安石榴苷對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的雞腺胃上皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用機(jī)制

王酉馨,彭璐媛,宋 客,黎 江,譚躍榮,李 淼,伊鵬霏

(吉林大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院,吉林 長(zhǎng)春 130062)

雞腺胃炎是一種以家禽生長(zhǎng)不良、消瘦、整齊度差,糞便過(guò)料等外觀癥狀及腺胃腫大,腺胃黏膜潰瘍、脫落,肌胃內(nèi)金和肌胃黏膜面火山口樣潰瘍、肌胃糜爛為主要特征的流行病[1]。目前,我國(guó)各地均有此病發(fā)生的報(bào)道,給養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的威脅。因其致病因素復(fù)雜,臨床中多采用聯(lián)合用藥對(duì)其治療,療效并不顯著。因此,開(kāi)發(fā)安全有效的藥物對(duì)于雞腺胃炎的防治和家禽養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展都具有重要意義。

胃黏膜具有胃屏障功能,其完整性受多種因素影響。其中,氧化應(yīng)激在胃腸道黏膜疾病的發(fā)病機(jī)制中扮演重要角色,ROS和氧化代謝可引起胃黏膜屏障的紊亂和胃損傷的形成[2];胃黏膜保護(hù)因子PEG2和NO在維持胃黏膜的完整性方面發(fā)揮著重要作用;雞的TFF2轉(zhuǎn)錄遍布整個(gè)胃腸道,主要表達(dá)位點(diǎn)是腺胃和肌胃,對(duì)保護(hù)、修復(fù)上皮細(xì)胞和促進(jìn)上皮創(chuàng)面愈合具有重要作用[3]。細(xì)胞間緊密連接(TJ)是構(gòu)成腸黏膜機(jī)械屏障最重要的結(jié)構(gòu),由緊密連接蛋白o(hù)ccludin和claudin組成,并通過(guò)zona occludens蛋白家族成員ZO-1與相鄰上皮細(xì)胞的這些蛋白進(jìn)行連接,通過(guò)緊密地封閉細(xì)胞與細(xì)胞的連接來(lái)調(diào)節(jié)屏障通透性,控制著細(xì)胞旁轉(zhuǎn)運(yùn)途徑的通透性,在維持胃黏膜屏障功能方面起關(guān)鍵作用[4-5]。

安石榴苷(punicalagin,Pun)是石榴皮中含量最高的多酚類化合物,具有很強(qiáng)的抗氧化活性[6]。已有研究表明,Pun具有胃保護(hù)作用,在熱應(yīng)激誘導(dǎo)的大鼠胃腸道損傷模型中,Pun誘導(dǎo)Nrf2易位和HO-1表達(dá),保護(hù)大鼠腸上皮細(xì)胞免受氧化應(yīng)激的影響[7]?；诖?本研究建立LPS刺激雞腺胃上皮細(xì)胞模型,檢測(cè)雞腺胃上皮細(xì)胞的損傷狀態(tài)、氧化應(yīng)激水平、胃黏膜保護(hù)因子的表達(dá)、緊密連接蛋白的表達(dá)以及Nrf2信號(hào)通路的激活情況,探究Pun對(duì)LPS誘導(dǎo)的雞腺胃上皮細(xì)胞的作用及機(jī)制,為雞腺胃炎的預(yù)防和治療提供新的思路和理論依據(jù),對(duì)家禽養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展具有積極的促進(jìn)意義。

1 材料與方法

1.1 試劑和材料LPS購(gòu)于Sigma-Aldrich公司;PGE2、SOD、CCK8、ROS、LDH、T-GSH、NO檢測(cè)試劑盒購(gòu)于南京建成生物公司;雞腺胃上皮細(xì)胞購(gòu)于青旗(上海)生物技術(shù)發(fā)展有限公司;Pun購(gòu)于成都曼思特生物科技有限公司;DMEM培養(yǎng)基、青霉素/鏈霉素、胰蛋白酶、胎牛血清購(gòu)于Gibco公司;0.25% 胰蛋白酶、RIPA裂解液、PMSF、細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(5×)、蛋白預(yù)染Marker購(gòu)于碧云天生物技術(shù)公司;BCA蛋白定量試劑盒、Power SYBR Green PCR Master Mix購(gòu)于Thermo公司;ML385購(gòu)于Saint-Bio公司;ECL試劑盒購(gòu)于Beyotime公司;PVDF膜購(gòu)于Millipore公司;Western blot試驗(yàn)中的抗體購(gòu)于Jackson ImmunoResearch公司。

1.2 儀器設(shè)備離心機(jī)(Eppendorf);酶標(biāo)儀(Thermo);切片機(jī)(天津天利);二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo);紫外分光光度計(jì)(Eppendorf);熒光定量PCR儀(ABI);酶標(biāo)儀(Thermo);電泳儀(上海天能科技上海天能科技有限公司);流式細(xì)胞分析儀(美國(guó)BD公司);化學(xué)發(fā)光儀(上海天能科技有限公司)。

1.3 雞腺胃上皮細(xì)胞的培養(yǎng)使用含10% FBS和1%青霉素/鏈霉素的DMEM完全培養(yǎng)基將雞腺胃上皮細(xì)胞在37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)36 h。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到80%～90%時(shí)傳代,用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞2 min,然后將細(xì)胞1 000 r/min離心5 min,將細(xì)胞沉淀用完全培養(yǎng)基重懸,調(diào)整細(xì)胞濃度至1×105cell/mL。

1.4 細(xì)胞活力、LDH、ROS、SOD、GSH、PGE2和NO的檢測(cè)將使用細(xì)胞96孔板培養(yǎng)24 h后,用4 mg/L的LPS預(yù)處理24 h,隨后用不同濃度的PUN(4,8,16 μmol/L)處理24 h。根據(jù)檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)。

1.5 qRT-PCR法檢測(cè)TFF2、ZO-1、occludin和claudin-3收集細(xì)胞,用TRIzol試劑提取樣品的總RNA,用分光光度計(jì)檢測(cè)RNA純度和質(zhì)量濃度,將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以GAPDH為內(nèi)參基因,采用3步法進(jìn)行信號(hào)采集:95℃預(yù)變性10 min;95℃變性15 s,55 ℃退火20 s,60℃延伸30 s,40個(gè)循環(huán)。用ABI ViiA7熒光定量PCR儀進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。引物信息見(jiàn)表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.6 Western blot法檢測(cè)總Nrf2、核Nrf2、Keap1和NQO1用預(yù)冷的PBS沖洗腺胃上皮細(xì)胞3次,每孔加入1 mL RIPA裂解緩沖液。使用BCA試劑盒檢測(cè)蛋白的質(zhì)量濃度,取等量樣品在12%分離膠上進(jìn)行 SDS-PAGE。然后取出凝膠在200 mA、4℃下將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,室溫下用5%牛血清白蛋白封閉90 min。在4℃下與稀釋的抗體(1∶1 000)孵育過(guò)夜。將HRP標(biāo)記的二抗按1∶10 000用TBS稀釋,被膜與稀釋的二抗在室溫下孵育 2 h。用化學(xué)發(fā)光法(ECL)顯影,用ImageJ對(duì)圖像進(jìn)行定量分析,以β-actin作為內(nèi)參。

1.7 結(jié)果與分析使用GraphPad Prism 8.0軟件處理和分析試驗(yàn)數(shù)據(jù),并制圖。

2 結(jié)果

2.1 Pun對(duì)LPS誘導(dǎo)的雞腺胃上皮細(xì)胞損傷的影響如圖1A所示,當(dāng)LPS的質(zhì)量濃度為4 mg/L時(shí),雞腺胃上皮細(xì)胞的活力顯著下降(P<0.01)。如圖1B所示,當(dāng)Pun的濃度≤16 μmol/L時(shí),細(xì)胞活力變化不顯著,當(dāng)Pun的濃度為32 μmol/L時(shí),細(xì)胞活力顯著下降(P<0.01)。因此,本研究使用4 mg/L LPS和4,8,16 μmol/L Pun用于后續(xù)試驗(yàn)。如圖1C,D所示,與空白對(duì)照組相比,LPS處理后雞腺胃上皮細(xì)胞的活力顯著下降(P<0.01),LDH釋放顯著增加(P<0.01);而Pun處理后雞腺胃上皮細(xì)胞的活力明顯上升(P<0.01),LDH的釋放減少(P<0.05)。

A.不同濃度的LPS處理后的細(xì)胞活力;B.不同濃度的Pun處理后的細(xì)胞活力;C.LPS和Pun先后處理后的細(xì)胞活力;D.LPS和Pun先后處理后LDH的釋放;*.P<0.05;**.P<0.01;#.P<0.05;##.P<0.01。下同

2.2 Pun對(duì)LPS誘導(dǎo)的雞腺胃上皮細(xì)胞胃黏膜保護(hù)因子的影響如圖2所示,與空白組相比,不同濃度Pun處理的雞腺胃上皮細(xì)胞的PGE2,NO含量,TFF2的mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著下降(P<0.01);而Pun處理組細(xì)胞的PGE2和NO的含量不同程度增加(P<0.05),TFF2的mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著升高(P<0.05)。

A.雞腺胃上皮細(xì)胞的PGE2分泌水平;B.雞腺胃上皮細(xì)胞TFF2基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平;C.雞腺胃上皮細(xì)胞的NO分泌水平

2.3 Pun對(duì)LPS誘導(dǎo)的雞腺胃上皮細(xì)胞緊密連接蛋白的影響如圖3所示,與空白組相比,雞腺胃上皮細(xì)胞中ZO-1,claudin-3,occludin的mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著下調(diào)(P<0.01);而Pun處理后其轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)(P<0.05)。

A.雞腺胃上皮細(xì)胞ZO-1基因表達(dá);B.雞腺胃上皮細(xì)胞claudin-3基因表達(dá);C.雞腺胃上皮細(xì)胞occludin基因表達(dá)

2.4 Pun對(duì)LPS誘導(dǎo)的雞腺胃上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響如圖4所示,與空白組相比,雞腺胃上皮細(xì)胞的ROS水平顯著上升(P<0.01),總SOD,GSH水平顯著下降(P<0.01),而Pun處理后ROS水平下調(diào),總SOD和總GSH水平上升。

A,B.雞腺胃上皮細(xì)胞的ROS水平;C.T-SOD水平;D.T-GSH水平

2.5 Pun對(duì)LPS誘導(dǎo)的雞腺胃上皮細(xì)胞Nrf2信號(hào)通路的影響如圖5所示,與空白組相比,LPS處理后雞腺胃上皮細(xì)胞中Nrf2、NQO1和Keap1的蛋白水平顯著下降(P<0.01);而Pun處理后其蛋白水平顯著上升(P<0.05或P<0.01)。

A.雞腺胃上皮細(xì)胞的Nrf2信號(hào)通路蛋白的Western blot檢測(cè)結(jié)果;B.核Nrf2相對(duì)定量分析;C.總Nrf2相對(duì)定量分析;D.NQO1相對(duì)定量分析;E.Keap1相對(duì)定量分析

采用Nrf2抑制劑ML385進(jìn)一步探究Pun對(duì)LPS誘導(dǎo)的雞腺胃上皮細(xì)胞損傷的保護(hù)機(jī)制。如圖6所示,與空白組相比,LPS處理后雞腺胃上皮細(xì)胞中ROS的生成顯著增加(P<0.01),緊密連接蛋白ZO-1、occludin和claudin-3的mRNA表達(dá)水平顯著下調(diào)(P<0.05或P<0.01),而Pun處理后ROS的生成顯著減少(P<0.01),緊密連接蛋白的mRNA表達(dá)水平顯著上調(diào)(P<0.05或P<0.01)。當(dāng)ML385加入后,ROS的量顯著增加(P<0.01),緊密連接蛋白的mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著下降(P<0.05或P<0.01)。

A,B.雞腺胃上皮細(xì)胞ROS表達(dá)水平;C.雞腺胃上皮細(xì)胞ZO-1的表達(dá)水平;D.雞腺胃上皮細(xì)胞occludin的表達(dá)水平;E.雞腺胃上皮細(xì)胞claudin-3的表達(dá)水平

3 討論

雞腺胃炎是一種常見(jiàn)的傳染性疾病,嚴(yán)重?fù)p害腺胃黏膜,使胃酸和胃蛋白酶的分泌量及活性降低,進(jìn)入腺胃的飼料難以被正常地消化利用,使雞群生長(zhǎng)發(fā)育緩慢、飼料轉(zhuǎn)化不良、消化飼料的能力受損和整齊度下降[1]。胃黏膜屏障功能損傷是雞腺胃炎致病的重要因素,主要與氧化應(yīng)激和胃黏膜完整性相關(guān)。因此探究有效治療藥物的作用機(jī)制具有重要意義。

以往研究表明,LPS能誘導(dǎo)胃黏膜通透性使胃的通透性增加,破壞胃黏膜表面的疏水屏障,損害胃黏膜的完整性,加重胃損傷[8-9],故本研究采用LPS誘導(dǎo)雞腺胃上皮細(xì)胞,從分子水平上模擬雞腺胃炎的發(fā)生。

Pun作為一種天然抗氧化劑,可以降低肝損傷小鼠氧化應(yīng)激水平及改善糖尿病小鼠脂質(zhì)代謝紊亂及氧化應(yīng)激狀態(tài)[10-11]。本研究發(fā)現(xiàn)Pun能通過(guò)促進(jìn)PGE2和NO的釋放以及TFF2的表達(dá)來(lái)保護(hù)和修復(fù)LPS誘導(dǎo)的雞腺胃黏膜損傷,同時(shí)能使ZO-1、occludin和claudin-3的表達(dá)水平顯著增加,說(shuō)明Pun能夠修復(fù)被LPS損傷的腺胃黏膜的完整性。

研究表明,緊密連接蛋白與各種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子相關(guān),并受到包括氧化應(yīng)激在內(nèi)的多種信號(hào)通路的控制[12]。ROS是生物系統(tǒng)氧化代謝的副產(chǎn)物,過(guò)量的ROS生成對(duì)蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸等重要的細(xì)胞生物分子產(chǎn)生有害影響,而抗氧化酶SOD控制ROS的水平,從而限制其潛在的毒性,在維持氧化還原穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮著重要作用[5,13]。GSH也是氧化還原信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵決定因素,對(duì)氧化應(yīng)激具有保護(hù)作用[14]。此外,Nrf2是介導(dǎo)抗氧化劑保護(hù)作用的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子,在穩(wěn)態(tài)條件下,Nrf2受到細(xì)胞質(zhì)中Keap1的負(fù)調(diào)控,Nrf2-Keap1系統(tǒng)協(xié)調(diào)一個(gè)非常強(qiáng)大的抗氧化防御機(jī)制[15-16]。為應(yīng)對(duì)氧化應(yīng)激,Nrf2易位到細(xì)胞核中并與ARE結(jié)合,刺激抗氧化蛋白的轉(zhuǎn)錄,包括GST、NQO1、SOD以及參與清除ROS和GSH生物合成和再生的蛋白等,導(dǎo)致下游抗氧化系統(tǒng)的激活[17]。本研究發(fā)現(xiàn)Pun處理后,LPS損傷的雞腺胃上皮細(xì)胞中ROS的生成受到抑制,總SOD和總GSH的水平顯著上升,Nrf2信號(hào)通路的活性顯著增強(qiáng)。這些結(jié)果提示,Pun能夠減輕LPS誘導(dǎo)的雞腺胃上皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激,并且其抗氧化作用可能與Nrf2信號(hào)通路的活性有關(guān)。隨后,加入ML385[18]特異性抑制Nrf2后,細(xì)胞中ROS水平顯著上升,ZO-1、occludin和claudin-3的mRNA表達(dá)水平顯著下降,說(shuō)明Pun能通過(guò)調(diào)控Nrf2信號(hào)通路的活性發(fā)揮抗氧化作用。

綜上所述,Pun通過(guò)保護(hù)和修復(fù)LPS誘導(dǎo)的雞腺胃黏膜損傷,并調(diào)控Nrf2信號(hào)通路的活性,抑制氧化應(yīng)激來(lái)保護(hù)LPS誘導(dǎo)損傷的雞腺胃上皮細(xì)胞,為Pun預(yù)防和治療雞腺胃炎提供參考,對(duì)家禽養(yǎng)殖的生產(chǎn)實(shí)踐具有一定的指導(dǎo)和借鑒意義。