氯胺酮通過抑制谷氨酸受體和蛋白激酶損害孕鼠子代的學(xué)習(xí)記憶能力

趙菁華,姜 勝,張儒新,李沫萱,楊 玙,秦 潛,高 利,曾 歡*,王 巍*,宋厚輝*

(1.浙江農(nóng)林大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院/動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 浙江省畜禽綠色生態(tài)健康養(yǎng)殖應(yīng)用技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/動(dòng)物健康互聯(lián)網(wǎng)檢測(cè)技術(shù)浙江省工程研究中心,浙江 杭州 311300;2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院,黑龍江 哈爾濱 150030)

學(xué)習(xí)和記憶是大腦的高級(jí)功能,麻醉藥物的使用是否會(huì)影響學(xué)習(xí)和記憶能力已引起越來越多的關(guān)注[1-2]。有關(guān)報(bào)道表明有些全身麻醉患者可能出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙[3]。幾乎2%的孕婦因各種原因需要手術(shù)治療,產(chǎn)前因素是影響后代智力發(fā)育的主要因素[4-5]。近年來,在嚙齒類動(dòng)物和靈長(zhǎng)類動(dòng)物進(jìn)行的大量試驗(yàn)表明,臨床中常用的麻醉劑(如氯胺酮)會(huì)導(dǎo)致大腦發(fā)育障礙、神經(jīng)毒性和長(zhǎng)期認(rèn)知功能障礙[6-7]。常用的麻醉劑大多是脂溶性的,容易通過血腦屏障,進(jìn)入胎兒血液循環(huán)和腦組織。因此,麻醉藥是否會(huì)損害胎兒的大腦發(fā)育尤其值得關(guān)注[8-9]。研究表明,海馬體是氯胺酮損傷的主要部位,而且海馬的CA1和CA3區(qū)域被認(rèn)為與空間學(xué)習(xí)和記憶能力密切相關(guān)[10]。麻醉劑量的氯胺酮會(huì)導(dǎo)致認(rèn)知能力的改變,然而潛在的機(jī)制仍不清楚。

谷氨酸受體在大腦皮層和海馬中高度表達(dá),并在神經(jīng)發(fā)育、學(xué)習(xí)記憶、感覺和突觸可塑性中發(fā)揮核心作用。因此,神經(jīng)元中谷氨酸受體的調(diào)節(jié)對(duì)于突觸傳遞非常重要[11]。蛋白激酶(CaMKⅡ、PKA、PKC)對(duì)突觸可塑性也發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用,大量研究報(bào)道神經(jīng)元細(xì)胞中蛋白激酶的激活參與離子通道、受體脫敏、神經(jīng)遞質(zhì)釋放和突觸傳遞的調(diào)節(jié),這個(gè)過程是長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(LTP)形成的分子機(jī)制之一[12-13]。本研究通過建立孕鼠氯胺酮暴露模型,探究氯胺酮對(duì)子代幼鼠行為學(xué)、軸突數(shù)目、尼氏小體和樹突棘密度的影響,檢測(cè)海馬中谷氨酸受體和相關(guān)蛋白激酶的表達(dá),研究結(jié)果將為獸醫(yī)臨床麻醉藥物的使用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物將體質(zhì)量(230±20) g的雄性和雌性Wistar大鼠置于溫度和濕度適宜的環(huán)境中,自由采食飲水,并進(jìn)行12 h的光照/黑暗循環(huán)。所有動(dòng)物的試驗(yàn)程序均按照浙江農(nóng)林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)規(guī)范進(jìn)行。

1.2 主要試劑氯胺酮(購(gòu)自沈陽(yáng)市獸藥廠);RIPA裂解液、PMSF、蛋白上樣緩沖液、BCA蛋白定量試劑盒、尼氏染液等購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司;蛋白Marker購(gòu)自上海天能科技有限公司;GAPDH、CaMKⅡ、PKA、PKC、GluR1、GluR2、GluN1、GluN2A和GluN2B單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)CST;IgG-HRP抗體購(gòu)自上海優(yōu)寧維生物科技股份有限公司;脫脂奶粉購(gòu)自完達(dá)山乳品有限公司;高爾基染液購(gòu)自合肥萬(wàn)物生物;反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司;試驗(yàn)中使用的引物都由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3 主要儀器水迷宮試驗(yàn)系統(tǒng)購(gòu)自上海然哲儀器廠;超凈工作臺(tái)購(gòu)自上海燈晟儀器廠;-80℃冰箱購(gòu)自青島海爾集團(tuán);EPS 300電泳儀購(gòu)自上海天能科技有限公司;SX-500高壓滅菌鍋購(gòu)自上海天美科技有限公司;液氮罐購(gòu)自美國(guó)Thermo Scientific公司;倒置顯微鏡購(gòu)自日本Nikon;梯度PCR儀購(gòu)自日本TaKaRa Bio株式會(huì)社。

1.4 麻醉及樣品采集將30只Wistar大鼠分成10個(gè)籠子(每個(gè)籠子1只雄鼠和2只雌鼠),底部放置1個(gè)鐵網(wǎng)。第2天如果檢測(cè)到雌鼠陰道內(nèi)有陰道栓子,則認(rèn)為該鼠已懷孕,標(biāo)記為妊娠第0天,并將孕鼠隔離飼養(yǎng)。妊娠第14天,將20只孕鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(C組,n=10)和氯胺酮組(K組,n=10)。氯胺酮組孕鼠首先肌肉注射氯胺酮(80 mg/kg),每隔1 h按照40 mg/kg補(bǔ)藥3次,對(duì)照組孕鼠同樣時(shí)間注射相同體積的生理鹽水。在子代出生后第25～29天,連續(xù)5 d分別取對(duì)照組和氯胺酮組子代幼鼠進(jìn)行Morris水迷宮試驗(yàn)。行為學(xué)試驗(yàn)結(jié)束后,將子代幼鼠斷頸處死,分離出海馬體,1/2放入液氮凍存,其余組織固定在10%福爾馬林溶液中。

1.5 Morris水迷宮試驗(yàn)在直徑為120 cm、高50 cm 的圓形水箱中裝滿35 cm深的水,并保持(24±1)℃的溫度。迷宮被分成4個(gè)大小相等的象限:SW、SE、NE和NW。在其中1個(gè)象限中,逃生平臺(tái)被淹沒在水面以下1.5 cm處。在出生后第25～29天,子代幼鼠連續(xù)5 d接受測(cè)試,每日4次(測(cè)試間隔60～70 min)。將每只大鼠依次放入4個(gè)象限中,最多允許60 s定位平臺(tái)。如果大鼠在60 s 內(nèi)沒有到達(dá)平臺(tái),則將它們引導(dǎo)到平臺(tái),然后讓它們?cè)谀抢锿Ａ?0 s。所有測(cè)試都進(jìn)行錄像,并通過視頻跟蹤系統(tǒng)記錄60 s內(nèi)大鼠游泳路徑軌跡以及進(jìn)入平臺(tái)象限區(qū)域的次數(shù)。

1.6 透射電鏡觀察將子代幼鼠海馬切成小于1 mm3的組織塊,用2.5%戊二醛磷酸緩沖液固定2 h;將0.2 mol/L磷酸緩沖液與雙蒸水等量混合配成沖洗液,沖洗組織塊2次,每次間隔15 min。先后采用酒精和丙酮進(jìn)行脫水,包埋后將組織塊修成塔形,用超薄切片機(jī)切成超薄切片,再置于銅網(wǎng)上。用枸櫞酸鉛染色液對(duì)切片進(jìn)行染色,最后,將載有超薄切片的銅網(wǎng)置于透射電鏡內(nèi)進(jìn)行觀察和拍攝。將照片輸入形態(tài)學(xué)圖像分析系統(tǒng)中,對(duì)照片中的軸突進(jìn)行識(shí)別計(jì)數(shù)。

1.7 尼氏小體染色將固定好的海馬體先制作成組織切片,使用二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ進(jìn)行脫蠟,然后使用100%,95%,90%,80%,70%,50%的酒精進(jìn)行梯度濃度脫水,每次浸泡5 min,接著使用蒸餾水對(duì)組織切片進(jìn)行3次沖洗,每次5 min。沖洗后使用1%甲苯胺藍(lán)染色40 min,最后使用蒸餾水將切片上殘余的染液清洗干凈,再置于不同濃度的酒精中進(jìn)行脫水,最后經(jīng)過二甲苯透明后,使用中性樹膠封片。

1.8 高爾基染色通過高爾基染色可以顯示神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞樹突棘的形態(tài)變化。將子代幼鼠的海馬體切成5 mm厚的小塊,浸泡在1.5%的硝酸鹽水溶液中鍍銀,避光儲(chǔ)存3 d,每天都使用新的鍍銀液體,目的是使鍍銀更加充分。使用火棉膠包埋組織塊,使用切片機(jī)切片,將切片置于2%的重鉻酸鉀水溶液中進(jìn)行漂洗,漂洗時(shí)間為10～15 min,當(dāng)天可以放1張蓋玻片,在顯微鏡下直接觀察。

1.9 RT-PCR本試驗(yàn)所用引物序列詳見表1。對(duì)海馬體中的總RNA進(jìn)行提取:將海馬體放入1 mL 的TRIzol裂解液中進(jìn)行研磨,經(jīng)過兩相分離后,得到的上層透明液體即為提取的RNA。上清中加入等體積的異丙醇,混合后進(jìn)行離心,經(jīng)過清洗和干燥后,使用移液槍反復(fù)吹打?qū)NA完全溶解。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。RT-PCR反應(yīng)結(jié)束后,應(yīng)用2-ΔΔCt計(jì)算RT-PCR數(shù)據(jù)。

表1 引物相關(guān)信息

1.10 Western blot首先取0.1 g的海馬組織加入裂解液,然后進(jìn)行研磨,所有操作都要在液氮里進(jìn)行。將取出的樣品裂解完全后進(jìn)行離心,取上清進(jìn)行蛋白含量的測(cè)定,加入染液進(jìn)行定量測(cè)定。配制分離膠和濃縮膠,上層膠的電泳條件為80 V、25 min,下層膠的電泳條件為120 V、70 min左右。使用200 mA電流進(jìn)行轉(zhuǎn)膜,封閉結(jié)束后孵育一抗,抗體分別為GAPDH、CaMKⅡ、PKA、PKC、GluR1、GluR2、GluN1、GluN2A和GluN2B。使用二抗進(jìn)行孵育后進(jìn)行洗滌曝光,最后使用Image J軟件對(duì)蛋白條帶進(jìn)行分析。

1.11 數(shù)據(jù)處理使用GraphPad Prism 7.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析,對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)分析和方差齊性檢驗(yàn)后,使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析對(duì)照組和氯胺酮組的數(shù)據(jù)。P<0.05為兩組數(shù)據(jù)之間存在顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 氯胺酮麻醉對(duì)子代幼鼠學(xué)習(xí)記憶的影響在Morris水迷宮試驗(yàn)中,每次試驗(yàn)60 s內(nèi)小鼠尋找到平臺(tái)所用的時(shí)間即為逃逸潛伏期測(cè)定值。結(jié)果顯示,在測(cè)試第2～4天,對(duì)照組和氯胺酮組子代幼鼠的逃逸潛伏期存在顯著性差異(P<0.01)。而且隨著測(cè)試天數(shù)的增加,兩組大鼠的逃避潛伏期測(cè)定值逐漸降低(圖1A)。同時(shí)比較了60 s內(nèi)兩組大鼠跨越平臺(tái)次數(shù),結(jié)果發(fā)現(xiàn)氯胺酮組大鼠的次數(shù)比對(duì)照組降低,但兩組之間沒有顯著性差異(圖1B)。對(duì)照組大鼠尋找平臺(tái)的運(yùn)動(dòng)軌跡比氯胺酮組更密集,活動(dòng)范圍幾乎覆蓋整個(gè)水池內(nèi)(圖1C,D)。檢測(cè)結(jié)果說明氯胺酮麻醉會(huì)損傷子代幼鼠在空間方面的學(xué)習(xí)記憶能力。

A.定位導(dǎo)航試驗(yàn)60 s內(nèi)找到平臺(tái)的時(shí)間;B.子代幼鼠穿過平臺(tái)區(qū)域的次數(shù);C～D.大鼠在空間探索試驗(yàn)中的運(yùn)動(dòng)軌跡。與對(duì)照組比較,*示P<0.05,**示P<0.01。下同

2.2 氯胺酮麻醉對(duì)子代幼鼠神經(jīng)元軸突數(shù)量的影響使用透射電子顯微鏡觀察了子代幼鼠海馬CA1和CA3區(qū)軸突數(shù)目,圖片中可以看到大量有髓鞘包繞的軸突終末(Ax),每個(gè)軸突終末內(nèi)均含有大量的突觸小泡和線粒體。從圖片分析結(jié)果可以看出,在CA1和CA3區(qū),對(duì)照組的軸突終末數(shù)目顯著高于氯胺酮組,軸突分布緊密,并和臨近的樹突形成突觸連接,氯胺酮組軸突終末分布的比較稀疏(圖2A～D)。每張片子隨機(jī)選擇5個(gè)不同區(qū)域進(jìn)行軸突數(shù)目計(jì)數(shù),發(fā)現(xiàn)氯胺酮麻醉導(dǎo)致子代幼鼠CA1和CA3區(qū)軸突數(shù)目顯著降低(P<0.01)(圖2E)。

A.對(duì)照組海馬體CA1區(qū)軸突(Ax)形態(tài);B.氯胺酮組海馬體CA1區(qū)軸突形態(tài);C.對(duì)照組海馬體CA3區(qū)軸突形態(tài);D.氯胺酮組海馬體CA3區(qū)軸突形態(tài);E.兩組大鼠單位面積內(nèi)軸突數(shù)目統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果

2.3 氯胺酮麻醉對(duì)子代幼鼠神經(jīng)元尼氏小體的影響尼氏小體是分布于神經(jīng)細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)的三角形或橢圓形小塊狀物質(zhì),能被堿性染料染成藍(lán)色。每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)不同的視野進(jìn)行觀察,結(jié)果發(fā)現(xiàn)對(duì)照組子代幼鼠神經(jīng)元尼氏小體數(shù)量更多,排列更密集,染色更深(圖3C,E)。氯胺酮組的神經(jīng)元尼氏小體染色明顯變淺,尼氏小體出現(xiàn)溶解或萎縮,邊緣混亂(圖3D,F)。光密度分析結(jié)果表明,氯胺酮麻醉后海馬體CA1和CA3區(qū)尼氏小體平均光密度相對(duì)于對(duì)照組顯著降低(P<0.01),與切片染色結(jié)果相一致(圖3G)。

A.對(duì)照組海馬體尼氏染色整體形態(tài);B.氯胺酮組海馬體尼氏染色整體形態(tài);C,D.兩組大鼠CA1區(qū)尼氏小體染色結(jié)果;E,F.兩組大鼠CA3區(qū)尼氏小體染色結(jié)果;G.兩組大鼠單位面積內(nèi)尼氏小體數(shù)目統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果

2.4 氯胺酮麻醉對(duì)子代幼鼠神經(jīng)元樹突棘數(shù)量的影響高爾基染色可以將神經(jīng)元上的樹突棘染成黑色,使用光學(xué)顯微鏡在油鏡下對(duì)海馬CA1和CA3區(qū)的樹突棘進(jìn)行計(jì)數(shù),隨機(jī)選擇10 μm長(zhǎng)度的不同神經(jīng)元的梢部和基部,計(jì)算每組樹突上的棘數(shù)量,從而明確氯胺酮麻醉對(duì)神經(jīng)元形態(tài)可塑性的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),氯胺酮組樹突棘稀疏(圖4C～D,H～I(xiàn)),無(wú)論是CA1或者CA3區(qū),氯胺酮組單位長(zhǎng)度上的樹突棘數(shù)量相對(duì)于對(duì)照組都顯著降低(P<0.05)(圖4E,J)。

A～B.對(duì)照組CA1區(qū)梢部和基部樹突棘形態(tài);C～D.氯胺酮組CA1區(qū)梢部和基部樹突棘形態(tài);E.兩組大鼠CA1區(qū)單位長(zhǎng)度內(nèi)樹突棘數(shù)目統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果;F～G.對(duì)照組CA3區(qū)梢部和基部樹突棘形態(tài);H～I(xiàn).氯胺酮組CA3區(qū)梢部和基部樹突棘形態(tài);J.兩組大鼠CA3區(qū)單位長(zhǎng)度內(nèi)樹突棘數(shù)目統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果

2.5 氯胺酮麻醉對(duì)子代幼鼠谷氨酸受體和蛋白激酶基因表達(dá)的影響使用RT-PCR方法檢測(cè)海馬區(qū)離子型谷氨酸受體和蛋白激酶基因的轉(zhuǎn)錄水平。研究發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組比較,氯胺酮麻醉組的CaMKⅡ、PKC、GLuN2A和GluR1的基因表達(dá)顯著降低(P<0.05),GLuN1和GLuN2B的基因表達(dá)存在極顯著性差異(P<0.01),PKA和GluR2的基因表達(dá)量雖然降低,但相對(duì)于對(duì)照組沒有顯著性差異(P>0.05)(圖5)。

A～H.分別為CaMKⅡ、PKA、PKC、GLuN2A、GLuN2B、GLuR1和GLuR2基因的表達(dá)水平

2.6 氯胺酮麻醉對(duì)子代幼鼠谷氨酸受體和蛋白激酶蛋白表達(dá)的影響使用Western blot方法檢測(cè)海馬區(qū)離子型谷氨酸受體和蛋白激酶的蛋白表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),麻醉組的CaMKⅡ(P<0.05)、PKA、PKC、GLuN2A、GLuN2B、GluR1和GluR2的蛋白表達(dá)相對(duì)于對(duì)照組顯著降低(P<0.01),但兩組之間的GLuN1蛋白表達(dá)沒有顯著性差異(P>0.05)(圖6)。

A～H.分別為CaMKⅡ、PKA、PKC、GLuN2A、GLuN2B、GLuR1和GLuR2蛋白的表達(dá)水平

3 討論

氯胺酮屬于苯環(huán)已哌啶類靜脈麻醉藥,對(duì)呼吸系統(tǒng)的抑制作用較小,因此廣泛應(yīng)用于中外獸醫(yī)臨床[14]。幾乎所有的麻醉藥都會(huì)通過胎盤屏障,之前有研究發(fā)現(xiàn)很多麻醉藥都會(huì)導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元發(fā)生凋亡,并導(dǎo)致晚年的行為障礙[15]。本研究發(fā)現(xiàn)在母鼠懷孕第14天持續(xù)注射氯胺酮會(huì)導(dǎo)致子代幼鼠學(xué)習(xí)和記憶功能發(fā)生損傷。Morris水迷宮試驗(yàn)通常用來評(píng)估子代幼鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力,本研究發(fā)現(xiàn)氯胺酮組幼鼠需要花費(fèi)更多的時(shí)間才能找到定位平臺(tái),說明子代幼鼠的空間學(xué)習(xí)記憶功能水平降低。

尼氏小體主要參與神經(jīng)元蛋白質(zhì)的合成,在細(xì)胞發(fā)生損傷時(shí),尼氏小體的形態(tài)會(huì)發(fā)生敏感性變化,因此常用尼氏染色來判斷神經(jīng)元的狀態(tài)[16]。尼氏小體染色常用的染料包括甲酚紫和甲苯胺藍(lán)等,可以將尼氏小體染成藍(lán)色,藍(lán)色顆粒的密度和數(shù)量與神經(jīng)元狀態(tài)呈正相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)奎寧等化學(xué)藥物會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞出現(xiàn)空泡變性,尼氏小體大量溶解或消失,進(jìn)而導(dǎo)致與突觸相關(guān)的蛋白質(zhì)的合成減少[17]。本研究發(fā)現(xiàn),氯胺酮麻醉會(huì)導(dǎo)致子代幼鼠神經(jīng)細(xì)胞尼氏小體的數(shù)量降低,說明孕鼠持續(xù)使用氯胺酮會(huì)導(dǎo)致后代的神經(jīng)元發(fā)生損傷,并進(jìn)一步導(dǎo)致神經(jīng)生長(zhǎng)相關(guān)蛋白的合成減少。突觸在神經(jīng)傳遞中發(fā)揮重要作用,軸突和樹突的正常狀態(tài)可以保證整個(gè)神經(jīng)系統(tǒng)信號(hào)傳遞有規(guī)律的進(jìn)行。本研究中透射電鏡和高爾基染色結(jié)果表明,氯胺酮也會(huì)使海馬體軸突和樹突棘的數(shù)量減少,突觸信息傳遞功能受損,進(jìn)而導(dǎo)致子代幼鼠學(xué)習(xí)和記憶功能水平降低。

中樞神經(jīng)系統(tǒng)的突觸可塑性是機(jī)體完成高級(jí)功能(如學(xué)習(xí)和記憶)的基礎(chǔ),突觸可塑性相關(guān)蛋白的合成對(duì)于維持神經(jīng)系統(tǒng)的正常功能非常重要。中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的突觸傳遞主要由谷氨酸介導(dǎo)的興奮性突觸完成,并導(dǎo)致興奮性突觸后電位的出現(xiàn)。NMDA和AMPA型谷氨酸受體是突觸后膜的重要組成部分,因?yàn)樗鼈儗?duì)于突觸傳遞至關(guān)重要。研究報(bào)告稱,阻斷NMDA受體會(huì)降低突觸可塑性并損害兒童突觸前發(fā)育的學(xué)習(xí)和記憶[18]。分布在海馬體中的NMDA受體介導(dǎo)學(xué)習(xí)和記憶功能,是產(chǎn)生和維持LTP的關(guān)鍵部分。在本研究中,我們發(fā)現(xiàn)NMDA受體亞基(GLuN1、GLuN2A、GLuN2B)的表達(dá)下降,說明氯胺酮抑制了NMDA受體的激活,損傷了突觸,最終導(dǎo)致子代幼鼠學(xué)習(xí)和記憶能力下降。除此之外,神經(jīng)系統(tǒng)許多重要功能也需要AMPA受體參與,包括突觸可塑性的維持和記憶的形成[19]。有人提出突觸后蛋白的棕櫚酰化可上調(diào)AMPA受體膜的表達(dá)并增強(qiáng)突觸功能,從而間接表明AMPA受體對(duì)突觸功能的重要性[20]。YANG等[21]報(bào)道苯并芘通過阻礙谷氨酸神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞來降低AMPA受體亞基的表達(dá),從而增加SNAP-25的含量并擴(kuò)大突觸間隙,最終影響突觸的傳遞。這與本研究結(jié)果相似,本研究中氯胺酮麻醉導(dǎo)致AMPA受體亞基(GluR1和GluR2)含量呈不同程度下降,軸突和樹突棘密度也呈不同程度下降,最終削弱了海馬神經(jīng)元的突觸可塑性。

蛋白激酶在LTP和突觸可塑性中發(fā)揮重要作用,它們可以調(diào)節(jié)突觸的相關(guān)功能蛋白,促進(jìn)新樹突棘的形成,并在激活時(shí)影響核轉(zhuǎn)錄因子和蛋白質(zhì)翻譯起始因子的磷酸化狀態(tài)。因此蛋白激酶在LTP的誘導(dǎo)和維持中起著積極的調(diào)節(jié)作用[22]。CaMKⅡ是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶,在突觸后膜高表達(dá),一項(xiàng)研究表明,CaMKⅡ/NMDAR是維持LTP的重要記憶分子[23]。CaMKⅡ還通過C末端特異性絲氨酸的磷酸化增強(qiáng)谷氨酸AMPA受體的磷酸化,CaMKⅡ還可增強(qiáng)AMPA受體功能,影響突觸可塑性[24]。PKA常見于動(dòng)物體內(nèi),是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的重要信號(hào)因子之一。PKA不僅可以調(diào)節(jié)AMPA受體的轉(zhuǎn)運(yùn),還可以促進(jìn)軸突的再生,調(diào)節(jié)突觸前神經(jīng)遞質(zhì)的釋放,從而調(diào)節(jié)突觸活動(dòng)[25]。在本研究中,PKA和AMPA受體亞基的變化呈相同趨勢(shì),氯胺酮麻醉導(dǎo)致兩者的含量均降低,結(jié)合高爾基染色結(jié)果表明,PKA通路對(duì)維持突觸活性至關(guān)重要。大量研究表明PKC與突觸可塑性和LTP的形成密切相關(guān),抑制PKC會(huì)減少LTP的形成,從而影響學(xué)習(xí)和記憶[26]。在目前的研究中,孕鼠注射氯胺酮會(huì)導(dǎo)致子代幼鼠記憶相關(guān)的蛋白激酶表達(dá)顯著降低,這可能是導(dǎo)致突觸可塑性和神經(jīng)功能異常的關(guān)鍵原因。

綜上,對(duì)懷孕中期的母鼠進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間的氯胺酮麻醉會(huì)對(duì)子代幼鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶能力造成損傷,并導(dǎo)致軸突和樹突棘的生成減少,使谷氨酸受體亞基和相關(guān)蛋白激酶的蛋白合成下降。本研究為獸醫(yī)臨床中麻醉藥物的使用提供了理論補(bǔ)充,并為進(jìn)一步降低麻醉藥物的副作用提供了方向。