顆粒蛋白前體PGRN通過增強ORFV誘導(dǎo)的自噬促進病毒的復(fù)制

甄瑞雪,呂麗君,陸慧君,劉興源,徐夢實,關(guān)繼羽,賀文琦,高 豐,趙 魁

(吉林大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)學(xué)院 人獸共患病研究教育部重點實驗室,吉林 長春 130062)

羊傳染性膿皰病又稱羊口瘡(orf),是由羊傳染性膿皰病毒(orf virus,ORFV)感染引起綿羊、山羊以及多種野生動物的一種高度接觸性傳染病,人也可通過接觸發(fā)生感染[1]。ORFV是痘病毒科副痘病毒屬代表種,具有高度的嗜上皮性,主要引起感染動物口唇部、鼻周、乳房、外陰部以及蹄部皮膚的增生性病變,感染羊尤其是羔羊常因饑餓和繼發(fā)感染導(dǎo)致生長遲緩甚至死亡[2-3]。在人類,ORFV感染部位皮膚也出現(xiàn)水皰、膿皰等病變,后期形成潰瘍甚至結(jié)痂脫落,多表現(xiàn)為局部自限性病變[4]。目前,ORFV感染廣泛發(fā)生于世界各地羊群中,感染動物常出現(xiàn)生長及繁殖性能的下降,給養(yǎng)羊業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟損失[5-6]。

細胞自噬是真核生物的一種高度保守的由溶酶體介導(dǎo)的降解和循環(huán)過程。細胞可利用自噬清除和降解其自身破損、老化以及功能異常的細胞器和蛋白質(zhì),以維持細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)。此外,自噬也可清除入侵的病原體,是機體抵抗感染的重要機制之一[7-8]。在發(fā)生自噬時,細胞內(nèi)形成一種稱為吞噬泡的小囊泡樣結(jié)構(gòu),包裹待降解產(chǎn)物形成具有雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬體,最終自噬體與溶酶體融合形成自噬溶酶體,進而將底物降解[9-10]。盡管自噬被證實是一種有效應(yīng)對病毒感染的防御機制,但多種病毒也進化出阻止或利用自噬的策略,以利于其自身的復(fù)制增殖[11]。

顆粒蛋白前體(progranulin,PGRN)是廣泛分布于各組織、器官和細胞中的一種分泌型多功能蛋白,參與了炎癥反應(yīng)、創(chuàng)傷修復(fù)、神經(jīng)發(fā)育、自噬等多種生命活動過程[12-13]。目前,越來越多的證據(jù)表明,PGRN是溶酶體功能的關(guān)鍵調(diào)控因子,它能夠被轉(zhuǎn)運至溶酶體并分解產(chǎn)生促進溶酶體功能的顆粒蛋白亞基,進而參與調(diào)節(jié)自噬[14]。課題組前期研究結(jié)果顯示,ORFV感染能夠誘導(dǎo)細胞自噬,并且隨著自噬水平的增加,病毒復(fù)制也隨之增強,然而PGRN是否參與對ORFV誘導(dǎo)自噬的調(diào)控及機制尚不清楚。鑒于此,本研究首先從轉(zhuǎn)錄和蛋白水平上分析了PGRN在ORFV感染細胞中的表達變化規(guī)律,并深入探討了PGRN對ORFV感染誘導(dǎo)自噬水平及病毒復(fù)制增殖的影響。本研究結(jié)果不僅有利于明確PGRN對ORFV誘導(dǎo)自噬水平的調(diào)控作用,而且將為進一步揭示ORFV致病機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病毒和細胞ORFV/JL/08/CC毒株由本實驗室分離鑒定及保存[15];OFTu細胞由本實驗室分離培養(yǎng)及保存。

1.2 主要試劑高糖DMEM(美倫生物);高糖DMEM(2×)(吉諾生物);胰蛋白酶(新賽美生物科技有限公司);胎牛血清(BI公司);5×上樣緩沖液、RIPA蛋白裂解液(中)、Lipo8000TM轉(zhuǎn)染試劑、BCA試劑盒(碧云天生物);快速封閉液(雅酶生物);GAPDH抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記山羊抗兔、抗鼠和辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記驢抗羊IgG(Proteintech公司);PGRN抗體(R&D公司);Progranulin/PGRN 蛋白(MCE);LC3B抗體(Sigma公司);PCR引物由吉林省庫美生物有限公司合成。

1.3 細胞培養(yǎng)與病毒感染將狀態(tài)良好且處于對數(shù)生長期的OFTu細胞進行傳代,以80%～90%細胞密度接種于6 cm一次性細胞培養(yǎng)皿中,培養(yǎng)18～24 h后,接種ORFV(MOI=10),分別收集感染后0,12,24,36,48,60 h的樣品進行實時熒光定量PCR(qRT-PCR)和Western blot分析。

1.4 細胞轉(zhuǎn)染將OFTu細胞以70%～80%的密度接種于6孔細胞培養(yǎng)板中,培養(yǎng)18～24 h后進行轉(zhuǎn)染,在進行轉(zhuǎn)染前更換培養(yǎng)基,將每個孔都換成2 mL的新鮮培養(yǎng)液(1%青鏈霉素,10%FBS),然后再進行后續(xù)的細胞轉(zhuǎn)染操作:取1個潔凈無菌的1.5 mL離心管,分別依次加入125 μL 高糖DMEM、100 pmol/L siRNA、4 μL Lipo8000TM轉(zhuǎn)染試劑,并依次用槍輕輕吹打混勻,室溫孵育20 min后滴加至6孔板內(nèi),放入細胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,將ORFV以MOI=10接種細胞,收集感染后48 h的樣品進行qRT-PCR、Western blot和病毒毒力測定。同時設(shè)立PGRN處理組,將OFTu細胞以70%～80%的密度接種于6孔細胞培養(yǎng)板中,培養(yǎng)18～24 h后以MOI=10接種ORFV,孵育1 h后將培養(yǎng)液更換為2 mL含1 000 μg/L PGRN重組蛋白、2% FBS的培養(yǎng)液,感染后48 h收集樣品進行qRT-PCR、Western blot和病毒毒力測定。

1.5 熒光定量PCR分析將細胞按照1.3和1.4方式進行處理后,提取細胞總RNA,將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA后,應(yīng)用特異性引物檢測PGRN mRNA的相對表達。反應(yīng)參數(shù):95℃ 2 min,94℃ 15 s,55℃ 15 s,68℃ 30 s,95℃ 15 s,60℃ 1 min,45個循環(huán)。以GAPDH作為內(nèi)參,計算相對表達量,引物序列見表1。

表1 引物信息

1.6 Western blot檢測將細胞按1.3和1.4處理后,使用RIPA裂解液(PMSF濃度為1 mmol/L)將收集于1.5 mL離心管底部的細胞沉淀吹起并吹打混勻,冰上孵育30 min后,4℃ 12 000 r/min離心10 min,測定蛋白質(zhì)量濃度。取蛋白樣品,進行12% SDS-PAGE,電泳后通過半干法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,應(yīng)用快速封閉液室溫封閉15 min后,用TBST沖洗1次,分別用PGRN、GAPDH、LC3B抗體4℃孵育過夜后,TBST清洗 3次,每次10 min,用辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔、抗鼠和抗羊IgG于37℃孵育1 h,用TBST清洗3次,每次10 min,用ECL法顯色后利用ImageJ軟件對蛋白條帶進行定量分析。

1.7 病毒噬斑試驗將OFTu細胞以80%～90%的密度接種于12孔板,培養(yǎng)18～24 h后,分別將相應(yīng)的病毒液稀釋到原來濃度的10-3,對應(yīng)每孔接種600 μL稀釋的病毒液,37℃、5% CO2孵育1 h后棄掉病毒液,加入2%低熔點瓊脂糖培養(yǎng)基,培養(yǎng)5 d后,棄掉上層瓊脂糖培養(yǎng)基,用4%多聚甲醛室溫固定15 min后,用2%結(jié)晶紫進行細胞染色,用清水沖洗3次后拍照分析。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析使用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析,P>0.05表示差異不顯著,*P<0.05表示差異顯著,**P<0.01表示差異非常顯著,***P<0.001表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 ORFV感染誘導(dǎo)PGRN表達上調(diào)收集ORFV感染后不同時間(0,12,24,36,48,60 h)的OFTu細胞樣品,分別提取感染細胞總蛋白及總RNA進行Western blot和qRT-PCR分析。利用Western blot對感染細胞中PGRN、ORFV及自噬相關(guān)蛋白P62、LC3蛋白表達的檢測結(jié)果顯示,ORFV誘導(dǎo)OFTu細胞自噬的發(fā)生時間為36 h,此時LC3開始發(fā)生型別轉(zhuǎn)換,P62下調(diào);PGRN的表達量也在36 h開始顯著上調(diào)(圖1)。利用提取的感染后不同時間的OFTu細胞總RNA進行qRT-PCR測定,并利用Excel和SPSS軟件進行統(tǒng)計分析,結(jié)果如圖2所示,PGRN mRNA的表達呈時間依賴性增加。上述結(jié)果提示,PGRN表達的上調(diào)可能與自噬的發(fā)生相關(guān)。

圖1 Western blot檢測PGRN、ORFV及自噬相關(guān)蛋白P62、LC3蛋白的相對表達水平

圖2 qRT-PCR檢測PGRN mRNA表達情況

2.2 PGRN正向調(diào)節(jié)ORFV誘導(dǎo)的OFTu細胞自噬為明確PGRN與ORFV誘導(dǎo)OFTu細胞自噬之間的關(guān)系,將特異性靶向PGRN的siRNA#640、#1509、#1632轉(zhuǎn)染細胞,48 h后收取細胞樣品,分別提取細胞總蛋白和總RNA,利用Western blot和qRT-PCR檢測PGRN蛋白及mRNA表達情況。結(jié)果如圖3A所示,將PGRN靶向siRNA#640和siRNA#1632轉(zhuǎn)染細胞后,PGRN的蛋白質(zhì)水平和mRNA表達顯著降低。選取#1632轉(zhuǎn)染OFTu細胞,轉(zhuǎn)染后24 h以MOI=10接種ORFV,接種后48 h 提取細胞總蛋白通過Western blot檢測PGRN、P62以及LC3蛋白表達情況,結(jié)果如圖3B所示,干擾PGRN后,P62的表達上調(diào),抑制 LC3Ⅰ向LC3Ⅱ的型別轉(zhuǎn)化。而在ORFV感染細胞中添加PGRN重組蛋白培養(yǎng)48 h后,提取細胞總蛋白,通過Western blot檢測PGRN、P62以及LC3蛋白表達情況,結(jié)果如圖3C所示,體外添加PGRN重組蛋白后,P62的表達下調(diào)并且促進LC3Ⅰ向LC3Ⅱ的轉(zhuǎn)換。

A. 將siRNAs轉(zhuǎn)染OFTu細胞后,PGRN的蛋白和mRNA表達檢測;B. 干擾PGRN后,OFTu細胞感染ORFV后48 h LC3和P62蛋白表達檢測;C. 添加PGRN重組蛋白后,OFTu細胞感染ORFV后48 h LC3和P62蛋白表達分析

2.3 PGRN通過調(diào)控自噬影響ORFV復(fù)制為了探究PGRN對ORFV復(fù)制的影響,用siRNA#1632轉(zhuǎn)染OFTu細胞后,將ORFV以MOI=10分別接種siRNA#1632轉(zhuǎn)染后24 h的OFTu細胞以及添加重組PGRN蛋白的OFTu細胞,分別收集感染后48 h的病毒液進行病毒噬斑試驗,結(jié)果顯示,干擾PGRN抑制了ORFV的復(fù)制(圖4A),而體外添加PGRN能顯著促進ORFV的復(fù)制(圖4B)。為進一步明確PGRN是否通過對ORFV誘導(dǎo)的自噬水平進行調(diào)節(jié)而影響ORFV的復(fù)制,將ORFV以MOI=10接種至自噬抑制劑BafA1(20 nmol/L)預(yù)處理的細胞及正常OFTu細胞,孵育1 h后分別加入含有相同濃度的自噬抑制劑BafA1、BafA1+PGRN重組蛋白,收集培養(yǎng)48 h后的病毒液進行噬斑試驗,結(jié)果如圖4C所示,經(jīng)自噬抑制劑BafA1處理的細胞中ORFV的毒力被顯著抑制,而添加PGRN重組蛋白的細胞中ORFV的毒力相對于單獨添加自噬抑制劑BafA1有所回升。上述結(jié)果表明,PGRN通過調(diào)節(jié)ORFV誘導(dǎo)OFTu細胞自噬水平影響ORFV的復(fù)制。

A.轉(zhuǎn)染siRNA#1632后,病毒復(fù)制能力變化檢測;B.體外添加PGRN后, 病毒復(fù)制能力變化檢測;C.BafA1+PGRN重組蛋白共處理后,病毒復(fù)制能力變化檢測

3 討論

羊口瘡(orf)又稱羊傳染性膿皰病、傳染性膿皰性皮炎,是主要發(fā)生于綿羊和山羊的一種高度接觸性傳染病,表現(xiàn)為皮膚/黏膜的增生性病變[16]。該病的病原ORFV具有高度的嗜上皮性,主要感染受損或疤痕皮膚,并在表皮角質(zhì)細胞中復(fù)制。該病的病變通常表現(xiàn)為紅斑、丘疹、水皰、膿皰和結(jié)痂,主要發(fā)生于羔羊的口唇及鼻周部位,但乳房、陰部、蹄部也可發(fā)生感染[17-18]。由于單純ORFV感染多為自限性疾病,人們認(rèn)為ORFV僅導(dǎo)致感染動物局部較為輕微的皮膚病變,從而忽視了ORFV感染對羊群乃至人的潛在危害。然而,ORFV傳染性強,且對外界環(huán)境抵抗力強,能夠在感染痂皮中存在數(shù)月甚至數(shù)年,可持續(xù)多年危害羊群,嚴(yán)重危害感染動物產(chǎn)毛、產(chǎn)肉、繁殖等生長與生產(chǎn)性能,給養(yǎng)羊業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟損失。此外,作為一種人獸共患病病原,ORFV潛在的公共衛(wèi)生安全問題目前也已引起人們的重視。

自噬是一種在所有真核生物中高度保守的細胞降解和循環(huán)過程,通過胞質(zhì)細胞器、蛋白質(zhì)和大分子的降解以及分解產(chǎn)物的再循環(huán),在細胞的生存和維持中發(fā)揮著重要作用[19]。在哺乳動物細胞中,自噬主要包括以下3種類型:微自噬、大自噬和伴侶蛋白介導(dǎo)的自噬(CMA)[20]。雖然每一種自噬都在形態(tài)上不同,但這3種類型都最終將底物運送到溶酶體進行降解,進而維持細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)[21]。雖然自噬能夠清除大多數(shù)的外來細菌和病毒,但許多病毒已經(jīng)進化出一系列的策略來逃逸這種細胞防御機制,甚至可利用自噬來促進自身的復(fù)制。目前的研究表明,病毒可通過3種方式適應(yīng)或調(diào)節(jié)自噬:一些病毒能夠抑制自噬的發(fā)生,例如人單純皰疹病毒Ⅰ型(HSV-1)能夠編碼產(chǎn)生神經(jīng)毒力蛋白ICP34.5,通過與自噬相關(guān)蛋白Beclin-1結(jié)合抑制自噬發(fā)生,進而減弱細胞防御對其自身復(fù)制的限制[22]。此外,一些病毒能夠誘發(fā)細胞產(chǎn)生不完全自噬,即在感染初期能夠促進細胞自噬,但后期可抑制自噬溶酶體形成,阻斷自噬內(nèi)容物降解,例如人病毒性肝炎病毒(HCV)[23]和人狂犬病病毒(RV)[24]。然而,還有一些病毒能夠利用細胞自噬促進病毒自身的復(fù)制。本課題組前期研究證實,ORFV能夠誘導(dǎo)OFTu細胞發(fā)生完全自噬,并可利用自噬促進其自身的復(fù)制[25-31]。

PGRN作為分布廣泛的一種分泌型多功能蛋白,已被證實是參與自噬調(diào)節(jié)的重要分子。然而PGRN是否參與對ORFV誘導(dǎo)的自噬的調(diào)控及機制尚不清楚。鑒于此,本研究首先從轉(zhuǎn)錄和蛋白水平上分析了PGRN在ORFV感染細胞中的表達變化規(guī)律,結(jié)果顯示,ORFV感染后36 h PGRN發(fā)生顯著上調(diào)表達,該時間與ORFV激活OFTu細胞發(fā)生自噬的時間相一致,該結(jié)果提示,PGRN與ORFV誘導(dǎo)的OFTu細胞自噬存在關(guān)聯(lián)。為進一步確認(rèn),本研究分別利用siRNA靶向干擾PGRN或者體外添加PGRN重組蛋白的方法對PGRN進行抑制表達或過表達,檢測PGRN對自噬相關(guān)分子的影響,結(jié)果顯示,抑制PGRN能夠抑制LC3的型別轉(zhuǎn)換,并使P62上調(diào)表達;體外添加PGRN重組蛋白則促進LC3Ⅰ向LC3Ⅱ的轉(zhuǎn)換,P62表達下調(diào)。以上結(jié)果表明,PGRN參與對ORFV誘導(dǎo)的細胞自噬的調(diào)控。本研究進一步探討了PGRN是否通過對ORFV誘導(dǎo)自噬水平的調(diào)控而影響病毒的復(fù)制,病毒噬斑試驗結(jié)果顯示,PGRN能夠促進ORFV復(fù)制,且可逆轉(zhuǎn)自噬抑制劑對病毒復(fù)制的抑制作用,該結(jié)果表明,PGRN能夠通過調(diào)節(jié)ORFV激活的自噬影響病毒的復(fù)制。本研究結(jié)果不僅有利于明確PGRN對ORFV誘導(dǎo)自噬的調(diào)控作用,而且將為進一步揭示ORFV的致病機制奠定基礎(chǔ)。