北京地區(qū)野生鼠類及其攜帶蜱媒病原體調(diào)查

劉立明,湯 芳,劉 斌,付婷婷,4,范君文,白新鴿,趙翠青,白杰英,7*

(1.吉林農(nóng)業(yè)科技學院 動物科技學院,吉林 吉林市 132101;2.武警特色醫(yī)學中心研究部 突發(fā)公共衛(wèi)生事件醫(yī)學防治研究所,北京 102613;3.吉林省金泰美迪生物技術有限公司,吉林 長春 130122;4.中國科學院 理化技術研究所 抗菌材料檢測中心,北京 100190;5.北京市動物疾病預防控制中心,北京 100020;6.青島科技大學 高分子科學與工程學院,山東 青島 266042;7.北京大學 國家生物醫(yī)學成像科學中心,北京 100871)

野生鼠類是生態(tài)系統(tǒng)中重要的一員,也是易于被蜱寄生的動物宿主,其在城市、森林、草原、荒漠等多種生境中均有分布,本身可通過直接或間接途徑傳播鼠疫、腎綜合征出血熱、鉤端螺旋體病等多種自然疫源性疾病[1],亦可攜帶包括巴貝西蟲、螺旋體、斑點熱群立克次體、無形體在內(nèi)的多種蜱媒病原體。有研究報道在黑線姬鼠和東方田鼠中發(fā)現(xiàn)巴貝西蟲[2];靳木子等[3]和烏蘭圖雅等[4]在毛足鼠、長爪沙鼠、黑線倉鼠、長耳跳鼠、五趾跳鼠和達烏爾黃鼠中均發(fā)現(xiàn)伯氏疏螺旋體;ZHAN等[5]和CAO等[6]在黑線姬鼠、日本田鼠、長尾姬鼠等多種鼠類中發(fā)現(xiàn)立克次體和無形體。鼠作為蜱的寄生宿主,之所以能夠成為蜱媒疾病病原體的儲存宿主,主要取決于其生態(tài)與生理學特征[7],如宿主分布特點、種群優(yōu)勢、數(shù)量相對穩(wěn)定以及對病原體的高感受性、低敏感性,帶病毒率相對穩(wěn)定,并能通過多種途徑排出病原體等因素;其次,其種群數(shù)量、帶病毒率的季節(jié)和年度波動與人類疫情流行強度基本吻合[8],大大提高了蜱傳疾病的感染風險。

近年來,一些新發(fā)現(xiàn)的蜱媒疾病,如人巴貝西蟲病、萊姆病、斑點熱、無形體病等在我國及周邊國家和地區(qū)不斷涌現(xiàn),且發(fā)病區(qū)域和發(fā)病率不斷擴大和上升,對人類的健康和國民經(jīng)濟建設造成很大危害,已受到世界各國的普遍關注和重視[9]。北京地區(qū)作為我國首都和重要的旅游城市,地形地貌復雜,生態(tài)環(huán)境類型多樣,動植物區(qū)系豐富,人口流動復雜,為媒介蜱和宿主動物的繁衍生息以及為蜱傳疾病的發(fā)生和持續(xù)存在提供了必要條件。最近,我國學者又在蜱中陸續(xù)發(fā)現(xiàn)多種新發(fā)蜱傳病原體,如新疆地區(qū)的馬賽立克次體(R.massiliae),暫定巴布瑞立克次體(C.R.barbariae)[10];北京地區(qū)的一種新無形體——北京無形體[11]。隨著全球氣候變暖,自然災害的發(fā)生,氣候和生態(tài)環(huán)境的不斷改變,大規(guī)模國防和經(jīng)濟建設,畜牧業(yè)和旅游業(yè)的快速發(fā)展以及貿(mào)易的不斷流通,全球一體化進程的加快導致蜱和宿主動物的種類、密度、分布和生活環(huán)境可能發(fā)生變化[12]。人類進入蜱媒疾病疫源地和接觸野外蜱和宿主動物的機會大大增加,打破了病原體-媒介-宿主的固態(tài)平衡,致使原有地區(qū)的蜱媒疾病的發(fā)生范圍會擴大、發(fā)生頻率和強度會增加,一些新的蜱媒疾病也會不斷出現(xiàn),更加劇了蜱媒傳染病的暴發(fā)和流行,使得蜱媒傳染病不斷發(fā)生,給人類健康和社會經(jīng)濟造成影響,其預防控制變得更加復雜。舊發(fā)蜱傳病原體的暴發(fā)和新發(fā)蜱傳病原體的不斷出現(xiàn),給科研人員和防疫人員帶來了巨大挑戰(zhàn)。

本研究共選取北京市十渡、云蒙山和東靈山3個地區(qū)為采樣點,于2018-2019年間對該地區(qū)采集的鼠類動物樣本進行多種病原體分子生物學檢測,并選取有代表性陽性樣本進行測序和核苷酸序列分析,基于目的基因序列構建系統(tǒng)發(fā)育樹,確定病原體的分類學位置。為進一步研究北京地區(qū)宿主動物和媒介蜱中蜱媒病原體的種類和分布提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 鼠樣本的采集根據(jù)本研究需要,于2018-2019年間在北京市部分景點中采集鼠種開展流行病學調(diào)查,包括北京市門頭溝區(qū)東靈山、密云區(qū)云蒙山、房山區(qū)十渡共3個調(diào)查點采集鼠種。采用夾夜法和誘捕法捕獲鼠,并現(xiàn)場鑒定種類。經(jīng)消毒處理后,解剖取其脾臟,-20℃短期保存?zhèn)溆?長期保存于-80℃。

1.2 主要試劑與儀器AllPrep DNA/RNA Mini Kit DNA/RNA提取試劑盒購自Qiagen公司;DreamTaq Green PCR Master Mix (2×)購自Thermo Fisher Scientific公司;DL2000 DNA Marker和去離子水購自TaKaRa公司;溴化乙錠(EB)和無水乙醇購自國藥集團化學試劑有限公司;本研究所用PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。臺式高速離心機購自Eppendorf公司;VeritiTM96-Well Thermal Cycler購自Applied Biosystems公司;DYY-8C穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀購自北京六一儀器廠;Bio-Rad Gel Doc XR+凝膠成像系統(tǒng)購自Bio-Rad公司;海爾MZC-2070M1微波爐購自海爾公司;HH-S-4恒溫水浴箱購自Amersham公司;Tissuelyser-24L組織研磨儀購自上海凈信科技;A2型生物安全柜購自美國Thermo公司。

1.3 試驗方法

1.3.1樣本處理及核酸提取 無菌條件下剖解小鼠,采取鼠脾臟標本,從鼠脾臟標本中提取脾臟及感染病原體總的基因組,將鼠的脾組織剪碎至20～30 mg的碎塊放入2 mL的EP管中,加入潔凈鋼珠2～3顆、500～800 μL無菌PBS,使用組織研磨儀研磨至勻漿,使用AllPrep DNA/RNA Mini試劑盒提取核酸。

1.3.2蜱媒病原體基因PCR擴增檢測 分別以巴貝西蟲18S rRNA、伯氏疏螺旋體16S rRNA、斑點熱群立克次體ompA、無形體16S rRNA特異性引物(表1),采用巢式PCR方法擴增目的片段,反應體系25 μL:DreamTaq Green PCR Master Mix(2×)12.5 μL,上、下游引物各0.5 μL,Nuclease-free water 9.5 μL,DNA模板2 μL。反應條件見表2,進行2輪PCR反應。PCR反應完成后,取第2輪擴增產(chǎn)物4 μL進行瓊脂糖凝膠電泳,用凝膠成像儀觀察并記錄結果。

表1 蜱媒病原體檢測所用引物序列及相關信息

表2 蜱媒病原體檢測PCR反應條件

1.3.3PCR產(chǎn)物測序及核苷酸序列分析 將PCR擴增的陽性樣本送往生工生物工程(上海)股份有限公司進行純化并完成序列測定。將測出陽性標本的基因序列使用DNAstar軟件拼接后登陸到NCBI,將拼接后的序列與GenBank中注冊的核苷酸序列進行BLAST最大同源性比對分析,確認是否為感染蜱媒病原微生物的目的基因,并用MEGA 7.0軟件做系統(tǒng)發(fā)育樹分析,采用基于maximum composite-likelihood模型的Neighbor-Joining法構建遺傳進化樹。通過1 000次重復算法獲取穩(wěn)定的遺傳進化樹,確定其分類學位置。

1.4 統(tǒng)計學分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析,采用Fisher確切概率法來比較不同地區(qū)和鼠種的蜱媒病原體的感染率。P<0.05,差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 宿主動物與媒介調(diào)查結果分析

表3 北京部分地區(qū)野鼠的種類及分布 只

表4 北京地區(qū)不同種類鼠中感染情況 只

北京地區(qū)的3個調(diào)查點感染情況見表5,發(fā)現(xiàn)東靈山存在巴貝西蟲、伯氏疏螺旋體和無形體感染,感染率分別為10.40%(31/298)、2.01%(6/298)和6.47%(18/298);云蒙山地區(qū)存在巴貝西蟲、伯氏疏螺旋體、斑點熱群立克次體和無形體感染,感染率分別為21.11%(19/90),4.44%(4/90),1.11%(1/90)和10.00%(9/90);十渡存在巴貝西蟲和無形體感染,感染率分別為12.22%(11/90)和5.56%(5/90)。各調(diào)查點間比較,3個調(diào)查點在巴貝西蟲檢測中存在統(tǒng)計學意義(P=0.035)。

表5 北京地區(qū)不同調(diào)查點感染情況 只

表6 不同鼠種復合感染檢測情況 只

2.2 部分病原體核苷酸序列的測定與分析

圖1 巴貝西蟲18S rRNA基因同源性分析

圖2 伯氏疏螺旋體16S rRNA基因同源性分析

圖4 無形體16S rRNA基因同源性分析

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