綠原酸對鎘致三黃雞腎臟損傷的保護效應

白玉妮,原俊朝,鄒 輝,顧建紅,袁 燕,劉學忠,劉宗平,卞建春*

(1.揚州大學 獸醫(yī)學院,江蘇 揚州 225009;2.江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇 揚州 225009)

鎘(cadmium,Cd)多與氧、氯、硫等元素形成無機化合物廣泛分布于自然界中,是一種對動物機體具有劇毒作用的重金屬元素。由于Cd具有質(zhì)軟、延展性好且耐腐燭等理化特性,被廣泛應用于電鍍、電池、塑料、化妝品、涂料、顏料及防腐等的生產(chǎn)過程中,由此產(chǎn)生的Cd對環(huán)境的污染問題也引發(fā)了人們的廣泛關注[1]。Cd在機體內(nèi)不能被降解,在人體中的生物半衰期為10～30年,其排泄率極低[2]。Cd進入機體后首先會在肝臟和金屬硫蛋白(MT)結(jié)合形成Cd-MT復合物,然后通過血液循環(huán),經(jīng)腎小球濾過作用,最終被腎小管重吸收,在溶酶體中被降解,釋放出游離Cd[3]。但Cd引起腎臟損傷并不完全依賴于Cd-MT復合物,即無機Cd也可引起腎損傷,且損傷程度要比Cd-MT復合物更為嚴重[4-5]。此外,Cd具有致癌、致畸、腎毒性、生殖毒性以及骨骼損傷等多種毒性作用[6-7]。其毒性作用可以使家禽生產(chǎn)性能降低,具體表現(xiàn)為產(chǎn)蛋量下降、產(chǎn)軟殼蛋、料肉比增高、骨質(zhì)疏松、關節(jié)炎,以及死亡率增加等[8]。有學者以氯化鎘(CdCl2)飼喂雞8周后,觀察Cd在各器官中積累量之后發(fā)現(xiàn),Cd在腎臟中殘留最高[9]。雖然Cd的毒理機制尚未明確,但根據(jù)文獻報道,Cd可以通過誘導氧化應激、凋亡、自噬、鈣平衡失調(diào)、DNA甲基化以及干擾DNA修復系統(tǒng)等多種機制對細胞產(chǎn)生有害影響[10]。其中,氧化應激被認為是Cd誘導細胞損傷最重要的機制[11]。

綠原酸(chlorogenic acid,CA)又稱為咖啡鞣酸、咖啡單寧酸,是由咖啡酸(caffeic acid)的1位羧基與奎寧酸(quinic acid)的3位羥基脫水縮合形成的一種多酚類物質(zhì)[12]。研究發(fā)現(xiàn)CA有抗炎、抗菌、抗病毒、抗腫瘤、肝腎保護、抗氧化等廣泛的作用,被譽為植物黃金[13-15]。有報道指出,CA可以通過抑制氧化應激、細胞凋亡、炎癥和自噬保護腎臟[16]。因此,本研究以揚州三黃雞為研究對象,探討CdCl2致腎臟毒性機制以及CA在Cd致腎毒性中的保護作用,為防治Cd中毒提供潛在藥物選擇。

1 材料與方法

1.1 實驗動物1日齡健康揚州本地三黃雞96只,由江蘇省家禽研究所提供。所有實驗操作均按照國家研究委員會《實驗動物護理與使用指南》的建議進行,并經(jīng)揚州大學動物護理與使用委員會批準(批準ID:202012-201)。

1.2 主要試劑CA(國產(chǎn)分析純);氯化鎘·(五水合物)(CdCl2·5H2O);丙二醛 (MDA)、還原性谷胱甘肽 (GSH)、谷胱甘肽過氧化物酶 (GSH-Px)、過氧化氫酶 (CAT)和超氧化物歧化酶 (SOD)檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所);BCA蛋白質(zhì)量濃度測定試劑盒(碧云天生物技術有限公司);標準蛋白(新賽美生物科技有限公司)。

1.3 動物分組與處理將24只健康揚州本地三黃雞于安靜清潔干燥的環(huán)境(室溫30℃,濕度為70%左右)預飼養(yǎng)7 d,預飼養(yǎng)后測量體質(zhì)量并將其隨機分為4組,分別為對照組(Con組)、Cd組(含70 mg/kg CdCl2的基礎日糧)、CA組(含400 mg/kg CA的基礎日糧)、Cd+CA組(含70 mg/kg CdCl2和400 mg/kg CA的基礎日糧),試驗期間自由飲水。處理30 d后頸靜脈放血致死,采集血液至15 mL 離心管。剖檢取出腎臟,分離腎臟皮質(zhì),分離腎臟背膜,從腎臟剝離出皮質(zhì)并剪碎,放入凍存管中,-80℃保存。

1.4 腎組織中Cd含量的測定取濕重500 mg的腎臟樣品80℃烘干48 h后,放入研缽磨碎,取100 mg 加入4 mL優(yōu)級硝酸溶解,采用微波消解法消解樣品。消解好的溶液放入趕酸儀中趕酸至1 mL 后用超純水定量至10 mL。利用電感耦合等離子體質(zhì)譜儀測定腎皮質(zhì)中Cd的含量。

1.5 血液中腎功能相關生化指標的測定采集血液,2 500 r/min離心10 min后取上層血清,用全自動生化分析儀檢測血液中肌酐(CREA)、尿酸(UA)含量。

1.6 病理切片制作與HE染色將分離的腎臟在固定液中浸泡24 h,取出后用手術刀進行切割,使用脫水機進行梯度酒精脫水、二甲苯透明,石蠟浸泡并包埋。用切片機切片后滴加30%酒精后移入40℃恒溫水浴使其完全展開,再貼附于載玻片上,用烤片機烘干。經(jīng)二甲苯脫蠟、蒸餾水漂洗后,分別用蘇木素染色、鹽酸酒精分色、自來水沖洗、氨水返藍、伊紅染色、酒精脫色脫水、二甲苯透明,最后用中性樹膠封片,在光學顯微鏡下觀察。

1.7 腎皮質(zhì)氧化應激相關指標的測定測定腎臟皮質(zhì)內(nèi)GSH、MDA含量和GSH-Px、SOD、CAT活性,根據(jù)南京建成生物工程研究所檢測試劑盒的說明書進行操作。

2 結(jié)果

2.1 CA和Cd對雞腎皮質(zhì)中Cd含量的影響結(jié)果如圖1所示,與對照組相比,Cd暴露后腎皮質(zhì)中Cd含量極顯著升高(P<0.01),與Cd組相比,CA組和Cd+CA組腎皮質(zhì)Cd含量均極顯著降低(P<0.01),對照組和CA組之間腎臟Cd含量無顯著差異(P>0.05)。

與Con組相比,*表示P< 0.05,**表示P< 0.01;與Cd組相比,#表示P< 0.05,##表示P< 0.01。下同

2.2 CA和Cd對雞腎臟組織病理學的影響結(jié)果如圖2所示,對照組(圖2A)和CA組(圖2C)雞腎組織染色均勻,腎小球形態(tài)結(jié)構(gòu)未見明顯異常;Cd組(圖2B)大鼠腎組織可見較多腎小管上皮細胞顆粒變性,管腔增大(白色箭頭),胞質(zhì)疏松淡染,蛋白管型增多;與Cd組相比,Cd與CA共處理組(圖2D)病變有所減輕,腎小球形態(tài)結(jié)構(gòu)未見明顯異常,腎小管上皮細胞顆粒變性(白色箭頭)、胞質(zhì)疏松淡染(紅色箭頭)、蛋白管型(黃色箭頭)等有所緩解。說明CA可以緩解Cd中毒引起的雞腎臟損傷。

2.3 CA和Cd對雞血清中腎功能相關指標的影響結(jié)果如圖3所示,與對照組相比,Cd組血清中CREA和UA含量均極顯著升高 (P<0.01);與Cd組相比,Cd+CA組CREA和UA均極顯著降低(P<0.01),對照組和CA組之間CREA和UA含量無顯著性差異(P>0.05)。

圖3 CA和Cd對雞血清中肌酐、尿酸的影響

2.4 CA和Cd對雞腎臟氧化指標的影響如圖4所示,與對照組相比,Cd組腎皮質(zhì)中MDA和GSH 含量極顯著升高(P<0.01);SOD、GSH-Px活性極顯著降低(P<0.01),CAT活性顯著降低(P<0.05),與Cd組相比,Cd+CA組MDA和GSH含量極顯著降低(P<0.01),SOD、GSH-Px活性極顯著升高(P<0.01),CAT活性顯著升高(P<0.05);對照組和CA組之間MDA、GSH、SOD、GSH-Px、CAT含量無顯著性差異(P>0.05)。提示CA緩解了Cd中毒引起的雞腎臟的氧化損傷。

圖4 CA和Cd對雞腎臟抗氧化酶活性的影響

3 討論

作為一種蓄積性極強的重金屬污染物,Cd可以通過呼吸道、消化道和皮膚等多種途徑進入動物體內(nèi),造成機體多器官、多系統(tǒng)發(fā)生病變[17]。在實際生產(chǎn)中,畜禽主要通過食入被Cd污染的玉米、豆粕、肉骨粉等動植物飼料發(fā)生中毒。有研究者分別在1日齡海蘭雞日糧中添加35,70,140 mg/kg CdCl2飼喂90 d,建立雞Cd中毒模型后發(fā)現(xiàn),70 mg/kg CdCl2可以造成雞小腦、心臟等多個器官的明顯病變[18-19]。因此本研究選用70 mg/kg CdCl2拌飼的方式來探究Cd對三黃雞腎臟的毒性作用,使研究更符合Cd實際接觸情況。

腎臟是Cd毒性最重要的蓄積部位和主要靶器官,組織中Cd含量也可以在一定程度上反映機體內(nèi)Cd負荷量[20],有研究表明,腎臟Cd含量安全域值為50 μg/g,超過該限制即可認為Cd接觸已對腎臟產(chǎn)生危害[17,21]。本研究結(jié)果顯示,Cd暴露后,腎臟中Cd的含量已大于600 μg/g,提示機體Cd負荷過高。HE結(jié)果顯示,腎小管上皮細胞顆粒變性,胞質(zhì)疏松淡染,呈空泡化,腎小管管腔增大,蛋白管型增多,說明重金屬Cd對雞的腎臟造成了損傷。最后,本試驗檢測血清中腎功能相關指標肌酐和尿酸的含量來進一步評估腎臟損傷狀況,結(jié)果顯示Cd暴露后雞血清中肌酐、尿酸含量均不同程度呈現(xiàn)升高趨勢,說明Cd可引起雞腎臟功能受損。

越來越多的研究表明,氧化應激在Cd引起腎臟損傷的生物機制中發(fā)揮了重要作用[22],Cd進入機體后通過活化黃嘌呤氧化酶、血紅色素氧化酶導致機體內(nèi)產(chǎn)生大量的活性氧,擾亂細胞內(nèi)氧化與抗氧化狀態(tài)的平衡,使細胞內(nèi)抗氧化酶活力下降,自由基生成增加并對細胞造成損害[23]。體內(nèi)氧自由基毒性產(chǎn)物的清除有賴于SOD、GSH-Px、CAT等酶類抗氧化劑和GSH、維生素C、維生素E、微量元素等非酶類抗氧化劑的共同作用[24-25]。SOD可以專一清除生物氧化過程中的超氧陰離子自由基,被認為是抗氧化系統(tǒng)的第一道防線[26]。CAT作為一種抗氧化酶,其主要作用是清除體內(nèi)H2O2,催化H2O2分解為H2O和O2,減少細胞的損傷[27]。GSH-Px為硒依賴性細胞內(nèi)抗氧化酶,可以保護細胞膜的結(jié)構(gòu)及功能不受過氧化物的干擾及損害。GSH含有豐富的非蛋白質(zhì)硫醇,可以通過游離巰基與Cd形成復合物來改變Cd的分布和排泄,從而提供抗氧化防御功能。它還可以作為GSH-Px的底物,被催化為氧化型谷胱甘肽(GSSG)的同時清除H2O2與脂質(zhì)過氧化物[28]。而MDA是脂質(zhì)中的多不飽和脂肪酸與ROS作用而形成的一個重要產(chǎn)物,其含量間接反映機體內(nèi)自由基的多少并且可以作為衡量細胞膜磷脂氧化損傷程度的生物標志[29]。它們在活性氧的清除中發(fā)揮著各自的重要作用,所以這些指標均可以間接反映細胞氧化應激損傷的程度。本研究發(fā)現(xiàn),Cd暴露后腎皮質(zhì)中SOD、CAT、GSH-Px酶的活性呈現(xiàn)不同程度的降低,同時,MDA、GSH含量呈現(xiàn)升高趨勢。與徐明暢等[30]的研究結(jié)果相一致。但GSH升高趨勢與李靜慧等[31]、張靜等[32]的研究結(jié)果存在差異,可能是Cd抑制了CSH-Px的活力,從而限制了GSH向GSSG轉(zhuǎn)化,造成了CSH的堆積[33],也可能是由于機體為了抵御Cd而造成的GSH代償性增高[34]。

CA是植物有氧呼吸過程中經(jīng)莽草酸途徑產(chǎn)生的一種苯丙素類化合物。在杜仲科、忍冬科、薔薇科等植物中含量較高,例如:杜仲、金銀花、向日葵、咖啡和可可樹等[12]。因其具有抗氧化、抗腫瘤、降血壓、降糖、護肝等多種生物活性受到了諸多研究者的關注。有研究證實,CA具有清除ROS和抗脂質(zhì)過氧化的作用,可以有效延緩腎臟損傷[35]。DING等[36]按每千克體質(zhì)量30 mg CA給小鼠灌胃8周后發(fā)現(xiàn),進入機體后的CA,部分以原型形式被胃和小腸吸收,然后在腸黏膜和腸道菌群的酯酶作用下水解為咖啡酸和阿魏酸。咖啡酸和阿魏酸具有優(yōu)異的抗氧化活性,可提高SOD和CAT活性,改善Cd引起的肝腎損傷。本研究發(fā)現(xiàn),相比于Cd組,加入CA后,腎皮質(zhì)Cd含量明顯降低,腎臟病理損傷有所減輕,且雞血清中肌酐、尿酸含量明顯降低,MDA和GSH的產(chǎn)生水平降低,SOD、CAT、GSH-Px活力含量顯著增加,說明CA可以提升腎臟抵抗氧化應激的能力,有效緩解Cd引起的腎臟損傷。

綜上所述,基礎飼糧Cd暴露可對三黃雞腎臟產(chǎn)生損傷,毒性機制可能仍與氧化損傷有關。本研究為CA在Cd所致的腎臟損傷中的應用提供了一定的理論依據(jù),但仍需進一步闡明其保護途徑和調(diào)控機制,有望能夠在Cd致腎損傷的臨床治療中得到更廣泛的應用。