奶山羊不同組織來源干酪性膿腫中偽結(jié)核棒狀桿菌的分離及毒力基因和耐藥性檢測(cè)

魏宇辰,王 斌,白新棟,王小園,王晨驍,王 娟,楊增岐

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,陜西 楊凌 712100)

偽結(jié)核棒狀桿菌(Corynebacteriumpseudotuberulosis,C.pseudotuberulosis)為革蘭陽(yáng)性球桿菌,是一種兼性細(xì)胞內(nèi)寄生菌[1],能夠?qū)Χ喾N動(dòng)物和人造成感染,引發(fā)干酪性淋巴結(jié)炎[2](caseous lymphadenitis,CLA)。在諸多易感動(dòng)物中,偽結(jié)核棒狀桿菌對(duì)羊的感染和侵害最為普遍,羊感染后又稱羊偽結(jié)核病,發(fā)病羊以體表下頜淋巴結(jié)、肩前淋巴結(jié)和腘淋巴結(jié)等處出現(xiàn)干酪性膿腫最為常見[3],由于該菌的理化性質(zhì)和致病特點(diǎn),在其對(duì)受感染羊只造成持久慢性損傷的同時(shí),能夠?qū)】笛蛉寒a(chǎn)生長(zhǎng)久感染威脅,由此也為該菌的防制和凈化帶來困難,已成為威脅羊群健康和養(yǎng)殖場(chǎng)經(jīng)濟(jì)效益的頑固性病原之一。除體表型偽結(jié)核外,偽結(jié)核棒狀桿菌還能引起內(nèi)臟型和混合型干酪性淋巴結(jié)炎[4-5],但由于內(nèi)臟型偽結(jié)核難于肉眼觀察、羊群通常不開展偽結(jié)核棒狀桿菌的血清學(xué)普查、超聲和X線等診斷方法在羊病診斷中普及度較低等因素影響,內(nèi)臟型偽結(jié)核多在屠宰過程和病死羊解剖時(shí)被發(fā)現(xiàn),造成該病治療延誤且進(jìn)一步增加羊群傳播風(fēng)險(xiǎn)。

此外,關(guān)于偽結(jié)核棒狀桿菌的生物分型,有學(xué)者提出根據(jù)硝酸鹽還原反應(yīng)可將該菌分為2種生物型[6],分別為硝酸鹽還原反應(yīng)陰性的生物I型(C.pseudotuberculosisbiovar ovis,羊種偽結(jié)核棒狀桿菌)和硝酸鹽還原反應(yīng)陽(yáng)性的生物Ⅱ型(C.pseudotuberculosisbiovar equi,馬種偽結(jié)核棒狀桿菌),且當(dāng)前研究表明,羊源偽結(jié)核棒狀桿菌均為羊種偽結(jié)核棒狀桿菌[7]。我國(guó)當(dāng)前對(duì)于羊內(nèi)臟型和乳腺型偽結(jié)核以及病原菌生物型的報(bào)道較為少見。本研究從陜西關(guān)中地區(qū)奶山羊體表淋巴結(jié)、肺臟和乳腺組織成功分離到9株偽結(jié)核棒狀桿菌,并對(duì)分離菌開展病原學(xué)研究和比較,能夠進(jìn)一步豐富羊偽結(jié)核病的研究資料,對(duì)研究羊偽結(jié)核病的防制和評(píng)估該病的公共衛(wèi)生安全危害具有參考意義。

1 材料與方法

1.1 樣品來源不同組織來源的9份干酪性膿腫內(nèi)容物均采自陜西藍(lán)田某養(yǎng)殖場(chǎng)中的9只奶山羊。

1.2 采樣方法下頜淋巴結(jié)膿腫和乳腺膿腫樣品的采集:經(jīng)患處消毒后,均使用20 mL一次性無菌注射器刺入膿腔抽取內(nèi)容物約2 mL,分裝于無菌離心管中2 h 內(nèi)低溫運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室;肺臟膿腫內(nèi)容物樣品來自2只4 h內(nèi)死亡送檢羊,解剖后肺臟表面消毒,使用無菌剪刀鑷子采集干酪性膿腫組織。

1.3 主要試劑5%綿羊血瓊脂培養(yǎng)基為實(shí)驗(yàn)室自制;硝酸鹽還原反應(yīng)試劑盒購(gòu)自青島海博生物(貨號(hào):HB8282);細(xì)菌DNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司;引物合成和基因測(cè)序由西安擎科澤西生物技術(shù)有限公司完成;2×Taq PCR Master Mix和DL2000 DNA Marker購(gòu)自北京迪寧生物科技有限公司;抗生素標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自大連美侖生物技術(shù)有限公司;96孔微量反應(yīng)板購(gòu)自耐思生物科技有限公司;病理組織切片由西安依科生物技術(shù)有限公司制備;50只8周齡SPF小鼠(BALB/c)購(gòu)自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。

1.4 組織涂片于載玻片上滴少許無菌生理鹽水,使用無菌接種環(huán)蘸取少量膿腫內(nèi)容物與生理鹽水涂抹均勻,火焰固定后進(jìn)行革蘭染色,鏡檢。

1.5 細(xì)菌分離培養(yǎng)在超凈工作臺(tái)內(nèi)使用無菌接種環(huán)蘸取少量膿腫內(nèi)容物,3區(qū)劃線接種于5%綿羊血瓊脂培養(yǎng)基,倒置于電熱恒溫培養(yǎng)箱中(36±1)℃培養(yǎng)48 h,之后挑取單菌落接種于血瓊脂培養(yǎng)基,使用相同培養(yǎng)條件進(jìn)行純化培養(yǎng)。

1.6 細(xì)菌16S rRNA基因PCR擴(kuò)增和測(cè)序鑒定經(jīng)純化培養(yǎng)后,挑取單菌落,使用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取DNA,以提取的DNA為模板,使用細(xì)菌16S rRNA基因PCR擴(kuò)增通用引物[8]27 F(5＇-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3＇)和1492 R(5＇-GGTTACCTTGTTACGACTT-3＇),目的片段大小為1 465 bp,反應(yīng)體系為20 μL,反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s,54℃退火30 s,72℃延伸1 min,共35個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min。

1.7 硝酸鹽還原試驗(yàn)將培養(yǎng)物接種于5 mL硝酸鹽肉湯, (36±1)℃培養(yǎng)72 h,加入對(duì)甲基苯磺酸溶液和α-萘酚乙酸溶液各2～3滴,混勻后觀察結(jié)果,出現(xiàn)紅色為陽(yáng)性反應(yīng),不變色為陰性反應(yīng),如出現(xiàn)陰性結(jié)果,可再加入鋅粉少許,若出現(xiàn)紅色,則鑒定為陰性結(jié)果,若不變色則為陽(yáng)性結(jié)果。

1.8 毒力基因PCR檢測(cè)根據(jù)文獻(xiàn)[9]所述的引物和PCR程序,以分離菌的DNA為模板,對(duì)整合膜蛋白(integral membrane protein,FagA)、鐵腸菌素轉(zhuǎn)運(yùn)子(iron enterobactin transporter,FagB)、ATP結(jié)合胞質(zhì)膜蛋白(ATP binding cytoplasmic membrane protein,FagC)和含鐵細(xì)胞-鐵結(jié)合蛋白(iron sidero-phore binding protein,FagD)進(jìn)行基因檢測(cè)[10],擴(kuò)增產(chǎn)物條帶大小分別為245,291,173,226 bp。磷脂酶D(phospholipase D,PLD)基因的PCR擴(kuò)增,使用Primer Premier 5設(shè)計(jì)引物,上游引物為PLD-F:5′-ATAAGCGTAAGCAGGGAG-3′,下游引物為PLD-R:5′-GGTAGCCAGATGGTGAGTAG-3′,按常規(guī)PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增,反應(yīng)體系為20 μL,退火溫度為55℃,擴(kuò)增產(chǎn)物條帶大小為611 bp。

1.9 動(dòng)物致病性試驗(yàn)將分離的菌株使用含5%血清的BHI肉湯培養(yǎng)基擴(kuò)增培養(yǎng)后,每一分離株使用無菌PBS溶液將菌液濃度調(diào)整至約106CFU/mL。將50只小鼠隨機(jī)分為10組(n=5),9組試驗(yàn)組小鼠分別腹腔注射0.1 mL 9株分離菌菌液,對(duì)照組小鼠腹腔注射0.1 mL無菌PBS溶液,于注射后第7天處死并解剖小鼠,觀察病理變化并制備病理切片。

1.10 藥物敏感性試驗(yàn)選取青霉素(PEN)、萬古霉素(VAN)、頭孢噻肟(CTX)、慶大霉素(GEN)、環(huán)丙沙星(CIP)、紅霉素(ERY)、四環(huán)素(TET)和復(fù)方新諾明(SXT)共8種藥物,使用微量肉湯稀釋法進(jìn)行最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration,MIC)檢測(cè),培養(yǎng)基為含5%小牛血清的CAMHB肉湯,菌液濃度為0.48～0.56麥?zhǔn)现?根據(jù)美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(clinical and laboratory standards institute,CLSI)文件中規(guī)定的偽結(jié)核棒狀桿菌折點(diǎn)范圍判定結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 組織涂片和菌落形態(tài)臨床發(fā)病羊膿腫組織(圖1)內(nèi)容物經(jīng)制片和革蘭染色鏡檢后,可見單個(gè)散在或聚集存在的革蘭陽(yáng)性球桿狀菌體,無莢膜和芽胞(圖2A);膿腫組織內(nèi)容物培養(yǎng)48 h后于血瓊脂平板上可見乳白色、邊緣較整齊、干燥易于刮落的菌落(圖2B),挑取單菌落進(jìn)行革蘭染色和鏡檢,顯微鏡下可見與膿腫組織涂片中形態(tài)一致的菌體。

A.下頜淋巴結(jié)膿腫;B.肺臟膿腫;C.乳腺膿腫

A.組織抹片鏡檢(1 000×,Gram);B.血平板培養(yǎng)單菌落

2.2 細(xì)菌16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增和測(cè)序鑒定PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后,可見約1 465 bp的條帶(圖3),與預(yù)期大小一致,經(jīng)16S rRNA基因測(cè)序和序列比對(duì)表明,分離的細(xì)菌均為偽結(jié)核棒狀桿菌。將下頜淋巴結(jié)樣品源菌株編號(hào)為X1～X5,肺臟樣品源菌株編號(hào)為F1、F2,乳腺樣品源菌株編號(hào)為R1、R2。

M.DL2000 DNA Marker;(-).陰性對(duì)照

2.3 硝酸鹽還原試驗(yàn)所獲得的9株羊不同組織來源的偽結(jié)核棒狀桿菌硝酸鹽還原反應(yīng)均為陰性,表明分離的9株偽結(jié)核棒狀桿菌均為羊種偽結(jié)核棒狀桿菌(生物Ⅰ型)。

2.4 毒力基因PCR檢測(cè)對(duì)分離菌的毒力基因PCR檢測(cè)結(jié)果表明,分離的9株不同組織源偽結(jié)核棒狀桿菌均攜帶PLD、FagA、FagB、FagC、FagD基因(圖3)。

2.5 動(dòng)物致病性試驗(yàn)試驗(yàn)組小鼠解剖后可見注射部位出現(xiàn)干酪樣化膿灶。病理組織切片顯微鏡下可見腸系膜淋巴結(jié)出現(xiàn)急性淋巴結(jié)炎、淋巴細(xì)胞壞死和巨噬細(xì)胞浸潤(rùn);肝臟可見肝索結(jié)構(gòu)不清,肝竇內(nèi)可見少量淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞;脾臟可見壞死性脾炎,白髓區(qū)局部壞死,易見巨核細(xì)胞(圖4),對(duì)照組小鼠未見異常。

A.注射部位膿腫; B.腸系膜淋巴結(jié)(100×,HE); C.肝臟(100×,HE); D.脾臟(100×,HE)

2.6 抗生素敏感試驗(yàn)經(jīng)過對(duì)9株分離菌進(jìn)行MIC檢測(cè)和結(jié)果判定,結(jié)果表明,分離菌對(duì)萬古霉素、慶大霉素、環(huán)丙沙星、四環(huán)素和復(fù)方新諾明敏感率為100%,對(duì)青霉素只表現(xiàn)為耐藥或中度敏感,對(duì)紅霉素存在一定程度耐藥,對(duì)頭孢噻肟敏感或中度敏感,試驗(yàn)結(jié)果見表1,圖5。

表1 分離菌MIC檢測(cè)結(jié)果

圖5 分離菌對(duì)不同藥物的耐藥性

3 討論

羊源偽結(jié)核棒狀桿菌的研究報(bào)道正在引起諸多專家學(xué)者的關(guān)注,本研究對(duì)同一養(yǎng)殖場(chǎng)來源的羊下頜淋巴結(jié)、肺臟和乳腺干酪性膿腫組織中病原菌進(jìn)行分離鑒定,最終從9份樣品中均分離到偽結(jié)核棒狀桿菌,且對(duì)試驗(yàn)小鼠均有致病性,能夠引起小鼠局部化膿性病變和淋巴結(jié)等組織炎性反應(yīng)。在細(xì)菌分離鑒定過程中發(fā)現(xiàn),膿腫組織來源的偽結(jié)核棒狀桿菌在初次分離培養(yǎng)時(shí)生長(zhǎng)緩慢,在血瓊脂培養(yǎng)基中至少培養(yǎng)48 h才能出現(xiàn)較為明顯的特征性菌落,因此,在初次分離培養(yǎng)時(shí),應(yīng)提供充足的培養(yǎng)時(shí)間。生物型鑒定結(jié)果顯示,本次所獲得的9株細(xì)菌均為羊種偽結(jié)核棒狀桿菌,該結(jié)果與國(guó)外學(xué)者研究結(jié)果一致[6-7],進(jìn)一步證實(shí)根據(jù)硝酸鹽還原反應(yīng)進(jìn)行該菌生物分型的可行性。主要毒力基因鑒定表明,本研究中不同組織來源的偽結(jié)核棒狀桿菌菌株攜帶的主要毒力基因類型一致,均攜帶PLD、FagA、FagB、FagC、FagD基因,本研究中未發(fā)現(xiàn)不同組織來源與毒力基因類型之間存在差異,AQUINO等[9]雖發(fā)現(xiàn)不同組織來源的偽結(jié)核棒狀桿菌毒力基因類型存在差異,但在其研究的168株偽結(jié)核棒狀桿菌中,同時(shí)攜帶該5種毒力基因的菌株占比高達(dá)95.23%(160/168),由此可以表明PLD/FagA/FagB/FagC/FagD為偽結(jié)核棒狀桿菌的主要毒力基因型,能夠?yàn)樵摼奶禺愋曰蛟\斷方法開發(fā)提供一定參考。耐藥性研究結(jié)果表明,分離菌對(duì)青霉素和紅霉素耐藥率較高,對(duì)頭孢噻肟有耐藥趨勢(shì),臨床用藥應(yīng)予以關(guān)注,其中,分離菌對(duì)青霉素耐藥程度由高到低依次為下頜源、乳腺源和肺臟源菌株,可能與體表和乳腺膿腫易于發(fā)現(xiàn)并及時(shí)進(jìn)行青霉素局部治療有關(guān);肺臟源菌株對(duì)紅霉素均耐藥,可能與大環(huán)內(nèi)酯類藥物在有呼吸道癥狀病羊的治療中普遍應(yīng)用有關(guān)。但本研究中肺臟源和乳腺源菌株數(shù)量較少,關(guān)于該菌的耐藥性現(xiàn)狀研究仍需進(jìn)一步擴(kuò)大菌株數(shù)量。

當(dāng)前,關(guān)于羊偽結(jié)核病的報(bào)道大多以羊淺表淋巴結(jié)干酪性膿腫為主[11-12],本研究中除病羊下頜淋巴結(jié)外,從肺臟化膿灶和乳腺炎性膿腫中亦分離到偽結(jié)核棒狀桿菌,表明偽結(jié)核棒狀桿菌能夠?qū)ρ蚨喾N組織器官造成局部化膿性感染,由此說明,針對(duì)偽結(jié)核棒狀桿菌對(duì)羊群的危害,除關(guān)注體表型感染外,還應(yīng)對(duì)羊內(nèi)臟型偽結(jié)核病予以群體篩查,此外,由于偽結(jié)核棒狀桿菌為人畜共患病原菌[13],乳腺炎性膿腫組織中偽結(jié)核棒狀桿菌的存在,應(yīng)引起養(yǎng)殖場(chǎng)和畜牧獸醫(yī)工作者的重視。同時(shí)提示該菌不僅會(huì)對(duì)羊奶產(chǎn)業(yè)造成相關(guān)經(jīng)濟(jì)損失,同時(shí)可能會(huì)對(duì)食品安全和公共衛(wèi)生健康造成一定威脅。