豬多殺性巴氏桿菌的分離鑒定、血清分型及耐藥性分析

張哲瑋,曹維維,代小童,甘 晶,饒 靜,袁 龍,貝為成

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北 武漢 430070;2.湖北洪山實(shí)驗(yàn)室,湖北 武漢 430070;3.廣西揚(yáng)翔農(nóng)牧有限責(zé)任公司,廣西 貴港 537100;4.生豬健康養(yǎng)殖協(xié)同創(chuàng)新中心,湖北 武漢 430070)

多殺性巴氏桿菌(Pasteurellamultocida,Pm)屬于巴氏桿菌科,巴氏桿菌屬,是動(dòng)物呼吸道重要病原菌,可造成豬、牛、羊、兔、禽、野生動(dòng)物和寵物等多種宿主感染,具有極強(qiáng)的致病性[1]。豬Pm能引發(fā)豬肺疫和豬萎縮性鼻炎[2],造成嚴(yán)重的呼吸道癥狀并誘發(fā)其他病原混合或繼發(fā)感染,增加死亡率,降低飼料轉(zhuǎn)化率,對(duì)我國養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[3]。根據(jù)Pm莢膜抗原的差異,可將其分為A、B、D、E、F 5種血清型,其中A型和D型主要引起豬肺疫,此外D型還可以引起豬傳染性萎縮性鼻炎,而B型則能引起出血性敗血癥。近10年,我國Pm的優(yōu)勢(shì)血清型主要為A型和D型,但研究顯示A型的檢出率已逐年高于D型[4-6]。目前Pm的商品化疫苗無法提供有效保護(hù),豬場(chǎng)更多依賴抗生素進(jìn)行防治,然而濫用抗生素造成的多重耐藥現(xiàn)象給該病的防控帶來了極大挑戰(zhàn)。

本研究通過收集不用地區(qū)規(guī)?；B(yǎng)豬場(chǎng)中具有呼吸道癥狀豬的口鼻拭子及組織病料,通過細(xì)菌分離鑒定、生化試驗(yàn)及血清分型,明確豬多殺性巴氏桿菌病在該地區(qū)的流行現(xiàn)狀,進(jìn)而對(duì)分離菌株的耐藥性和致病性進(jìn)行探究,旨在為豬場(chǎng)的精準(zhǔn)用藥、減緩Pm耐藥性及疫苗的研發(fā)提供科學(xué)依據(jù)和防控方案。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1病料及試驗(yàn)動(dòng)物 病料主要來源于廣西、湖北、內(nèi)蒙古3個(gè)省規(guī)?；B(yǎng)豬場(chǎng)中有呼吸道癥狀豬的口鼻拭子及組織病料。SPF級(jí),6～8周齡,體質(zhì)量20 g左右的雌性昆明小鼠購買及飼養(yǎng)于華中農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.2培養(yǎng)基及主要試劑 胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB)、胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基(TSA)購自BD Difco公司;DL2000 DNA Marker、2×Taq Master Mix購自南京諾唯贊生物科技有限公司;新生牛血清購自AusgeneX公司;革蘭染色試劑盒購自北京索萊寶生物科技有限公司;細(xì)菌藥敏紙片和細(xì)菌微量生化反應(yīng)管均購自青島海博試劑有限公司;細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司。

1.1.3主要儀器設(shè)備 酶標(biāo)儀Victor NIVO 3S(南京萊醫(yī)特電子科技有限公司);DNA純度和質(zhì)量檢測(cè)分光光度計(jì)(Beckman公司);紫外分光光度計(jì)(美國Thermo公司);多功能顯微鏡(日本OLYMPUS公司);圖像采集系統(tǒng)(日本OLYMPUS公司);恒溫培養(yǎng)箱(上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司)。

1.2 方法

1.2.1病豬口鼻拭子及組織病料的收集與處理 對(duì)收集到的有呼吸道癥狀豬只的口鼻拭子和組織病料樣品進(jìn)行記錄,記錄后對(duì)樣品進(jìn)行處理?？诒鞘米拥奶幚?將拭子放入裝有適量生理鹽水的EP管中充分混勻。病料的處理:首先用酒精棉輕輕擦拭病變較為明顯的病料表面,并用點(diǎn)燃的酒精棉來回經(jīng)過至表面干燥,用消毒后器械將病料剪成“口”字型,用未接觸環(huán)境的內(nèi)側(cè)面輕輕涂布平板。

1.2.2病原菌分離培養(yǎng)及革蘭染色 將處理后的口鼻拭子及無菌剪取的肺臟等病變組織,劃線接種于含10%新生牛血清的TSA平板上,置于37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～24 h,挑取疑似菌落并進(jìn)行傳代培養(yǎng),取純培養(yǎng)物進(jìn)行革蘭染色、鏡檢。

1.2.3生化試驗(yàn) 參考常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)[7],無菌挑取純培養(yǎng)物于葡萄糖、乳糖、蔗糖、果糖、海藻糖、山梨醇等12種生化反應(yīng)管中,37℃培養(yǎng)24～48 h,觀察并記錄結(jié)果。

1.2.4細(xì)菌基因組DNA的提取 細(xì)菌基因組DNA的制備根據(jù)天根生物公司的細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說明書步驟進(jìn)行操作。

1.2.516S rDNA的PCR鑒定及測(cè)序比對(duì) 以步驟1.2.4制備的細(xì)菌基因組DNA作為模板進(jìn)行細(xì)菌16S rDNA的PCR檢測(cè),用通用引物擴(kuò)增16S rDNA全長(zhǎng)序列,上游引物序列:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′;下游引物序列:5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′,預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度1 500 bp 左右。PCR擴(kuò)增體系:PrimerSTAR Max Premix(2×) 10 μL,H2O 7 μL,上、下游引物各1 μL,模板1 μL,總計(jì)20 μL。擴(kuò)增程序:95℃預(yù)變性5 min; 95℃變性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸1.5 min,共30個(gè)循環(huán);72℃最后延伸10 min。用含有EB染料的1.1%瓊脂糖凝膠電泳分析PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,將鑒定正確的PCR產(chǎn)物送往武漢擎科生物公司進(jìn)行測(cè)序,并將測(cè)序結(jié)果與GenBank中已有序列進(jìn)行BLAST比對(duì)。

1.2.6莢膜血清型分型 莢膜血清型分型鑒定所用引物參考文獻(xiàn)[8],引物序列見表1。PCR反應(yīng)體系:PrimerSTAR Max Premix(2×)10 μL,H2O 7 μL,上、下游引物各1 μL,模板1 μL,總計(jì)20 μL。反應(yīng)程序:95℃預(yù)變性5 min;95℃變性1 min,58℃退火30 s,72℃延伸1 min,共30個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min。用含有EB染料的1.1%瓊脂糖凝膠電泳分析PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

表1 莢膜血清型分型鑒定引物及相關(guān)信息

1.2.7生長(zhǎng)曲線的測(cè)定 將本次分離菌株與實(shí)驗(yàn)室前期分離并保存的PmA、PmD菌株于含10%新生牛血清的TSA平板上劃線復(fù)蘇,37℃過夜培養(yǎng),挑取單菌落傳代一次,再挑取單菌落到含10%新生牛血清的TSB中,恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)12 h作為種子液。將上述種子液按1∶100轉(zhuǎn)接種于含10%新生牛血清的TSB中,37℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)12 h,期間每隔1 h取樣測(cè)D600 nm值,根據(jù)測(cè)定結(jié)果繪制生長(zhǎng)曲線。

1.2.8藥敏試驗(yàn) 采用Kirby-Bauer法對(duì)20種藥品進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。將分離菌株于含10%新生牛血清的TSA平板上劃線復(fù)蘇,37℃過夜培養(yǎng),挑取單個(gè)菌落接種于含10%新生牛血清的TSB中,于37℃振蕩(180 r/min)培養(yǎng)12 h,用生理鹽水調(diào)整菌液濃度至0.5麥?zhǔn)蠁挝?1.5×108CFU/mL)。用滅菌棉簽蘸取適量菌液均勻涂布于含10%新生牛血清的TSA平板上,待培養(yǎng)基表面充分吸收菌液后放置藥敏紙片,并使其緊貼培養(yǎng)基表面,于37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～24 h,測(cè)量抑菌圈直徑,記錄測(cè)量結(jié)果,并根據(jù)杭州微生物試劑有限公司藥敏結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)菌株對(duì)藥物的敏感性。

1.2.9小鼠致病性試驗(yàn) 將分離菌株與實(shí)驗(yàn)室前期分離并保存的PmA、PmD菌株分別接種于含10%新生牛血清的TSB中,于37℃振蕩培養(yǎng)12 h并進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)。將小鼠分為9組(其中感染組8組、對(duì)照組1組),每組5只小鼠。用生理鹽水將菌液稀釋至攻毒濃度(PmA型菌株攻毒濃度為40 CFU/只,PmD型菌株攻毒濃度為2×105CFU/只),感染組小鼠腹腔注射0.2 mL稀釋菌液,對(duì)照組小鼠腹腔注射0.2 mL無菌生理鹽水,同時(shí)對(duì)實(shí)際攻毒菌液進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)。各組小鼠攻毒后隔離飼養(yǎng),觀察并記錄臨床癥狀、死亡情況等,同時(shí)剖檢死亡小鼠并做細(xì)菌分離鑒定。

2 結(jié)果

2.1 病原菌分離培養(yǎng)及染色鏡檢將病料在TSA平板上接種培養(yǎng),挑取單菌落純化后,從廣西及內(nèi)蒙古病豬肺臟中分離到6株疑似Pm菌株。分離菌株在TSA平板上生長(zhǎng)良好,37℃過夜培養(yǎng)后,可見培養(yǎng)基上長(zhǎng)出圓潤(rùn)、灰白色、透明或半透明的菌落,且PmA型菌株比PmD型菌株菌落表面更為黏膩,革蘭染色鏡檢均可見短桿狀或球桿狀的革蘭陰性菌(圖1)。

A,C.Pm血清A型菌株的菌落形態(tài);B,D.Pm血清D型菌株的菌落形態(tài)

2.2 生化特性鑒定將分離的臨床菌株進(jìn)行生化試驗(yàn),結(jié)果顯示6株分離菌株的生化結(jié)果一致,能發(fā)酵多種單糖、雙糖及醇類,但不發(fā)酵乳糖,海藻糖,枸櫞酸鹽、尿素酶、甲基紅,V-P試驗(yàn)結(jié)果為陰性,吲哚試驗(yàn)結(jié)果為陽性,將鑒定結(jié)果與《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》比對(duì)分析,符合Pm的生化特性(表2)。

表2 分離菌株的生化鑒定結(jié)果

2.3 16S rRNA基因序列分析及比對(duì)用通用引物對(duì)6株臨床分離菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增,結(jié)果顯示,在1 500 bp處有特異性條帶,與預(yù)期相符(圖2)。將擴(kuò)增產(chǎn)物送至武漢擎科生物公司進(jìn)行測(cè)序,并將測(cè)序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行比對(duì)分析,結(jié)果顯示6株分離菌株與Pm的相似性均在97%以上。

M1.DL2000 DNA Marker;1～6.分離菌株;7.陰性對(duì)照

2.4 血清型分型鑒定用5對(duì)分型引物對(duì)6株臨床分離菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增,結(jié)果顯示,6株P(guān)m中有1株為莢膜血清A型(條帶大小為1 044 bp),其他5株為莢膜血清D型(條帶大小為657 bp)(圖3)。

2.5 生長(zhǎng)曲線測(cè)定結(jié)果將臨床分離菌株與實(shí)驗(yàn)室前期分離并保存的PmA、PmD型菌株分別進(jìn)行生長(zhǎng)曲線測(cè)定,結(jié)果顯示,Pm血清A型、Pm血清D型菌株均在7 h左右時(shí)達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,10 h左右達(dá)到平臺(tái)期,雖然不同菌株間生長(zhǎng)曲線的走勢(shì)不完全相同,但均顯示出基本一致的生長(zhǎng)狀態(tài)(圖4,5)。

圖4 Pm血清A型菌株生長(zhǎng)曲線

圖5 Pm血清D型菌株生長(zhǎng)曲線

2.6 耐藥性分析藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示,6株臨床分離菌株對(duì)米諾環(huán)素、多西環(huán)素、四環(huán)素、卡那霉素、頭孢哌酮、頭孢曲松、頭孢他啶、頭孢呋辛、頭孢拉定、頭孢唑啉、頭孢氨芐、哌拉西林、羧芐西林、氨芐西林、苯唑西林、青霉素等藥物均表現(xiàn)為敏感,且對(duì)β內(nèi)酰胺類藥物表現(xiàn)出高度敏感;其中GX-PmA對(duì)新霉素、丁胺卡那中度敏感。NMG-PmD5對(duì)紅霉素中度敏感,對(duì)新霉素和慶大霉素耐藥。

2.7 致病性試驗(yàn)致病性試驗(yàn)結(jié)果顯示,在感染后5 h,部分小鼠開始出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)減少、食欲減退的現(xiàn)象;在感染后10 h,可見小鼠精神萎靡、雙眼蒙蔽、背毛雜亂,對(duì)外界刺激反應(yīng)遲緩。GX-PmD4組小鼠攻毒后死亡時(shí)間最短,于10 h出現(xiàn)死亡,PmA組、GX-PmA組小鼠攻毒后20 h出現(xiàn)死亡,其余小鼠死亡時(shí)間多發(fā)生于20～24 h,而PmD組、GX-PmD2組小鼠未出現(xiàn)死亡,對(duì)照組小鼠均未出現(xiàn)死亡(表3)。結(jié)果證實(shí)Pm血清A型菌株小鼠致病性強(qiáng)于Pm血清D型菌株,且PmA及GX-PmD4菌株對(duì)小鼠的致病性強(qiáng)于其他分離菌株。

表3 分離菌株對(duì)昆明小鼠的致病性結(jié)果(n=5) 只

剖檢小鼠可見,對(duì)照組未見明顯病變,感染組小鼠臟器可見其不同程度的出血,其中肺臟出血較為明顯,脾臟充血腫大,部分小鼠肝臟出現(xiàn)淤血或局部有壞死點(diǎn)(圖6)。收集死亡小鼠肺臟進(jìn)行細(xì)菌分菌鑒定,結(jié)果顯示平板上菌株的菌落形態(tài)與Pm一致,經(jīng)PCR鑒定證實(shí)小鼠肺臟分離菌為Pm(圖7)。

A,B,C.分別為對(duì)照組小鼠肺臟、肝臟、脾臟;D,E,F.分別為攻毒組小鼠肺臟、肝臟、脾臟

M1.DL2000 DNA Marker;1～16.分離菌株;17.陰性對(duì)照

3 討論

豬Pm是危害我國生豬業(yè)健康發(fā)展的重要呼吸道病原菌,臨床上常與多種細(xì)菌、病毒及支原體混合感染,在冬春季節(jié)環(huán)境多變、豬群抵抗力低下時(shí),常造成內(nèi)源性感染,影響豬群正常生長(zhǎng)發(fā)育、降低飼料轉(zhuǎn)化率、增加養(yǎng)殖費(fèi)用,還可引發(fā)急性死亡,造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[9]。本研究通過大量收集臨床病料并通過細(xì)菌分離培養(yǎng)、染色鏡檢以及生化鑒定、PCR檢測(cè)等方法成功分離出6株豬Pm,其中莢膜血清A型1株,D型5株,這與我國目前流行的優(yōu)勢(shì)血清型一致[10]。近年來,常有在豬群中分離到莢膜血清F型Pm的報(bào)道,且被證實(shí)有較強(qiáng)的致病力,因此Pm F型菌株也可能成為未來我國豬群中流行的重要血清型之一,這可能是未來豬Pm流行病學(xué)調(diào)查的重點(diǎn)[11-13]。

隨著集約化養(yǎng)殖模式的發(fā)展,豬呼吸道疾病的發(fā)病率激增,抗生素濫用現(xiàn)象導(dǎo)致細(xì)菌的多重耐藥現(xiàn)象屢見不鮮。我國學(xué)者對(duì)2017年我國臨床分離菌株的耐藥情況分析顯示,Pm對(duì)青霉素、磺胺類、氨基糖苷類藥物的耐藥率相對(duì)較高。本研究顯示廣西臨床分離菌株未見耐藥現(xiàn)象,這可能與分離菌株來自于不同的區(qū)域及養(yǎng)殖場(chǎng)日常用藥情況相關(guān),但內(nèi)蒙古分離株表現(xiàn)出明顯的新霉素、慶大霉素耐藥現(xiàn)象,這與近年來的文獻(xiàn)報(bào)道較為一致[14]。有研究證實(shí),針對(duì)目前流行的Pm,β-內(nèi)酰胺類藥物(青霉素、氨芐西林和頭孢噻呋)、大環(huán)內(nèi)酯類藥物(替米考星)和氟喹諾酮類藥物(恩諾沙星)比推薦使用的土霉素和氟苯尼考更為有效[15]。因此,預(yù)防為主、防治結(jié)合的科學(xué)思維必不可少,在日常養(yǎng)殖中,應(yīng)結(jié)合養(yǎng)殖場(chǎng)實(shí)際情況制定科學(xué)合理的防控措施,做好飼養(yǎng)管理工作,密切關(guān)注豬群生長(zhǎng)狀況,定期對(duì)豬舍及相關(guān)用具進(jìn)行消毒,同時(shí)做好圈舍通風(fēng)工作,及時(shí)掌握豬群耐藥情況并結(jié)合臨床報(bào)道的有效抗菌劑進(jìn)行治療具有重要意義[16-17]。因此,一旦豬只發(fā)病,應(yīng)結(jié)合醫(yī)囑實(shí)施藥物治療,并持續(xù)監(jiān)測(cè)呼吸道病原體的耐藥性,以減少該病帶來的經(jīng)濟(jì)損失。

本研究通過對(duì)分離菌株及實(shí)驗(yàn)室保存的菌株進(jìn)行毒力分析比較,證實(shí)Pm血清A型菌株對(duì)小鼠的致病力強(qiáng)于D型菌株,這與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致[18],同時(shí)從分離菌株中篩選出了致病力較強(qiáng)的分離菌株P(guān)mA和GX-PmD4,為實(shí)驗(yàn)室后期滅活苗的制備及新型疫苗的研究奠定了基礎(chǔ)。隨著基因組學(xué)的不斷發(fā)展,Pm強(qiáng)弱毒株之間的差異逐漸被挖掘出來。研究證實(shí),盡管強(qiáng)弱菌株間的基因組高度相似,但其在臨床癥狀、病理變化、組織細(xì)菌載量、共有毒力基因的體內(nèi)轉(zhuǎn)錄水平等方面仍存在較大差異[19-22]。因此,強(qiáng)毒株的篩選對(duì)后期的致病性機(jī)制研究、篩選差異毒力基因、疫苗的研發(fā)等工作奠定了基礎(chǔ)。