檢測(cè)牛副流感病毒3型恒溫隔絕式熒光RT-PCR方法的建立及應(yīng)用

任云鑫,湯 承,2,岳 華,2*

(1.西南民族大學(xué) 畜牧獸醫(yī)學(xué)院,四川 成都 610041;2.青藏高原動(dòng)物遺傳資源保護(hù)與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 四川 成都 610041)

牛副流感病毒3型(bovine parainfluenza virus type 3,BPIV3)為副黏病毒科(Paramyxoviridae)副黏病毒亞科(Paramyxovirinae)呼吸道病毒屬(Respirovirus)的成員,是引起牛呼吸道綜合征(bovine respiratory disease syndrome,BRDC)的重要病原之一[1]。BPIV3于1959年首次被分離到[2],根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育分析可以將其分為BPIV3 A、B和C 3種基因型,多個(gè)國(guó)家都報(bào)道了存在不同基因型的BPIV3[3-6]。我國(guó)2008年首次報(bào)道BPIV3,已發(fā)現(xiàn)BPIV3 A、B和C基因型[4,7-8]。國(guó)內(nèi)血清流行病學(xué)調(diào)查和分子流行病學(xué)調(diào)查資料顯示BPIV3在我國(guó)廣泛分布,并且在東北、西北和養(yǎng)牛業(yè)發(fā)達(dá)的中部地區(qū)具有較高的檢出率[8-12]。目前,國(guó)內(nèi)關(guān)于BPIV3分子流行病學(xué)資料仍然缺乏,阻礙了BPIV3的進(jìn)一步防控。

BPIV3感染后會(huì)引起牛的呼吸道損傷和免疫功能抑制[13],而表現(xiàn)出對(duì)BRDC的其他相關(guān)病原體易感性增強(qiáng),導(dǎo)致病牛更嚴(yán)重的危害,致使牛群死亡率增加[14]。由于引發(fā)BRDC的病原較多且癥狀相似,因此,準(zhǔn)確、快速、有效的檢測(cè)手段在BRDC的防控中顯的格外重要。PCR方法被認(rèn)為是傳染病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)[15],國(guó)內(nèi)外已有根據(jù)BPIV3保守的N、M、HN、P基因設(shè)計(jì)的PCR檢測(cè)方法[16-22],但仍未見(jiàn)能夠基于現(xiàn)場(chǎng)快速診斷BPIV3的PCR方法,因此及時(shí)建立一種快速、靈敏、可靠地同時(shí)檢測(cè)BPIV3 A、B和C 3種基因型的熒光PCR方法,對(duì)BPIV3的診斷防控具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

恒溫隔絕式RT-PCR(insulated isothermal RT-PCR,iiRT-PCR)是一種基于貝納爾對(duì)流原理的等溫RT-PCR技術(shù)[23],配套使用PetNAD核酸提取試劑盒和POCKITTM系列核酸分析儀,無(wú)需設(shè)置反應(yīng)程序,一鍵啟動(dòng)后60 min內(nèi)即可報(bào)告結(jié)果,具備操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)速度快的優(yōu)勢(shì),已廣泛用于多種動(dòng)物疫病的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)[24-27]。本研究根據(jù)GenBank中完整的102條P基因序列成功建立了BPIV3的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)方法并進(jìn)行了方法之間的比較和初步應(yīng)用,豐富了國(guó)內(nèi)關(guān)于BPIV3分子流行病學(xué)資料;為BRDC的診斷和分子流行病學(xué)調(diào)查提供了有力的工具。

1 材料與方法

1.1 病毒(菌)株與臨床樣品BPIV3 C基因型陽(yáng)性核酸由本實(shí)驗(yàn)室保存;用于通用性檢驗(yàn)的BPIV3 A基因型(GenBank登錄號(hào):JQ063064)和BPIV3 B基因型(GenBank登錄號(hào):EU277658)毒株的目的序列片段由北京擎科生物科技有限公司成都分公司合成;用于特異性檢驗(yàn)的病毒株、菌株的核酸陽(yáng)性樣本:牛冠狀病毒(bovine coronavirus,BCoV)、牛呼吸道合胞體病毒(bovine orthopneumovirus,BRSV)、牛病毒性腹瀉病毒(bovine viral diarrhoea virus,BVDV)、牛傳染性鼻氣管炎病毒(infectious bovine rhinotracheitis,IBRV)、牛腺病毒3型(bovine adenovirus type 3,BAV3)、牛鼻病毒(bovine rhinitis virus,BRV)、多殺性巴氏桿菌(Pasteurellamultocida,P.multocida)、溶血性曼氏桿菌(Mannheimiahaemolytica,M.haemolytica)和牛支原體(Mycoplasmabovis,M.Bovis)的陽(yáng)性核酸均由西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。

P.BPIV3陽(yáng)性對(duì)照;N.BPIV3 陰性對(duì)照;1～9.BCoV、BRSV、BVDV、IBRV、BAV3、BRV、多殺性巴氏桿菌、溶血性曼氏稈菌、牛支原體

P.陽(yáng)性對(duì)照;N.陰性對(duì)照;-7～-12.4.23×103～4.23×10-2 copies/μL

141份BRDC肉牛鼻腔深部棉拭子樣本于2020-2021年采自我國(guó)內(nèi)蒙古、河南、寧夏、山西、四川和福建6個(gè)省份, 50份BRDC牦牛肺臟樣本于2020-2021年采自四川省阿壩州紅原縣和若爾蓋縣的5個(gè)牧場(chǎng)。141份肉牛鼻腔深部棉拭子樣本每份按照1∶5比例直接加入PBS溶液后進(jìn)行充分涮洗,而50份牦牛肺臟樣本則采用液氮冷凍研磨處理后,每份按照1∶5比例加入PBS溶液,所有樣本經(jīng)渦旋混勻,10 000 r/min離心5 min后取上清由本實(shí)驗(yàn)室保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑和儀器Prime scriptTM反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Premix Ex Taq(Probe qPCR)等購(gòu)于TaKaRa 公司;pClone007載體、TrellefTM5α感受態(tài)細(xì)胞等購(gòu)于擎科生物科技有限公司;Gel Extraction Kit和質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA BIO-TEK公司;高速冷凍離心機(jī)(5804)購(gòu)自德國(guó)Eppendor公司;PetNAD核酸萃取試劑盒和POCKITTM系列核酸分析儀購(gòu)于金瑞鴻捷生物科技有限公司。

1.3 引物、探針的設(shè)計(jì)與合成下載GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已登錄的102條BPIV3 P基因序列,對(duì)比分析后選取高度保守的區(qū)域,使用Primer 5.0引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)了1對(duì)檢測(cè)BPIV3的特異性引物和1條特異性探針,擴(kuò)增的目的片段位于基因組的2 830～2 954 bp處,長(zhǎng)度為125 bp,引物序列:F:5′-ARAGGACACAGAAGAGAGCACT-3′,R:5′-TR-GCCACACATACAACTCTCT-3′;探針序列:FA-M-TTACAGAAAGGGCGATTACATTATTAC-AGA-BHQ1。引物和探針均由北京擎科生物科技有限公司成都分公司合成。

1.4 核酸的提取和反轉(zhuǎn)錄使用PetNAD核酸萃取試劑盒進(jìn)行提取后,根據(jù)Prime scriptTM反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書對(duì)RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,cDNA保存于-20℃?zhèn)溆?而iiRT-PCR RNA的反轉(zhuǎn)錄和PCR檢測(cè)反應(yīng)在同一個(gè)PCR毛細(xì)反應(yīng)管中完成。

1.5 BPIV3 C基因型毒株陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品的制備以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA作為陽(yáng)性模板,用1.3中設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增,得到的PCR產(chǎn)物使用電泳鑒定后,將其純化回收并用pClone007 載體、TrellefTM5α感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行克隆轉(zhuǎn)化構(gòu)建重組質(zhì)粒作為 BPIV3 C基因型陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品,并使用核酸蛋白分析儀測(cè)定其濃度,按照下述公式計(jì)算核酸濃度:質(zhì)?？截悢?shù)(copies/μL)=(6.02×1023copies/mol)×(質(zhì)粒濃度 g/mL)×10-3/(質(zhì)粒分子量 g/mol)。

1.6 iiRT-PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化利用控制變量法,50 μL iiRT-PCR反應(yīng)體系中Premix Ex Taq預(yù)混酶為25 μL,反應(yīng)體系主要是優(yōu)化探針濃度10 μmol/L(0.05～0.35 μL)、引物濃度10 μmol/L(1～4 μL)、模板量(0.5～3.5 μL)和反轉(zhuǎn)錄酶20 U/μL(0.5～2 μL),以iiRT-PCR反應(yīng)前后熒光比值最高為確定各自最優(yōu)濃度及用量的判定標(biāo)準(zhǔn)。

1.7 特異性試驗(yàn)采用反應(yīng)體系優(yōu)化后的BPIV3 iiRT-PCR方法對(duì)1.1中的病毒和菌株進(jìn)行檢測(cè),以評(píng)價(jià)該iiRT-PCR方法的特異性。

1.8 靈敏性試驗(yàn)制備的BPIV3陽(yáng)性質(zhì)粒10倍遞增稀釋(1×100,1×10-1～ 1×10-12)后,使用優(yōu)化后的iiRT-PCR方法進(jìn)行檢測(cè),確定該方法檢測(cè)下限。

1.9 重復(fù)性試驗(yàn)取3個(gè)稀釋濃度(1×10-4～1×10-6)的BPIV3重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品,用優(yōu)化后的iiRT-PCR方法對(duì)每種濃度分別進(jìn)行3次重復(fù)檢測(cè),進(jìn)行批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn);對(duì)3個(gè)不同稀釋梯度的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行3次獨(dú)立的重復(fù)檢測(cè),進(jìn)行批間重復(fù)性試驗(yàn),通過(guò)計(jì)算批內(nèi)和批間變異系數(shù)評(píng)估該方法的重復(fù)性。

1.10 通用性試驗(yàn)用建立的iiRT-PCR方法對(duì)1.4合成的BPIV3 A基因型和B基因型陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測(cè)并設(shè)立1.5制備的BPIV3 C基因型標(biāo)準(zhǔn)品為模板的陽(yáng)性對(duì)照,另設(shè)置以ddH2O作為模板的陰性對(duì)照,用于評(píng)價(jià)該方法的通用性。

1.11 臨床樣本的檢測(cè)采用本試驗(yàn)建立的iiRT-PCR方法和已報(bào)道的2種TaqMan-MGB熒光定量RT-PCR方法[16,28],分別對(duì)191份臨床樣本進(jìn)行檢測(cè)并比較檢出率,以評(píng)價(jià)該方法的符合性,檢測(cè)方法信息見(jiàn)表1。如果3種方法所檢出的陽(yáng)性樣本編號(hào)不同,將其PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙向測(cè)序后來(lái)驗(yàn)證結(jié)果的準(zhǔn)確性。

表1 3種檢測(cè)方法信息

1.12 iiRT-PCR預(yù)混試劑的制備與現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用為了滿足現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè),對(duì)1.6中描述的反應(yīng)體系進(jìn)行預(yù)混。將檢測(cè)4份樣本需要的檢測(cè)試劑按比例分裝預(yù)混為一管進(jìn)行冷凍真空凍干,然后避光保存于-80℃,使用時(shí)只需加入緩沖液和模板即可開(kāi)始檢測(cè)。取經(jīng)1.11鑒定的2份陽(yáng)性后和2份陰性BPIV3牛深部鼻腔棉拭子樣品驗(yàn)證iiRT-PCR預(yù)混試劑的現(xiàn)場(chǎng)使用效果。將4份處理好的樣品使用商品化核酸提取試劑盒提取樣品總核酸后與溶解好的預(yù)混液一同加入到毛細(xì)PCR反應(yīng)管中采用POCKITTM可充電式核酸分析儀(現(xiàn)場(chǎng)使用)進(jìn)行檢測(cè),檢驗(yàn)預(yù)混試劑現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用的效果。同時(shí)采用TRIzol法提取的這4份肉牛深部鼻腔棉拭子樣品的總RNA,將其與優(yōu)化好的反應(yīng)體系混勻后采用POCKITTM智能型核酸分析儀(實(shí)驗(yàn)室使用)檢測(cè),對(duì)比上述2種檢測(cè)方式的檢出率。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的鑒定重組質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證為BPIV3,成功構(gòu)建的BPIV3的陽(yáng)性質(zhì)粒濃度為96 mg/L,換算拷貝數(shù)為4.23×1010copies/μL,保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

2.2 優(yōu)化后的反應(yīng)體系經(jīng)過(guò)篩選優(yōu)化的iiRT-PCR反應(yīng)體系: Taq酶(預(yù)混酶)25 μL,10 μmol/L的上、下游引物各3 μL,10 μmol/L的探針0.25 μL,20 U/μL的反轉(zhuǎn)錄酶2 μL,模板1 μL,使用DEPC H2O補(bǔ)足至50 μL。

2.3 特異性試驗(yàn)結(jié)果通過(guò)使用本研究建立的iiRT-PCR方法對(duì)BPIV3的陽(yáng)性cDNA和其他呼吸道病原核酸進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示:該方法只能特異性的檢出BPIV3,而不能檢出其他的牛呼吸道疾病相關(guān)病原(圖1),將檢測(cè)到的陽(yáng)性產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序,測(cè)序結(jié)果均為BPIV3,表明該方法的特異性較強(qiáng)。

2.4 靈敏性試驗(yàn)結(jié)果本研究制備的BPIV3陽(yáng)性質(zhì)?？截悢?shù)為4.23×1010copies/μL,10倍遞增稀釋樣品,進(jìn)行敏感性檢測(cè),結(jié)果顯示建立的iiRT-PCR對(duì)BPIV3的檢測(cè)范圍是4.23×1010～4.23×100copies/μL,核酸最低檢測(cè)下限為4.23×100copies/μL(圖2)。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果用建立的BPIV3 iiRT-PCR方法對(duì)3個(gè)稀釋度(4.23×104～4.23×106copies/μL)陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品分別進(jìn)行3次重復(fù)檢測(cè),批間變異系數(shù)(Cv)為2.16%～2.58%,批內(nèi)變異系數(shù)(Cv)為1.37%～1.73%,表明本試驗(yàn)建立的BPIV3 iiRT-PCR方法重復(fù)性較好(表2)。

表2 iiRT-PCR方法的重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

2.6 iiRT-PCR的通用性評(píng)價(jià)用建立的BPIV3 iiRT-PCR方法對(duì)A基因型、B基因型和C基因型陽(yáng)性質(zhì)粒進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示本研究建立的BPIV3 iiRT-PCR方法對(duì)3種基因型都可檢出(圖3),表明建立的BPIV3 iiRT-PCR方法通用性較好。

A.BPIV3 A基因型陽(yáng)性質(zhì)粒;B.BPIV3 B基因型陽(yáng)性質(zhì)粒;C.BPIV3 C基因型陽(yáng)性質(zhì)粒;N.陰性對(duì)照

2.7 臨床樣本的檢測(cè)結(jié)果利用本研究建立的iiRT-PCR方法以及文獻(xiàn)報(bào)道的另外2種BPIV3的檢測(cè)方法對(duì)國(guó)內(nèi)6個(gè)省份共191份呼吸道樣本中的BPIV3進(jìn)行檢測(cè),iiRT-PCR方法檢測(cè)結(jié)果顯示,141份肉牛鼻拭子樣本中檢出55份BPIV3陽(yáng)性, 50份牦牛肺臟樣本中檢出22份BPIV3陽(yáng)性,iiRT-PCR方法對(duì)BPIV3的檢出結(jié)果可以覆蓋另外2種方法的檢測(cè)結(jié)果,符合率為88.48%～94.76%(表3),說(shuō)明建立的iiRT-PCR方法可以實(shí)現(xiàn)對(duì)臨床樣本的檢測(cè)。通過(guò)本研究建立的方法對(duì)6個(gè)省份樣本中BPIV3檢測(cè)結(jié)果顯示,內(nèi)蒙古、河南、寧夏、山西、四川和福建6個(gè)省份的肉牛鼻腔棉拭子樣本檢測(cè)到BPIV3陽(yáng)性,陽(yáng)性率為20.00%～80.00%,場(chǎng)陽(yáng)性率為50.00%～100.00%;在牦牛肺臟樣本中BPIV3的陽(yáng)性率為44.00%(22/50),場(chǎng)陽(yáng)性率為100.00%(5/5),表明BPIV3在我國(guó)上述的6個(gè)省份的肉牛和四川阿壩州地區(qū)的牦牛中均有存在(表4)。

表3 臨床樣品的檢測(cè)結(jié)果 %

表4 BPIV3在6個(gè)省份的流行情況

2.8 iiRT-PCR方法的現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用驗(yàn)證用預(yù)混試劑檢測(cè)BPIV3,結(jié)果顯示4份樣本中具有2份陽(yáng)性和2份陰性,該檢測(cè)結(jié)果和TRIzol法提取核酸所進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方式結(jié)果一致,表明本研究建立的iiRT-PCR方法能夠滿足現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的條件。

3 討論

BPIV3是牛呼吸道疾病的重要病原,感染BPIV3后造成牛的呼吸道損傷和免疫抑制[13],常繼發(fā)引起其他病原的感染,造成患畜臨床癥狀的相似,臨床診斷較難,所以往往需要使用實(shí)驗(yàn)室診斷的方法進(jìn)行確診[29]。目前,國(guó)內(nèi)外已有多種BPIV3的PCR檢測(cè)方法[16,19,22,30],但仍未見(jiàn)能夠現(xiàn)場(chǎng)診斷BPIV3的PCR方法。眾所周知,病原的快速檢測(cè)和檢測(cè)方法的靈敏性對(duì)疾病的診斷具有重要影響,本研究通過(guò)對(duì)GenBank中102條P基因的對(duì)比后,選擇高度保守區(qū)域設(shè)計(jì)了特異性引物和探針,并通過(guò)對(duì)反應(yīng)體系的優(yōu)化,成功建立了特異性強(qiáng)、靈敏性高和重復(fù)性好的BPIV3 iiRT-PCR檢測(cè)方法,將優(yōu)化好的反應(yīng)體系預(yù)混凍干后,搭配現(xiàn)場(chǎng)核酸提取試劑盒POCKITTM系列核酸分析儀,從核酸提取到報(bào)告PCR結(jié)果僅需1 h,實(shí)現(xiàn)了BPIV3的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè),為BPIV3的快速診斷提供了有利工具。

本研究分別采用建立的iiRT-PCR和另外2種TaqMan-MGB 熒光定量 RT-PCR方法對(duì)內(nèi)蒙古、河南、寧夏、山西、四川和福建6個(gè)省191份BRDC樣本進(jìn)行BPIV3的檢測(cè)后發(fā)現(xiàn),所建立的iiRT-PCR方法對(duì)BPIV3的檢出率均高于其余2種檢測(cè)方法,分析發(fā)現(xiàn),其中1個(gè)TaqMan-MGB 熒光定量 RT-PCR方法選取M基因作為檢測(cè)靶點(diǎn)進(jìn)行引物和探針的設(shè)計(jì),通過(guò)對(duì)比GenBank中已登錄的34條M基因發(fā)現(xiàn),該方法的引物和探針只能完全匹配34條M基因序列中的9條,與中國(guó)已上傳至GenBank中的5條M基因全部不能完全匹配,這可能是導(dǎo)致該方法在本研究中檢測(cè)率低于其余2種方法的重要原因。同樣選取了P基因保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物作為檢測(cè)靶點(diǎn)的TaqMan-MGB 熒光定量 RT-PCR方法,檢出率低于本研究建立的iiRT-PCR方法,可能是因?yàn)楸狙芯克梅椒ㄓ懈偷暮怂釞z測(cè)下限(4.23 copies/μL),而報(bào)道的TaqMan-MGB熒光定量RT-PCR方法檢測(cè)下限為100 copies/μL。

近年來(lái),隨著我國(guó)養(yǎng)牛業(yè)的快速發(fā)展,肉牛貿(mào)易運(yùn)輸愈發(fā)頻繁[31],BRDC已經(jīng)成為了阻礙養(yǎng)牛業(yè)健康發(fā)展的主要疾病之一[4]。BPIV3是導(dǎo)致BRDC的重要病原,但國(guó)內(nèi)關(guān)于BPIV3的分子流行病學(xué)調(diào)查資料仍尚不完整[10]。本研究通過(guò)建立的iiRT-PCR方法對(duì)6個(gè)省141份肉牛鼻腔棉拭子樣本進(jìn)行檢測(cè)后發(fā)現(xiàn),內(nèi)蒙古、河南、寧夏、山西、四川和福建6個(gè)地區(qū)的樣本均有BPIV3的檢出,BPIV3平均陽(yáng)性率為39.01%(55/141),平均場(chǎng)陽(yáng)性率為76.92%(10/13),表明BPIV3已經(jīng)在上述省份的養(yǎng)牛業(yè)中普遍存在,該結(jié)果豐富了國(guó)內(nèi)BPIV3的分子流行病學(xué)調(diào)查資料。牦牛是我國(guó)青藏高原特有的經(jīng)濟(jì)物種和當(dāng)?shù)厝嗣癫豢苫蛉钡纳钗镔Y,而呼吸道疾病常發(fā)生于牦牛群體中[32]。本研究對(duì)四川省紅原縣和若爾蓋縣采集的5個(gè)牧場(chǎng)的50份牦牛肺臟樣本進(jìn)行BPIV3檢測(cè)后發(fā)現(xiàn),BPIV3平均陽(yáng)性率為44.00%(22/50),場(chǎng)陽(yáng)性率為100.00%(5/5),該結(jié)果表明BPIV3已經(jīng)廣泛流行于四川地區(qū)的牦牛群體中。因此,進(jìn)一步加強(qiáng)牦牛群體內(nèi)BPIV3的監(jiān)測(cè),對(duì)青藏高原地區(qū)牦牛BRDC的防控具有重要意義。

綜上所述,本研究建立的BPIV3的iiRT-PCR方法具有特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好和靈敏性高特點(diǎn),可用于BPIV3的快速檢測(cè),為BPIV3的流行病學(xué)調(diào)查和現(xiàn)場(chǎng)診斷提供了新的方法。本研究結(jié)果豐富了國(guó)內(nèi)BPIV3的分子流行病學(xué)資料,為牛呼吸道疾病的防控提供了參考。