能在牛乳腺中起作用[9]。同屬于PDE家族的PDE3可能與牛奶脂肪的產(chǎn)生有關(guān)[10],且PDE4能夠在牛乳腺組織和上皮細(xì)胞中對乳蛋白含量具有重要的調(diào)節(jié)作用[9]。因此推測,PDE家族的PDE10A可能對牛乳腺以及相關(guān)性狀有著一定的調(diào)節(jié)作用。本課題組在前期研究中根據(jù)對高脂荷斯坦奶牛與低脂荷斯坦奶牛乳腺上皮細(xì)胞進(jìn)行的miRNA測序篩選出一系列差異表達(dá)的miRNA,其中包括miR-485,經(jīng)過進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)miR-485可靶向作用于PDE10A基因調(diào)節(jié)細(xì)胞脂質(zhì)代謝[11],這個(gè)結(jié)果提示PDE10A基因可能作為直接或間接影響奶牛乳品質(zhì)性狀的關(guān)鍵基因而發(fā)揮生物學(xué)作用。但PDE10A基因?qū)χ袊伤固鼓膛Ｈ槠焚|(zhì)性狀的影響研究鮮有報(bào)道。因此,本研究采用直接測序法研究中國荷斯坦奶牛PDE10A基因的多態(tài)性及其與乳品質(zhì)性狀的相關(guān)性,以期為中國荷斯坦奶牛的分子標(biāo)記輔助選擇提供重要的基因資源。

1 材料與方法

1.1 血液樣本DNA選用黑龍江省某牛場的同一時(shí)期相同飼養(yǎng)狀態(tài)下的中國荷斯坦奶牛104頭,每頭牛頸靜脈取血10 mL,并用抗凝劑處理,-80℃ 保存。

1.2 主要試劑核酸染色劑購自Meilunbio公司;DL2000 DNA Marker、TAE Buffer均購自諾唯贊公司;瓊脂糖、2× EasyTaq PCR SuperMix(+Dye)均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.3 DNA混池構(gòu)建隨機(jī)選擇45～50個(gè)DNA樣本進(jìn)行等量混合,制備成DNA混池樣品。

1.4 引物設(shè)計(jì)根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫提供的PDE10A基因組序列(編號:ENSBTAT00000073673.1),使用Primer 5.0軟件進(jìn)行PDE10A基因的引物設(shè)計(jì),上游引物:5′-TAGTTTGTGATACGGGATGC-3′;下游引物:5′- AAGCGTGGTACGAATGC -3′,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.5 目的基因PCR擴(kuò)增及驗(yàn)證PCR反應(yīng)體系20 μL:2×Taq Master Mix (Dye Plus) 10 μL,上、下游引物各0.5 μL,模板1 μL,ddH2O 8 μL。反應(yīng)程序:95℃ 5 min;95℃ 30 s,60℃ 30 s,72℃ 1 min,30個(gè)循環(huán);72℃ 5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證后,送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

2 結(jié)果

2.1 PDE10A基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的驗(yàn)證PCR擴(kuò)增中國荷斯坦奶牛PDE10A基因產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測,結(jié)果顯示,PCR產(chǎn)物擴(kuò)增特異性良好,無雜帶,條帶清晰,可直接用于測序鑒定(圖1)。

M.DL2000 DNA Marker;1～10.分別為不同個(gè)體的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

2.2 測序結(jié)果PDE10A基因內(nèi)含子12、外顯子13和內(nèi)含子13中發(fā)現(xiàn)3處SNP位點(diǎn),分別為I12-3228 A>G、E13-106 C>T、I13-13 A>G。3個(gè)SNPs位點(diǎn)各基因型測序結(jié)果如圖2～4所示。

Ⅰ～Ⅲ.基因型分別為AA、GG、AG的個(gè)體

表1 PDE10A基因3個(gè)SNPs的群體遺傳特性

2.4 PDE10A基因SNPs與中國荷斯坦奶牛乳品質(zhì)性狀的相關(guān)性分析使用SPSS 22.0單因素方差分析PDE10A基因SNPs與中國荷斯坦奶牛乳品質(zhì)性狀的相關(guān)性。結(jié)果如表2所示,I12-3228 A>G位點(diǎn)的GG基因型及AG基因型的奶量極顯著高于AA基因型(P<0.01),AA基因型的乳脂肪含量顯著高于AG基因型(P<0.05),極顯著高于GG基因型(P<0.01),AA基因型乳蛋白含量極顯著高于GG基因型(P<0.01),AA基因型的乳糖含量顯著高于AG基因型(P<0.05)并極顯著高于GG基因型(P<0.01),AA基因型干物質(zhì)含量顯著高于AG基因型(P<0.05)極顯著高于GG基因型(P<0.01),AA基因型的體細(xì)胞數(shù)顯著高于GG基因型(P<0.05),GG基因型和AG基因型的校正奶量極顯著高于AA基因型(P<0.01); I13-13 A>G位點(diǎn)的AG基因型和GG基因型的奶量極顯著高于AA基因型(P<0.01),AA基因型的乳脂肪含量顯著高于AG基因型(P<0.05)并極顯著高于GG基因型(P<0.01),AA基因型的乳蛋白含量極顯著高于GG基因型(P<0.01),GG基因型的乳糖含量極顯著高于AA基因型(P<0.01),AG基因型的乳糖含量顯著高于AA基因型(P<0.05),AA基因型干物質(zhì)含量顯著高于AG基因型(P<0.05)并極顯著高于GG基因型(P<0.01),AA基因型的體細(xì)胞含量顯著高于GG基因型(P<0.05),AG基因型及GG基因型的校正奶含量極顯著高于AA基因型(P<0.01);E13-106位點(diǎn)基因型間與相關(guān)乳品質(zhì)性狀均無顯著差異。

表2 PDE10A基因3個(gè)SNPs與中國荷斯坦奶牛乳品質(zhì)性狀相關(guān)性分析

2.5 PDE10A基因單倍型與中國荷斯坦奶牛乳品質(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)分析使用Haploview 4.2軟件對3個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行連鎖分析,如圖5所示,I12-3228 A>G、E13-106 C>T、I13-13 A>G這3個(gè)位點(diǎn)存在強(qiáng)連鎖遺傳,3者構(gòu)成了1個(gè)結(jié)構(gòu)域。共有6種不同單倍型,其中5種單倍型具有生物學(xué)統(tǒng)計(jì)意義(n>3),分別為:H1H1(AACCAA)、H1H2(AGCCAG)、H1H3(AGCTAG)、H2H2(GGCCGG)、H3H3(GGTTGG)。使用SPSS 22.0單因素方差分析以上5種單倍型與中國荷斯坦奶牛乳品質(zhì)性狀的相關(guān)性,結(jié)果如表3所示,H1H1單倍型的乳脂肪含量顯著高于H1H3單倍型(P<0.05),極顯著高于H2H2單倍型(P<0.01);H3H3單倍型的乳脂肪含量顯著高于H2H2單倍型(P<0.05);H1H1單倍型的乳蛋白含量極顯著高于H2H2單倍型(P<0.01);H3H3單倍型乳蛋白含量顯著高于H2H2單倍型(P<0.05);H2H2單倍型和H3H3單倍型的乳糖含量顯著高于H1H1單倍型(P<0.05);H1H1單倍型的乳中干物質(zhì)含量顯著高于H1H3單倍型(P<0.05),極顯著高于H2H2單倍型(P<0.01),H3H3單倍型的干物質(zhì)含量顯著高于H2H2單倍型(P<0.05);H1H2單倍型、H1H3單倍型和H2H2單倍型的校正奶含量顯著高于H1H1單倍型(P<0.05)。其余單倍型中國荷斯坦奶牛性能均無顯著性差異(P>0.05)。

表3 PDE10A基因單倍型與中國荷斯坦奶牛乳品質(zhì)性狀相關(guān)性分析

圖5 PDE10A基因的奶牛群體SNPs位點(diǎn)連鎖反應(yīng)

3 討論

近年來,越來越多的研究關(guān)注于基因多態(tài)性對中國荷斯坦奶牛乳品質(zhì)性狀的影響。有研究發(fā)現(xiàn)中國荷斯坦奶牛EEF1D基因5′側(cè)翼區(qū)存在2個(gè)SNPs位點(diǎn),且與奶牛乳脂率、乳蛋白率顯著相關(guān)[12];還有研究表明中國荷斯坦奶牛PIN1基因 g.14432394G>A位點(diǎn)的突變顯著影響奶牛在第一泌乳期和第二泌乳期的產(chǎn)奶量、乳脂率和乳蛋白率[13]。因此,本研究采用直接測序法對104頭中國荷斯坦奶牛進(jìn)行SNP位點(diǎn)篩選并分析其與乳品質(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)性。在檢測樣本中發(fā)現(xiàn)PDE10A基因存在3個(gè)SNP位點(diǎn),其中I12-3228 A>G和I13-13 A>G 2個(gè)位點(diǎn)在試驗(yàn)牛群中多態(tài)性相對較高,可以很好地利用這2個(gè)位點(diǎn)在本試驗(yàn)群體中表現(xiàn)出的多態(tài)性進(jìn)行選擇。3個(gè)SNPS在試驗(yàn)群體中不符合哈代溫伯格平衡,這可能是由于本試驗(yàn)樣本均來自同一奶牛場,冷凍精液的使用及高選擇強(qiáng)度導(dǎo)致基因表達(dá)受到人工選擇的影響,群體間沒有進(jìn)行自然交配,等位基因與基因型比例沒有保持遺傳平衡狀態(tài)。

對基因多態(tài)性的研究多集中于編碼區(qū)和5′側(cè)翼區(qū)而忽略了對內(nèi)含子多態(tài)性的研究,隨著人們研究的不斷深入,內(nèi)含子的調(diào)控功能逐漸被發(fā)現(xiàn)。有研究發(fā)現(xiàn),人SLC2A9基因內(nèi)含子7中的1個(gè)SNP與血清尿酸和慢性腎臟疾病的進(jìn)展密切相關(guān)[14]。還有研究表明,中國西門塔爾牛MAT2B基因內(nèi)含子2中存在1個(gè)SNP位點(diǎn)與肉品質(zhì)性狀顯著相關(guān)[15];奶牛ECHS1基因中有6個(gè)內(nèi)含子SNPs與牛奶脂肪酸顯著相關(guān)[16]。在本研究中,I12-3228 A>G、I13-13 A>G位點(diǎn)與乳品質(zhì)性狀顯著相關(guān),其AA基因型表現(xiàn)出產(chǎn)奶量及乳糖量低于AG及GG 2種基因型而營養(yǎng)成分(乳脂肪、乳蛋白等)和體細(xì)胞數(shù)均高于AG及GG基因型的特性。造成這種現(xiàn)象的原因可能是由于奶牛產(chǎn)奶量減少而引起的“濃縮效應(yīng)”導(dǎo)致的;同時(shí),按照國際奶牛聯(lián)合會制定的標(biāo)準(zhǔn),對乳汁中體細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù),以每毫升50萬個(gè)體細(xì)胞為界,高于此數(shù)值即判定為患有奶牛乳房炎。I12-3228 A>G和I13-13 A>G位點(diǎn)的AA基因型的體細(xì)胞數(shù)均大于50萬個(gè),因此也有可能是機(jī)體為了應(yīng)對奶牛乳房炎,血液中血清蛋白和免疫球蛋白增加,最終導(dǎo)致乳蛋白率增加[17]。體細(xì)胞數(shù)的上升還會使乳糖含量顯著下降[18],這可能是由于隨著體細(xì)胞數(shù)的增加,乳腺上皮細(xì)胞大量脫落,血乳屏障受損,通透性改變,影響葡萄糖的吸收導(dǎo)致乳糖合成率降低。AG基因型相較于AA基因型體細(xì)胞數(shù)更少,乳中營養(yǎng)物質(zhì)含量也較GG基因型更多?？梢詫DE10A基因I12-3228 A>G和I13-13 A>G位點(diǎn) AG基因型個(gè)體進(jìn)行分子標(biāo)記選擇。

單個(gè)SNP的基因型可能會影響到臨近SNP位點(diǎn)的基因型,復(fù)合基因型能夠反應(yīng)多個(gè)SNP間的互作[19]。因此,復(fù)合基因型的效應(yīng)要優(yōu)于單個(gè)基因型。本試驗(yàn)對中國荷斯坦奶牛PDE10A基因的3個(gè)SNPs位點(diǎn)進(jìn)行了連鎖不平衡分析,發(fā)現(xiàn)3個(gè)位點(diǎn)存在強(qiáng)連鎖遺傳,形成了5種有生物學(xué)統(tǒng)計(jì)意義的單倍型,且與奶牛生產(chǎn)性狀顯著相關(guān)。其中H1H3單倍型組合個(gè)體在乳脂肪、乳糖、乳蛋白、干物質(zhì)方面與H1H1單倍型組合個(gè)體間沒有顯著性差異,且奶量顯著高于H1H1單倍型組合個(gè)體,提示在本試驗(yàn)群體中H1H3單倍型組合個(gè)體可能為最優(yōu)選擇,在實(shí)際應(yīng)用中可不斷提高該單倍型組合在群體中的比例,以加快中國荷斯坦奶牛產(chǎn)奶性狀的改良。

本研究發(fā)現(xiàn)PDE10A基因在中國荷斯坦奶牛中存在3個(gè)SNP位點(diǎn),即I12-3228 A>G、E13-106 C>T和I13-13 A>G。其中I12-3228 A>G和I13-13 A>G位點(diǎn)的突變顯著影響了中國荷斯坦奶牛的產(chǎn)奶量、乳脂肪、乳蛋白、乳糖、干物質(zhì)和體細(xì)胞?？蓢L試將PDE10A基因作為影響中國荷斯坦奶牛乳品質(zhì)性狀的候選基因用于標(biāo)記輔助選擇,為中國荷斯坦奶牛選育工作提供科學(xué)依據(jù)。