鐵莧菜對RAW 264.7細胞NLRP3及炎癥因子表達的影響

尕 玉,樊藝萌,王惠茹,魏媛媛,張艷楠,郝智慧

(中國農(nóng)業(yè)大學 動物醫(yī)學院,北京 100193)

潰瘍性結(jié)腸炎 (ulcerative colitis,UC) 是一種以腹瀉、膿血便、腹痛、發(fā)熱和體質(zhì)量減輕為臨床癥狀的慢性非特異性腸道炎癥性疾病,主要發(fā)生于結(jié)腸的黏膜層和黏膜下層[1]。腸道免疫系統(tǒng)失調(diào)及腸屏障功能改變可能是導(dǎo)致UC發(fā)生的主要原因[2],但其發(fā)病機制尚未明確。目前針對UC還沒有特異性的治療措施,臨床用藥,包括皮質(zhì)類固醇、氨基水楊酸鹽和抗生素[3-4],以緩解癥狀為主要原則,這些藥物不僅成本較高,且患者使用后常出現(xiàn)不良反應(yīng),不能根治及杜絕潰UC的復(fù)發(fā)。中藥(Chinese traditional medicine,CTM)具有成分多樣、療效穩(wěn)定、作用溫和持久及毒性和不良反應(yīng)小等優(yōu)點,使得CTM在治療一些頑疾方面往往具有西藥不可替代的優(yōu)勢。網(wǎng)絡(luò)藥理學是一種基于藥物、疾病的相關(guān)靶點基因以及蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的系統(tǒng)分析方法。能夠從整體角度揭示藥物的作用機理、協(xié)同作用和動態(tài)特征,這些特征與中醫(yī)治療整體理論的特征相一致,為中藥藥理的發(fā)展提供理論指導(dǎo)。

鐵覓菜(AcalyphaaustralisL.,AAL)為大戟科鐵覓菜屬鐵覓菜的干燥全草,性涼、味苦澀,具有抗炎鎮(zhèn)痛活性[5]?！秲?nèi)經(jīng)》云:“苦能燥濕”“澀能固瀉”,故民間常用于止血、止痢、止瀉?，F(xiàn)代藥理學研究表明其具有抗腹瀉、抗UC、抗菌、抗病毒、止血、止咳祛痰、平喘等多種作用[6-7]。AAL常用于腹瀉的治療,但其抗UC的藥理、藥效及機制的研究極少。已有研究表明,AAL水提物可以減輕TNBs誘導(dǎo)的大鼠UC模型中腹瀉與便血率,降低炎性細胞浸潤和MPO酶、SOD的水平[8-9],且通過抑制iNOS基因的表達減少NO過量生成[10-11]。

因此,本研究采用中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學結(jié)合脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)誘導(dǎo)RAW 264.7細胞炎癥模型的方法共同探討AAL治療UC的作用機制。以LPS刺激RAW 264.7巨噬細胞增殖,構(gòu)建體外炎癥模型,研究AAL對炎癥小體NLRP3和炎癥因子的影響。通過檢測炎癥因子、NLRP3相關(guān)蛋白和mRNA表達水平,探討AAL治療UC可能參與的信號通路與分子機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑AAL,2021年8月采自浙江麗水,經(jīng)中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所鑒定為大戟科鐵莧菜屬植物鐵莧菜(AcalyphaaustralisL.);鹽酸小檗堿 (國藥準字:H61021392),陜西頤生堂藥業(yè)有限公司,規(guī)格0.1 g/片;DMEM高糖培養(yǎng)基 (A1370801)、胎牛血清 (16140071),LPS (L8880,純度>98%)、Calcein-AM/PI試劑盒 (CA1630)、總蛋白提取試劑盒(強) (BC3710)、BCA蛋白濃度測定試劑盒 (PC0020 )均購自北京索萊寶科技有限公司;GoScriptTM反轉(zhuǎn)錄試劑盒 (A6001,00987373) 購自普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司;預(yù)染蛋白Marker (26617)購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司;ECL 顯影液 (GNWB-006,202307)購自北京京北日晟生物有限公司;TaKaRa Custom Oligo DNA/RNA (5015)購自TaKaRa Bio Inc (Japan)有限公司。

1.2 主要儀器倒置熒光顯微鏡 (Olympus公司,型號:DP74);CO2培養(yǎng)箱 (上海億恒科學儀器有限公司,型號:BPN-80CRH(UV));PCR儀 (Bio Red公司,型號:T100TM);實時熒光定量PCR系統(tǒng) (BIO-RAD公司,型號:CFX96TM);垂直電泳轉(zhuǎn)印系統(tǒng) (BIO-RAD公司,型號:PowerPacTMBasic);凝膠成像儀 (Cytiva公司,型號:Image Quant 800);多功能酶標儀 (Tecan公司,型號:INFINITE M NANO)。

1.3 AAL及UC相關(guān)靶點的獲取通過閱讀文獻獲得AAL中含有的化學成分,根據(jù)化源網(wǎng) (https://www.chemsrc.com/) 進行CAS號的轉(zhuǎn)換。將轉(zhuǎn)換所得的唯一CAS號輸入PubChem數(shù)據(jù)庫 (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/),收集相應(yīng)的2D結(jié)構(gòu)圖及SMILES號。再通過結(jié)構(gòu)圖及SMILE號進行ADME (http://www.swissadme.ch/) 篩選,獲得活性化合物,篩選條件為腸胃吸收(gatrointestinal absortion;GIabsortion)為 “High”,且5種類藥性預(yù)測 (Lipinski、Ghose、Veber、Egan、Muegge) 結(jié)果中有2個及以上為 “Yes”。在 SWISS Target Prediction (http://www.swisstargetprediction.ch/) 平臺對活性化合物進行靶點預(yù)測,最終獲得鐵莧菜的相關(guān)靶點。

使用人類基因數(shù)據(jù)庫 (GeneCards,https://www.genecards.org/) ,OMIM數(shù)據(jù)庫(https://omim.org/),藥物靶點數(shù)據(jù)庫(DRUGBANK,https://go.drugbank.com/) 和治療靶點數(shù)據(jù)庫(TTD,http://db.idrblab.net/ttd/)以 “ulcerative colitis” 為關(guān)鍵詞獲得UC相關(guān)的靶點。

利用VENNY 2.1(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)對以上獲得的中藥靶點與疾病靶點取交集,獲得的靶點被認為是AAL在治療UC中的潛在靶點,并繪制韋恩圖(Venn)圖,然后利用Cytoscape 3.8(http://www.cytoscape.org/)軟件分析獲得Degree值,繪制“鐵莧菜-成分”網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)將交集靶點輸入STRING數(shù)據(jù)庫 (https://string-db.org/),來識別可能的蛋白質(zhì)間相互作用。為了提高所獲得數(shù)據(jù)庫的可靠性,對蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用進行了進一步過濾,最小交互作用得分為0.40,篩選后的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用用于網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和分析。使用Cytoscape構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò),使用網(wǎng)絡(luò)分析儀計算 “度” (degree) 等參數(shù)。

1.5 GO功能富集分析和KEGG途徑富集分析根據(jù)Cytoscape構(gòu)建的PPI網(wǎng)絡(luò),按Degree大小排序,取前20個靶點作為核心靶點,進行KEGG和GO分析。將核心靶點導(dǎo)入基因注釋和分析數(shù)據(jù)庫(David,https://david.ncifcrf.gov/) 中,將Analysis as species設(shè)置為H.sapiens,保存AAL治療UC的GO分析和KEGG通路分析結(jié)果。通過篩選獲得GO分析和KEGG通路分析中排名前20的結(jié)果,并繪制富集氣泡圖以及柱狀分析圖。

1.6 細胞培養(yǎng)、LPS配制及AAL處理RAW 264.7巨噬細胞用含10% FBS、1%雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)液于37℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),并取對數(shù)生長期時的細胞用于實驗。LPS用磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline,PBS)配成可穩(wěn)定保存的質(zhì)量濃度為1 g/L的均勻溶液,并用不含有10% FBS的完全培養(yǎng)液稀釋到1 mg/L用于后續(xù)試驗。選用LPS刺激RAW 264.7巨噬細胞建立的焦亡炎性增殖模型作為本次的試驗?zāi)Ｐ汀?/p>

選取新鮮的鐵莧菜,除去根莖,洗凈晾干,在超凈工作臺內(nèi)紫外線照射20 min。取一干凈、滅菌的研缽,放入少許滅菌處理過的石英砂,將紫外線處理后的AAL放入研缽中充分研磨,用4層紗布擠壓過濾得到AAL濾液(表1),得到的濾液濃度定義為1 g/mL,經(jīng)0.22 μm水膜過濾后,保存于-20℃,取不含有10%FBS的細胞培養(yǎng)液進行后續(xù)稀釋。

表1 AAL得汁率

1.7 細胞分組與處理將RAW 264.7細胞分為空白對照組(C)、LPS組(LPS)、陽性藥物組(B)、AAL高劑量組(AAL-H)、AAL中劑量組(AAL-M)、AAL低劑量組(AAL-L)。待細胞長至80%～90%匯合狀態(tài)時,各組進行如下處理:對照組,加入維持培養(yǎng)基(10% FBS)作用于細胞24 h;LPS組,加入1 mg/L 的LPS作用于細胞24 h;陽性藥物組,同時加入1/2 體積1 mg/L 的LPS和1/2 體積20 mg/L 小檗堿(BBR)作用于細胞24 h;鐵莧菜給藥組,同時加入1/2 體積1 mg/L 的LPS和1/2 體積不同質(zhì)量濃度的AAL作用于細胞24 h。

1.8 CCK8法檢測細胞活力將細胞按照每孔1×104/個接種于96孔培養(yǎng)板中,每孔100 μL,并分為空白對照組和不同濃度LPS組,每個組設(shè)置6個重復(fù)孔。各組細胞培養(yǎng)24 h后,棄去上清,除空白對照孔外,其余每孔加入100 μL不同質(zhì)量濃度LPS溶液(10.0,5.0,1.0,0.5,0.1 mg/L),繼續(xù)培養(yǎng)24 h。每孔加入100 μL CCK8溶液(10%),避光孵育2.5 h 后,酶標儀上于波長450 nm處測定各孔吸光度(D450)值。

將細胞按照每孔1×104/個接種于96孔培養(yǎng)板中,并分為對照組和不同濃度AAL+LPS組(LPS濃度根據(jù)CCK8實驗結(jié)果選擇),每組設(shè)置6個復(fù)孔。藥物處理組分別同時加入50 μL不同質(zhì)量濃度AAL(900,800,700,500,400,200,100,50,10,1 mg/L)及50 μL 1 mg/L的LPS培養(yǎng)24 h。每孔加入100 μL CCK8溶液(10%),避光孵育2.5 h后,酶標儀上于波長450 nm處測定各孔吸光度(D450)值。重復(fù)以上試驗3次。

1.9 Calcein-AM/PI活/死細胞染色法檢測細胞活力將RAW 264.7細胞按照每孔1×105/個接種于24孔板中,每孔500 μL。用1× Assay Buffer充分清洗細胞2～3次,之后每孔加入500 μL染色工作液。工作液配法:取5 μL鈣黃綠素-AM(Calcein-AM)溶液和15 μL碘化丙啶(PI)溶液加入5 mL 1× Assay Buffer,37℃孵育15 min,熒光顯微鏡下使用(490±10)nm 激發(fā)濾片同時檢測活細胞(黃綠色熒光)以及死細胞(紅色熒光)。

1.10 RT-qPCR檢測細胞中NLRP3、GSDMD、Caspase-1、ASC、IL-1β、IL-18、MUC-2和OCLN的mRNA的表達將RAW 264.7細胞按照每孔1×106/個接種于6孔板中,每孔2 mL,細胞分組及處理同1.7;用PBS清洗3次,每孔加入500 μL TRIzol,室溫裂解5 min,收集細胞裂解液于1.5 mL無酶離心管中;向離心管中加入200 μL氯仿,振蕩30 s,室溫靜置3 min;12 000 r/min離心10 min,取上清;加入等體積異丙醇,混勻,室溫靜置10 min;12 000 r/min離心10 min,棄上清;加入1 mL預(yù)冷75%乙醇;10 000 r/min離心5 min,棄上清;將離心管倒扣5 min,加入20～50 μL無菌水,獲得RNA。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書,以RNA為模板進行反轉(zhuǎn)錄,得到cDNA。用表2中引物進行擴增。擴增程序:95℃預(yù)變性120 s;95℃變性5 s,64℃退火30 s;40個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參照基因,采用2-ΔΔCt法計算NLRP3、GSDMD、Caspase-1、ASC、IL-1β、IL-18、MUC-2和OCLN mRNA的相對表達量。重復(fù)以上試驗3次。

表2 RT-qPCR引物與探針序列相關(guān)信息

1.11 Western blot檢測細胞中NLRP3、GSDMD、Caspase-1和ASC蛋白的表達將RAW 264.7細胞按照每孔1×106/個接種于6孔板中,每孔2 mL。收集細胞提取蛋白并用BCA蛋白定量檢測試劑盒測定蛋白質(zhì)量濃度。通過SDS-PAGE分離蛋白,將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,用5%的脫脂奶粉封閉液在室溫下封閉2 h,分別孵育NLRP3、GSDMD、Caspase-1、ASC和β-actin(1∶1 000)抗體,4℃過夜。用TBST緩沖液洗膜3次,每次15 min,在室溫下孵育相對應(yīng)的二抗2 h,用TBST緩沖液洗膜3次,每次15 min,用ECL化學發(fā)光法曝光。使用Image J軟件分析條帶灰度值。重復(fù)以上試驗3次。

2 結(jié) 果

2.1 AAL中藥活性成分和靶點篩選文獻報道的AAL成分共66個,經(jīng)ADME篩選保留其中29個活性成分,對以上成分進行靶點預(yù)測時發(fā)現(xiàn),共有6個成分 ((-)-Epicatechin,(-)-Gallocatechin,Cianidanol,(+)-Gallocatechin,(-)-Epicatechin,(+)-Epicatechin)無法預(yù)測靶點,其余23個成分共預(yù)測出359個靶點。構(gòu)建“AAL-有效成分”網(wǎng)絡(luò)圖(圖1A),將有效成分按Degree值排序,前4分別為槲皮素,5,7,4c-三羥(基)黃酮、黃芩素和柚皮素。

圖1 AAL治療UC的潛在靶點分析

通過疾病數(shù)據(jù)庫一共獲得4 766個UC相關(guān)靶點,取交集后獲得210個交集靶點(圖1B)。由PPI網(wǎng)絡(luò)圖(圖1C)可知AAL最有可能通過交集靶點中的AKT1,VEGFA,EGFR,SRC,CASP3,MAPK3等發(fā)揮抗UC的作用。

2.2 AAL治療UC的靶點GO及KEGG分析將AAL治療UC的核心靶點導(dǎo)入David數(shù)據(jù)庫進行功能分析與通路富集分析,進行GO功能分析,共獲得生物過程(biological process,BP)247個,主要涉及:RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控,凋亡過程的負調(diào)控,基因表達的正向調(diào)節(jié),細胞增殖的正向調(diào)節(jié),DNA模板轉(zhuǎn)錄的正調(diào)節(jié),信號傳輸;細胞組份(cellular component,CC)27個,主要涉及:細胞質(zhì),細胞核,核漿,質(zhì)膜;分子功能(molecular function,MF)45個,主要涉及:蛋白結(jié)合,相同蛋白結(jié)合,酶結(jié)合。將各功能排名前10的BP、CC及MF繪制成柱狀圖(圖2A)。根據(jù)富集程度和顯著性,篩選出了排名前20的KEGG信號通路(圖2B),主要涉及癌癥中的通路,癌癥中的蛋白聚糖,癌癥中的微小核糖核酸,脂質(zhì)和動脈粥樣硬化,人巨細胞病毒感染,PI3K-Akt信號通路等與治療UC有關(guān)的通路。并通過Cytoscape構(gòu)建“中藥-靶點-信號通路-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖(圖2C)。

圖2 AAL治療UC的GO、KEGG分析及“中藥-靶點-信號通路-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 AAL抑制LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7巨噬細胞活力的增加與空白對照組相比,RAW 264.7細胞受到LPS (10,5,1 mg/L) 刺激后,細胞活力均顯著升高 (P<0.01),證明炎癥模型造模成功。后續(xù)試驗中選擇最低有效質(zhì)量濃度1 mg/L作為造模劑量。

如圖3所示,與對照組相比,AAL給藥組呈現(xiàn)低濃度促進RAW 264.7細胞增殖,高濃度抑制RAW 264.7細胞增殖的效果,其中給予900,800,700 mg/L AAL處理后,RAW 264.7細胞活力下降(P<0.01),表明巨噬細胞增殖受到顯著抑制。后續(xù)試驗中選用有效抑制濃度900,800,700 mg/L分別作為AAL高、中、低劑量組給藥濃度。

圖3 不同濃度AAL與LPS處理后的RAW 264.7細胞活力

2.4 AAL降低LPS誘導(dǎo)的細胞的凋亡采用Calcein-AM/PI活/死細胞染色法測定活細胞比率,其中紅色熒光代表凋亡細胞,綠色熒光代表活細胞。結(jié)果如圖4所示,與空白對照組相比,LPS組紅色熒光增多,活細胞比率顯著降低,證明LPS可誘導(dǎo)細胞大量凋亡。與LPS組相比,小檗堿組和AAL低、中、高劑量組的紅色熒光明顯減少,綠色熒光增多,表明鹽酸小檗堿與AAL均可以恢復(fù)由LPS造成的細胞凋亡(P<0.01),并且AAL對凋亡的抑制作用呈劑量依賴性增強。

A.對照組;B.LPS處理組;C.BBR組; D～F.分別為AAL低、中、高劑量組。柱狀圖是對圖A～F中活細胞比率的定量分析結(jié)果。**P<0.01,與空白對照組差異極顯著;##P<0.01,與LPS組差異極顯著。下同

2.5 AAL對LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7巨噬細胞IL-1β和IL-18的mRNA 表達的影響與對照組相比,LPS造模組IL-1β和IL-18-RNA所表達水平均顯著升高 (P<0.01);與LPS組相比,AAL低、中、高劑量的IL-1β和IL-18 mRNA水平顯著下降 (P<0.01)(圖5)。

圖5 AAL對LPS誘導(dǎo)RAW 264.7巨噬細胞IL-1β(A)和IL-18(B) mRNA 表達的影響

2.6 AAL對LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7巨噬細胞NLRP3,GSDMD,Casp1和ASC的mRNA表達的影響RAW 264.7細胞中炎癥小體NLRP3相關(guān)基因 (NLRP3,GSDMD,Casp1和ASC)的表達結(jié)果見圖6。與對照組相比,模型組中RAW 264.7巨噬細胞NLRP3、GSDMD、Casp1和ASC的mRNA表達顯著升高 (P<0.01);鹽酸小檗堿及高、中、低劑量AAL處理后以上基因表達量與模型組相比均顯著降低 (P<0.01)。

A～D.NLRP3、GSDMD、Caspase-1和ASC的mRNA 表達水平

2.7 AAL對LPS誘導(dǎo)RAW 264.7巨噬細胞NLRP3,GSDMD,Caspase-1,Pro-caspase-1和ASC蛋白表達的影響基于以上試驗結(jié)果,對aal對LPS誘導(dǎo)RAW 264.7巨噬細胞NLRP3、GSDMD、Caspase-1、Pro-caspase-1和ASC蛋白表達的影響進行了研究。與對照組比較,LPS組NLRP3、GSDMD、Caspase-1、Pro-caspase-1和ASC的蛋白表達水平均顯著升高 (P<0.01);小檗堿組和AAL低、中、高劑量組與LPS造模組比較,以上指標均顯著下調(diào) (P<0.01)(圖7)。

A.NLRP3、GSDMD-N、Pro-caspase-1、Caspase-1和ASC的蛋白表達水平;B～F.分別為NLRP3、GSDMD、Caspase-1、Pro-caspase-1和ASC 蛋白表達量化結(jié)果

2.8 AAL對LPS誘導(dǎo)RAW 264.7巨噬細胞OCLN和MUC-2 mRNA 表達的影響從MUC-2和OCLN 2個蛋白的基因角度研究了AAL是否可以調(diào)節(jié)LPS誘導(dǎo)的腸屏障損傷。LPS組與對照組相比,OCLN和MUC-2的mRNA表達均顯著下降 (P<0.01);小檗堿組和低、中、高劑量AAL組與LPS造模組比較,以上指標均顯著升高 (P<0.01)(圖8)。

圖8 AAL對LPS誘導(dǎo)RAW 264.7巨噬細胞OCLN(A)和MUC-2(B)mRNA 表達的影響

3 討論

AAL廣泛分布于美洲、非洲和亞洲的熱帶和亞熱帶地區(qū)的路邊和農(nóng)田[12],國內(nèi)常將其用于止血、止痢、止瀉,且發(fā)現(xiàn)AAL對治療慢性結(jié)腸炎具有較好的效果[13-14]。據(jù)報道,AAL治療人慢性結(jié)腸炎的總有效率達到96.4%[4]。但其中的具體機制尚不明確。通過網(wǎng)絡(luò)藥理學分析發(fā)現(xiàn)AAL治療UC潛在活性成分主要為槲皮素、5,7,4c-三羥(基)黃酮、黃芩素、柚皮素等。有關(guān)研究發(fā)現(xiàn)槲皮素可通過上調(diào)SIRT1表達,抑制NLRP3促炎反應(yīng),提高M2型巨噬細胞介導(dǎo)的抗炎和促神經(jīng)恢復(fù)作用,改善實驗性巨結(jié)腸大鼠結(jié)腸炎性損傷[15]。按照DPPH方法測試5,7,4c-三羥(基)黃酮的自由基清除活性(FRSA),結(jié)果顯示其抗氧化活性呈劑量依賴性[16]。黃芩素通過miR-192-5p/TXNIP軸抑制NLRP3/Caspase-1通路減輕高脂血癥性胰腺炎的細胞焦亡和炎癥[17]。柚皮素通過miR-22抑制NLRP3炎癥小體并減輕UC大鼠模型腸屏障損傷[18]。在PPI蛋白互作結(jié)果中可知,AKT1,VEGFA,EGFR,SRC,CASP3,MAPK3的節(jié)點較大,推測這些節(jié)點可能是治療UC的主要靶點。通過David數(shù)據(jù)庫進行GO以及KEGG富集分析,主要涉及凋亡過程的負調(diào)控及PI3K-Akt信號通路等過程。提示AAL治療UC的潛在作用機制多集中在影響細胞增殖、轉(zhuǎn)移以及凋亡等生物過程。

小檗堿是一種異喹啉類生物堿,從傳統(tǒng)中藥黃連中提取而來[19],早在1977年就有報道稱小檗堿能抑制霍亂毒素所致的炎癥反應(yīng)[18],近年來研究表明小檗堿可以通過多種信號途徑發(fā)揮其抗炎作用并且效果顯著[20-21]。故在本研究中,利用LPS誘導(dǎo)體外炎癥模型,并使用小檗堿作為陽性對照藥物,初步確定了AAL抗炎作用的效果以及通過NLRP3炎癥小體發(fā)揮抗炎作用的機制。

巨噬細胞作為炎癥反應(yīng)中的關(guān)鍵細胞,通過釋放多種促炎細胞因子和介質(zhì)防止病原體入侵。LPS是常見的炎癥介導(dǎo)因子,通過誘導(dǎo)巨噬細胞中許多促炎介質(zhì)的表達而充當炎癥的有效引發(fā)劑[13]。在LPS誘導(dǎo)的巨噬細胞炎癥模型中,細胞外LPS被Toll樣受體4(toll like receptor 4,TLR4)識別,導(dǎo)致大量促炎因子產(chǎn)生,誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)[22-23]。本研究發(fā)現(xiàn),使用10.0,5.0,1.0,0.5 mg/L的LPS處理小鼠RAW 264.7細胞后,細胞活力均顯著升高 (P<0.05),這與研究報道結(jié)果一致[23-24],表明LPS誘導(dǎo)不同程度的炎癥反應(yīng),本試驗選用最低有效濃度1 mg/L作為后續(xù)試驗造模濃度。使用900,800,700 mg/L 的AAL濾液處理可以顯著降低經(jīng)LPS處理后的細胞活力 (P<0.01),減輕LPS刺激的RAW 264.7巨噬細胞炎癥反應(yīng)。同時本研究通過Calcein-AM/PI染色發(fā)現(xiàn),與對照組相比,LPS處理后活細胞比率下降,AAL預(yù)處理后活細胞比率升高,表明LPS在刺激巨噬細胞增殖的同時會造成細胞損傷死亡,而AAL可以逆轉(zhuǎn)這一現(xiàn)象。這可能與LPS激活NLRP3炎癥小體有關(guān)。因此本研究通過檢測NLRP3炎癥小體相關(guān)mRNA及蛋白表達,進一步探究了AAL濾液減輕炎癥的分子機制。

炎癥小體包括NLRP1、NLRP3、NLRC4、AIM2、NLRP6等亞型,其中NLRP3是研究最為全面的亞型之一,正迅速成為腸道內(nèi)穩(wěn)態(tài)和腸道炎癥反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)因子。巨噬細胞識別病原體相關(guān)分子模式 (pathogen-associated molecular patterns,PAMPs) 信號,并通過模式識別受體 (pattern recognition receptor,PRR) 啟動炎癥反應(yīng),TLR4通過識別LPS進一步激活NLRP3,NLRP3受到損傷相關(guān)分子模式 (damage associated molecular patterns,DAMPs) 信號刺激,與ASC和Pro-caspase-1組裝成活性NLRP3炎癥小體復(fù)合物,釋放成熟的Caspase-1,后者將GSDMD切割為C端和N端,GSDMD-N端片段與質(zhì)膜結(jié)合誘導(dǎo)細胞焦亡,死亡細胞大量釋放IL-1β和IL-18,導(dǎo)致炎癥發(fā)生[25-27]。本研究發(fā)現(xiàn),與空白對照組相比,LPS處理后小鼠RAW 264.7巨噬細胞中NLRP3、GSDMD-N、ASC、Pro-caspase-1、Caspase-1的mRNA水平和蛋白表達水平顯著上升,IL-1β和IL-18的mRNA水平顯著增加,與JIE等[27]研究結(jié)果一致,提示NLRP3/Caspase-1通路的異常激活參與LPS誘導(dǎo)的炎癥。用不同濃度的AAL預(yù)處理細胞,研究AAL對NLRP3炎癥小體和炎癥的影響,發(fā)現(xiàn)AAL可以降低Caspase-1焦亡途經(jīng)中關(guān)鍵基因的mRNA和蛋白表達水平,提示AAL可能通過抑制NLRP3/Caspase-1信號通路抑制細胞焦亡,降低炎性細胞因子水平,發(fā)揮抗炎作用。

在各類炎癥反應(yīng)中,腸道炎癥參與多種疾病進展。腸黏膜屏障對于維持腸道內(nèi)穩(wěn)態(tài)、抵御病原微生物入侵有關(guān)鍵作用。MUC-2由杯狀細胞分泌,是小腸黏液的主要成分之一,對腸上皮細胞有保護和潤滑作用。Occludin是一種緊密連接蛋白,對于維持腸道屏障的完整性和功能具有重要意義[28-29]。本研究發(fā)現(xiàn),與對照組相比,LPS處理顯著下調(diào)了OCLN和MUC-2的mRNA表達水平,AAL處理后顯著提高了MUC-2和OCLN的mRNA表達水平,表明AAL可以減輕LPS誘導(dǎo)的腸黏膜屏障損傷,提示AAL可以通過維持腸黏膜屏障減輕炎癥反應(yīng)。

綜上所述,通過LPS建立的體外炎癥模型中,AAL具有顯著抗炎作用,其作用機制可能與抑制NLRP3/Caspase-1信號通路的關(guān)鍵基因有關(guān),從而降低炎癥因子的釋放。表明AAL可以為炎癥性疾病提供新的治療策略。