• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    Shh-BMSCs 外泌體調(diào)控miR-133a對脂多糖誘導(dǎo)脊髓神經(jīng)元細胞凋亡的影響*

    2023-07-07 09:09:36賈祎佳陸廷盛陳啟鸰楊建文歐陽北平楊再松羅春山
    西部醫(yī)學(xué) 2023年6期
    關(guān)鍵詞:貨號外泌體脊髓

    賈祎佳 陸廷盛 陳啟鸰 楊建文 歐陽北平 楊再松 羅春山

    (貴州省骨科醫(yī)院脊柱科,貴州 貴陽 550014)

    脊髓損傷(Spinal cord injury,SCI)是脊柱外科最常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病,致殘率高、破壞性強、恢復(fù)性差,極大損害患者自主生活能力,給其心理及家庭造成沉重負擔(dān)[1-2]。神經(jīng)元死亡及形態(tài)結(jié)構(gòu)受損是引發(fā)SCI患者感覺、運動及自主神經(jīng)功能障礙等的關(guān)鍵因素,缺血缺氧誘發(fā)的神經(jīng)炎癥是導(dǎo)致脊髓神經(jīng)元形態(tài)損傷及死亡的主要病理機制,減輕神經(jīng)元炎性損傷是SCI后神經(jīng)功能修復(fù)的有效策略[3-4]。音猬因子(Sonic Hedgehog,Shh)是調(diào)控哺乳動物胚胎發(fā)育和器官形成的重要因子,在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后具有神經(jīng)保護作用,SCI后鞘內(nèi)注射Shh可通過減輕神經(jīng)炎癥而促使神經(jīng)功能恢復(fù)[5],骨髓間充質(zhì)干細胞(Bone marrow stromal cells,BMSCs)具有潛在的神經(jīng)保護特性,但直接進行移植存在難以存活、去分化、免疫排斥等風(fēng)險,而其分泌的外泌體作為一種包含多種微小RNA、蛋白質(zhì)、核酸等內(nèi)容物的囊泡狀小體,在細胞分化、存活、凋亡等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用,BMSCs外泌體及過表達Shh的BMSCs外泌體均可減少神經(jīng)元凋亡,對SCI具有保護作用,且后者作用更強[6]。miR-133a是組織細胞重要的炎性調(diào)節(jié)因子,其家族成員miR-133a-3p可靶向結(jié)合核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(NOD-like receptor protein 3,NLRP3)阻斷其控制的炎癥信號,減輕對比劑腎病腎組織炎癥損傷[7],過度表達miR-133a-3可減輕脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細胞激活,降低促炎細胞因子表達[8],還可減少慢性縮窄性損傷大鼠炎癥因子產(chǎn)生,抑制脊髓神經(jīng)炎癥,改善大鼠神經(jīng)病理性疼痛[9],miR-133作為進化上保守的微小RNA,對其進行敲除時Shh表達廣泛下調(diào),激活Shh信號可挽救miR-133敲除導(dǎo)致的胚胎肌生成受損[10],推測miR-133a和Shh之間可能互相調(diào)控對方表達,Shh-BMSCs 外泌體可能通過調(diào)控miR-133a促使SCI后功能恢復(fù)。本文以LPS處理大鼠脊髓神經(jīng)元構(gòu)建SCI細胞模型,探討Shh-BMSCs 外泌體調(diào)控miR-133a對LPS誘導(dǎo)脊髓神經(jīng)元細胞凋亡的影響。

    1 材料與方法

    1.1 主要試劑與儀器 大鼠脊髓神經(jīng)元細胞(貨號CP-R144)、大鼠脊髓神經(jīng)元細胞完全培養(yǎng)基(貨號CM-R144)、大鼠BMSCs(貨號CP-R131)、大鼠BMSCs完全培養(yǎng)基(貨號CM-R131)-武漢普諾賽生命科技有限公司;CCK-8細胞活力檢測試劑盒(貨號G021-1-2)購自南京建成生物工程研究所有限公司;Shh過表達質(zhì)粒、miR-133a inhibitor、miR-133a inhibitor陰性對照、miR-133a及U6、Shh、GAPDH引物、(FITC/PI雙染法)Annexin V凋亡檢測試劑盒(貨號E606336-0100)、大鼠腫瘤壞死因子-α(TNF-α)酶聯(lián)免疫吸附測定(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒(D731168)、大鼠白細胞介素-1β(IL-1β) ELISA試劑盒(貨號D731007)、大鼠白細胞介素IL-10 ELISA試劑盒(貨號D731011)、一步法反轉(zhuǎn)錄熒光定量試劑盒(貨號B639277)購自上海生工生物工程股份有限公司;兔源抗大鼠Shh抗體(貨號ab19897)、兔源抗大鼠ASC抗體(貨號ab180799)、兔源抗大鼠caspase-1抗體(貨號ab286125)、兔源抗大鼠GAPDH一抗(貨號ab181602)、兔源抗大鼠β-tublin Ⅲ抗體(貨號ab18207)、兔源抗大鼠NLRP3一抗(貨號ab263899)購自美國Abcam公司;辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗(貨號A0208)、免疫熒光染色試劑盒-抗兔Alexa Fluor 555(貨號P0179)-購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司等。全波長酶標(biāo)儀購自杭州奧盛儀器有限公司-型號FlexA-200;流式細胞儀購自廣州吉源生物科技有限公司-型號CyFlow Cube8;倒置熒光顯微鏡購自蘇州阿爾法生物實驗器材有限公司-型號MF-53N;實時熒光定量PCR儀購自美國美谷分子公司-型號ForeQuant F4/F6;基礎(chǔ)電泳電源、小型垂直電泳槽、小型轉(zhuǎn)印槽均購自廣州道一科學(xué)技術(shù)有限公司-型號Basic 200、Di PES-5、Di TB-5;化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀購自森西賽智科技有限公司-型號ChampChemi500等。

    1.2 方法

    1.2.1 Shh-BMSCs外泌體制備 快速解凍購買的大鼠BMSCs,以其完全培養(yǎng)基于含5%CO2、95%O2的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中進行復(fù)蘇培養(yǎng),取傳到第3代的BMSCs接種在培養(yǎng)皿中,使用脂質(zhì)體2000并參照其說明書中步驟轉(zhuǎn)染Shh過表達質(zhì)粒,24 h后采用可去除外泌體的MEMα完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)繼續(xù)培養(yǎng)BMSCs,48 h后收集培養(yǎng)基進行超高速離心,分離得到Shh-BMSCs外泌體,將其置于鎳網(wǎng),于室溫下干燥晾干[11]。

    1.2.2 LPS和Shh-BMSCs外泌體最佳作用 濃度篩選快速解凍購買的大鼠脊髓神經(jīng)元細胞,復(fù)蘇培養(yǎng)并傳代后接種在無菌96孔板中,每孔約含有1×104個細胞,培養(yǎng)24 h后分別以0、100、300、500、700、900 μg/mL的LPS處理[12],24 h后采用CCK-8細胞活力檢測試劑盒檢測各組細胞活力,公式為:細胞活力=(藥物組吸光度-空白組吸光度)/(對照組吸光度-空白組吸光度)×100%,分析得出IC50值,篩選出LPS最佳作用濃度。以500 μg/mL的LPS處理傳代的大鼠脊髓神經(jīng)元細胞誘導(dǎo)建立SCI細胞模型,采用CCK-8細胞活力檢測試劑盒檢測經(jīng)0、20、40、80、120、160 μg/mL的Shh-BMSCs外泌體處理[11]24 h后的各組細胞活力,具體方法與上相同。

    1.2.3 細胞分組處理及標(biāo)本收集 取傳代的大鼠脊髓神經(jīng)元細胞接種在無菌的24孔板中,于含5%CO2、95%O2的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),24 h后隨機分為對照組、模型組、Shh-BMSCs外泌體組、miR-133a inhibitor組、miR-133a inhibitor陰性對照組、Shh-BMSCs外泌體+miR-133a inhibitor組,對照組不做處理,其余各組以500 μg/mL的LPS處理誘導(dǎo)建立SCI細胞模型,同時Shh-BMSCs外泌體組以80 μg/mL的Shh-BMSCs外泌體處理,miR-133a inhibitor組、miR-133a inhibitor陰性對照組采用脂質(zhì)體2000并參照其說明書中步驟分別轉(zhuǎn)染miR-133a inhibitor及其陰性對照,Shh-BMSCs外泌體+miR-133a inhibitor組以80 μg/mL的Shh-BMSCs外泌體處理同時轉(zhuǎn)染miR-133a inhibitor,24 h收集各組細胞及其培養(yǎng)液。

    1.2.4 檢測各組細胞凋亡情況 取1.2.3中收集的各組細胞,以PBS清洗后重懸,混勻后計數(shù),每組取約含5×105個細胞的細胞懸液離心,向細胞沉淀中加入Annexin V凋亡檢測試劑盒中染液,避光條件下做FITC/PI雙染處理,然后以PBS再次清洗細胞后通過流式細胞儀測定分析各組細胞凋亡率。

    1.2.5 檢測各組細胞軸突長度 取傳代的大鼠脊髓神經(jīng)元細胞接種在無菌的24孔板中(每孔中含有細胞載玻片),于含5%CO2、95%O2的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),24 h后按照1.2.3中方法進行分組處理24 h,以PBS清洗細胞后分別加入5%牛血清白蛋白、兔源抗大鼠β-tublin Ⅲ抗體溶液進行孵育,以PBS漂洗后加入Alexa Fluor 555標(biāo)記的抗兔二抗孵育做免疫熒光染色,以PBS再次漂洗后,取出各組細胞爬片滴加抗熒光淬滅劑后封片,參照免疫熒光染色試劑盒說明指導(dǎo)于熒光顯微鏡下觀察,神經(jīng)元呈現(xiàn)紅色,任選3個視野拍照,使用Image J軟件中的Neuron J插件對圖像中軸突長度進行定量分析。

    1.2.6 測定各組細胞TNF-α、IL-1β、IL-10釋放水平 取1.2.3中收集的各組細胞培養(yǎng)液,以1000 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min,采用ELISA法檢測其中TNF-α、IL-1 β和IL-10水平,具體步驟參照各自ELISA試劑盒說明書中方法進行。

    1.2.7 測定各組細胞miR-133a和Shh mRNA表達 取1.2.3中收集的各組細胞,采用Trizol試劑并參照其說明指導(dǎo)提取出各組總RNA,然后采用一步法反轉(zhuǎn)錄熒光定量試劑盒中試劑分別加入各基因引物及總RNA配制反應(yīng)體系,配制方法及反應(yīng)條件設(shè)置參照其試劑盒說明書指導(dǎo)進行,miR-133a選用U6做內(nèi)參,Shh選用GAPDH做內(nèi)參,實驗所得Ct值采用2-ΔΔCt算法做分析得出miR-133a和Shh mRNA表達,引物序列如下:miR-133a上游引物:5′-CTCGAGCT CAAGTAGGGATCCAGCATTGGTATGATAATT-3′,下游引物:5′-AGCGCTGCTCGAGGCAAGCTTT TATTTGATTATAATCAC-3′;GAPDH上游引物:5′-AGGCTGAGAACGGGAAGC-3′,下游引物:5′-CC ATGGTGGTGAAGACGC-3′;Shh上游引物:5′-AA AAGCTGACCCCTTTAGCC-3′,下游引物:5′-GAT GTCGGGGTTGTAATTGC-3′;U6上游引物:5′-GA CACGCAAATTCGTGAAGCG-3′,下游引物:5′-TC CAGTGCAGGGTCCGAG-3′。

    1.2.8 檢測各組細胞Shh及NLRP3炎性通路蛋白水平 取1.2.3中收集的各組細胞,采用RIPA裂解液并參照其說明指導(dǎo)提取出各組總蛋白,然后采用改良型BCA蛋白濃度測定試劑盒測量其濃度,具體方法參照其試劑盒說明書指導(dǎo)進行,根據(jù)測量結(jié)果每組取20 μg總蛋白沸水浴變性、120V恒壓跑電泳、40mA穩(wěn)流濕轉(zhuǎn),獲得按分子量大小分離開的蛋白承載在硝酸纖維膜上,將GAPDH、Shh、NLRP3、ASC、caspase-1蛋白按照其分子量從膜上裁下,分別孵育3%牛血清白蛋白、均稀釋2000倍的一抗、稀釋1000倍的二抗,封閉后進行抗原抗體反應(yīng),滴加化學(xué)發(fā)光試劑顯色蛋白條帶,采集其圖像后使用Image J軟件對其灰度進行定量,最后統(tǒng)計后得出各蛋白相對表達。

    2 結(jié)果

    2.1 LPS和Shh-BMSCs外泌體作用濃度確定 不同濃度LPS均可降低脊髓神經(jīng)元細胞活力(見圖1)。IC50值為(507.76±5.23) μg/mL,選擇接近IC50的500 μg/mL LPS處理脊髓神經(jīng)元細胞進行后續(xù)實驗。

    圖1 不同濃度LPS對脊髓神經(jīng)元細胞活力的影響Figure 1 Effect of different concentrations of LPS on the activity of spinal cord neurons注:與0 μg/mL LPS相比,①P<0.05。

    不同濃度Shh-BMSCs外泌體均可提升LPS誘導(dǎo)脊髓神經(jīng)元細胞活力,在一定濃度范圍內(nèi),隨Shh-BMSCs外泌體濃度升高而作用增強,在濃度為80 μg/mL時,脊髓神經(jīng)元細胞活力進入平臺期,Shh-BMSCs外泌體對其的提升作用不再增強,因此選擇80 μg/mL Shh-BMSCs外泌體處理LPS誘導(dǎo)脊髓神經(jīng)元細胞進行后續(xù)實驗。見圖2。

    圖2 不同濃度Shh-BMSCs外泌體對LPS誘導(dǎo)脊髓神經(jīng)元細胞活力的影響Figure 2 Effects of different concentrations of Shh BMSCs exosomes on the activity of spinal cord neurons induced by LPS注:與0 μg/mL Shh-BMSCs外泌體相比,①P<0.05。

    2.2 Shh-BMSCs外泌體對LPS誘導(dǎo)脊髓神經(jīng)元細胞凋亡的影響 與對照組比較,模型組脊髓神經(jīng)元細胞凋亡率明顯升高(P<0.05)。與模型組比較,Shh-BMSCs外泌體組脊髓神經(jīng)元細胞凋亡率降低(P<0.05);miR-133a inhibitor組脊髓神經(jīng)元細胞凋亡率升高(P<0.05);miR-133a inhibitor陰性對照組脊髓神經(jīng)元細胞凋亡率無明顯變化(P>0.05)。與Shh-BMSCs外泌體組比較,Shh-BMSCs外泌體+miR-133a inhibitor組脊髓神經(jīng)元細胞凋亡率升高(P<0.05)。見圖3、表1。

    表1 各組脊髓神經(jīng)元細胞凋亡率和細胞軸突長度Table1 Apoptosis rate andLength of axons of spinal cord neurons in each group

    圖3 流式細胞實驗檢測各組脊髓神經(jīng)元凋亡情況Figure 3 Detection of apoptosis of spinal cord neurons in each group by flow cytometry

    2.3 Shh-BMSCs外泌體對LPS誘導(dǎo)脊髓神經(jīng)元細胞軸突長度的影響 與對照組比較,模型組脊髓神經(jīng)元細胞軸突長度明顯降低(P<0.05)。與模型組比較,Shh-BMSCs外泌體組脊髓神經(jīng)元細胞軸突長度升高(P<0.05);miR-133a inhibitor組脊髓神經(jīng)元細胞軸突長度降低(P<0.05);miR-133a inhibitor陰性對照組脊髓神經(jīng)元細胞軸突長度無明顯變化(P>0.05)。與Shh-BMSCs外泌體組比較,Shh-BMSCs外泌體+miR-133a inhibitor組脊髓神經(jīng)元細胞軸突長度降低(P<0.05)。見圖4、表1。

    圖4 免疫熒光染色β-tublin Ⅲ檢測各組脊髓神經(jīng)元細胞軸突(1000×)Figure 4 Immunofluorescence staining β-Tublin Ⅲ to detect axons of spinal cord neurons in each group

    2.4 Shh-BMSCs外泌體對LPS誘導(dǎo)脊髓神經(jīng)元細胞炎癥因子TNF-α、IL-1 β和IL-10釋放水平的影響 與對照組比較,模型組脊髓神經(jīng)元細胞TNF-α、IL-1 β釋放水平明顯升高(均P<0.05),IL-10釋放水平明顯降低(P<0.05)。與模型組比較,Shh-BMSCs外泌體組脊髓神經(jīng)元細胞TNF-α、IL-1 β釋放水平降低(均P<0.05),IL-10釋放水平升高(P<0.05);miR-133a inhibitor組脊髓神經(jīng)元細胞TNF-α、IL-1 β釋放水平升高(均P<0.05),IL-10釋放水平降低(P<0.05);miR-133a inhibitor陰性對照組脊髓神經(jīng)元細胞TNF-α、IL-1 β和IL-10釋放水平均無明顯變化(均P>0.05)。與Shh-BMSCs外泌體組比較,Shh-BMSCs外泌體+miR-133a inhibitor組脊髓神經(jīng)元細胞TNF-α、IL-1 β釋放水平升高(P<0.05),IL-10釋放水平降低(均P<0.05)。見表2。

    表2 脊髓神經(jīng)元TNF-α、IL-1β和IL-10釋放水平Table 2 TNF-α, IL-1β and IL-10 release levels of spinal cord neurons in each group

    2.5 Shh-BMSCs外泌體對LPS誘導(dǎo)脊髓神經(jīng)元細胞miR-133a和Shh mRNA表達的影響 與對照組比較,模型組脊髓神經(jīng)元細胞miR-133a和Shh mRNA表達明顯降低(P<0.05)。與模型組比較,Shh-BMSCs外泌體組脊髓神經(jīng)元細胞miR-133a和Shh mRNA表達升高(P<0.05);miR-133a inhibitor組脊髓神經(jīng)元細胞miR-133a和Shh mRNA表達降低(P<0.05);miR-133a inhibitor陰性對照組脊髓神經(jīng)元細胞miR-133a和Shh mRNA表達均無明顯變化(P>0.05)。與Shh-BMSCs外泌體組比較,Shh-BMSCs外泌體+miR-133a inhibitor組脊髓神經(jīng)元細胞miR-133a和Shh mRNA表達降低(P<0.05)。見圖5。

    圖5 各組脊髓神經(jīng)元細胞miR-133a和Shh mRNA相對表達Figure 5 Relative expression of miR-133a and Shh mRNA in spinal cord neurons of each group注:與對照組相比,①P<0.05;與模型組相比,②P<0.05;與Shh-BMSCs外泌體組相比,③P<0.05。

    2.6 Shh-BMSCs外泌體對LPS誘導(dǎo)脊髓神經(jīng)元細胞Shh及NLRP3炎性信號相關(guān)蛋白表達的影響 與對照組比較,模型組脊髓神經(jīng)元細胞Shh蛋白表達明顯降低(P<0.05),NLRP3、ASC、caspase-1蛋白表達明顯升高(P<0.05)。與模型組、Shh-BMSCs外泌體+miR-133a inhibitor組分別比較,Shh-BMSCs外泌體組脊髓神經(jīng)元細胞Shh蛋白表達升高(P<0.05),NLRP3、ASC、caspase-1蛋白表達降低(P<0.05);miR-133a inhibitor組脊髓神經(jīng)元細胞Shh蛋白表達降低(P<0.05),NLRP3、ASC、caspase-1蛋白表達升高(P<0.05);miR-133a inhibitor陰性對照組脊髓神經(jīng)元細胞Shh、NLRP3、ASC、caspase-1蛋白表達均無明顯變化(P>0.05)。與Shh-BMSCs外泌體組比較,Shh-BMSCs外泌體+miR-133a inhibitor組脊髓神經(jīng)元細胞Shh蛋白表達降低(P<0.05),NLRP3、ASC、caspase-1蛋白表達升高(P<0.05)。見圖6、表3。

    表3 各組脊髓神經(jīng)元細胞Shh及NLRP3炎性信號相關(guān)蛋白相對表達Table 3 Relative expression of Shh and NLRP3 inflammatory signal related protein in spinal cord neurons of each group

    圖6 免疫印跡實驗檢測各組脊髓神經(jīng)元細胞Shh及NLRP3炎性信號相關(guān)蛋白表達Figure 6 Expression of Shh and NLRP3 inflammatory signal related protein in spinal cord neurons of each group detected by Western blot注:A.對照組;B.模型組;C.Shh-BMSCs外泌體組;D.miR-133a inhibitor陰性對照組;E.miR-133a inhibitor陰性對照組;F.Shh-BMSCs外泌體+miR-133a inhibitor組。

    3 討論

    SCI其臨床主要以外科手術(shù)、物理治療、藥物治療等為主,還發(fā)展了基因治療、細胞移植治療等新型治療手法,但患者神經(jīng)功能的恢復(fù)并不理想,截至目前還沒有公認有效的治療手段,其最大的障礙在于神經(jīng)元的死亡和受損形態(tài)難以修復(fù),因而積極探索改善神經(jīng)元凋亡和形態(tài)功能的策略對于SCI患者神經(jīng)功能的修復(fù)意義重大[13-14]。炎癥是造成SCI后神經(jīng)元形態(tài)損傷和變性死亡的主要原因[3-4],因此本文以LPS處理大鼠脊髓神經(jīng)元構(gòu)建SCI細胞模型,結(jié)果顯示,以LPS處理大鼠脊髓神經(jīng)元細胞,可明顯降低其軸突長度及IL-10釋放水平,升高其凋亡率、TNF-α與IL-1 β釋放水平及NLRP3、ASC、caspase-1蛋白表達,表明LPS可誘導(dǎo)神經(jīng)元促炎因子TNF-α、IL-1 β過量表達釋放,減少抗炎因子IL-10表達釋放,激活NLRP3炎性信號,造成神經(jīng)元炎癥損傷,導(dǎo)致其軸突受損變短,細胞大量凋亡,揭示SCI細胞模型構(gòu)建成功。

    研究[15]顯示進行抗炎治療可增加SCI后神經(jīng)元的數(shù)量并改善其形態(tài),修復(fù)SCI大鼠運動功能,Shh可調(diào)控炎癥介導(dǎo)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷過程,Shh可抑制炎癥,顯著減少SCI大鼠神經(jīng)元凋亡,進而修復(fù)SCI后神經(jīng)功能[5,16]。BMSCs分泌的外泌體可顯著增加SCI模型大鼠脊髓中Shh表達,修復(fù)脊髓神經(jīng)損傷,且BMSCs外泌體過表達Shh時對SCI修復(fù)效果更好[6],而在Shh沉默的大鼠中,BMSCs外泌體在SCI修復(fù)中基本完全無效[17]。本文研究結(jié)果表明,Shh-BMSCs外泌體可上調(diào)脊髓神經(jīng)元中Shh表達,促進抗炎因子表達,減少促炎因子產(chǎn)生,抑制NLRP3炎性信號激活,減輕神經(jīng)元炎癥損傷,修復(fù)神經(jīng)元軸突形態(tài),緩解LPS誘導(dǎo)的脊髓神經(jīng)元細胞凋亡,揭示Shh-BMSCs外泌體具有明顯的神經(jīng)保護作用。

    miR-133a作為重要的炎性調(diào)節(jié)因子,可通過靶向下調(diào)NLRP3表達,抑制其炎性小體生成及其介導(dǎo)的促炎反應(yīng)和細胞熱下垂,降低炎性因子表達,減輕炎癥性細胞死亡,緩解腎組織、主動脈及心肌炎癥損傷[7,18-19]。研究[10]表明miR-133敲除時Shh表達廣泛下調(diào),激活Shh信號可逆轉(zhuǎn)敲除miR-133導(dǎo)致的細胞增殖、外基質(zhì)沉積和上皮化受損,由此可知miR-133a和Shh之間可能對對方表達有互相調(diào)控作用,但Shh-BMSCs 外泌體是否可調(diào)控miR-133a的表達,進而介導(dǎo)LPS誘導(dǎo)的大鼠脊髓神經(jīng)元凋亡,目前還不清楚。本研究結(jié)果顯示,Shh-BMSCs外泌體處理LPS誘導(dǎo)的大鼠脊髓神經(jīng)元后,神經(jīng)元中miR-133a表達升高,以miR-133a inhibitor處理LPS誘導(dǎo)的大鼠脊髓神經(jīng)元可加重神經(jīng)元炎性損傷,進一步增強其凋亡,表明miR-133a介導(dǎo)Shh-BMSCs外泌體對LPS誘導(dǎo)的脊髓神經(jīng)元細胞凋亡的抑制過程;以Shh-BMSCs外泌體和miR-133a inhibitor聯(lián)合處理LPS誘導(dǎo)的脊髓神經(jīng)元細胞,相比Shh-BMSCs外泌體單獨處理,可降低神經(jīng)元細胞軸突長度、IL-10釋放水平、Shh mRNA及蛋白表達,升高其凋亡率及NLRP3、ASC、caspase-1蛋白表達,表明下調(diào)miR-133a表達可減弱Shh-BMSCs外泌體對NLRP3炎性信號的下調(diào)及炎癥反應(yīng)的抑制,拮抗其對神經(jīng)元形態(tài)的改善及凋亡的減輕作用,最終逆轉(zhuǎn)Shh-BMSCs外泌體對LPS誘導(dǎo)大鼠脊髓神經(jīng)元的保護作用,揭示Shh-BMSCs 外泌體減輕LPS誘導(dǎo)脊髓神經(jīng)元細胞凋亡是通過上調(diào)miR-133a實現(xiàn)的。

    4 結(jié)論

    Shh-BMSCs外泌體可通過促進miR-133a表達而阻斷NLRP3炎性途徑傳導(dǎo),進而降低LPS誘導(dǎo)的促炎因子表達釋放,減輕脊髓神經(jīng)元細胞炎癥,阻止其發(fā)生凋亡,改善其軸突結(jié)構(gòu)損傷,最終起到明顯神經(jīng)保護作用。實驗結(jié)果為SCI后神經(jīng)元損傷修復(fù)提供了新的手法選擇,有利于SCI患者神經(jīng)功能恢復(fù)方法的改進與發(fā)展。

    猜你喜歡
    貨號外泌體脊髓
    人工3D脊髓能幫助癱瘓者重新行走?
    軍事文摘(2022年8期)2022-11-03 14:22:01
    外泌體miRNA在肝細胞癌中的研究進展
    間充質(zhì)干細胞外泌體在口腔組織再生中的研究進展
    鞋品牌新品爆單“故事匯”
    循環(huán)外泌體在心血管疾病中作用的研究進展
    外泌體在腫瘤中的研究進展
    作者更正致歉說明
    姜黃素對脊髓損傷修復(fù)的研究進展
    中西醫(yī)結(jié)合治療脊柱骨折合并脊髓損傷25例
    間歇導(dǎo)尿配合溫和灸治療脊髓損傷后尿潴留30例
    午夜福利成人在线免费观看| 美女 人体艺术 gogo| 国产精品日韩av在线免费观看| 国产免费一级a男人的天堂| 亚洲av成人精品一区久久| 在现免费观看毛片| 深夜精品福利| 22中文网久久字幕| 91在线观看av| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 日韩强制内射视频| 国产真实伦视频高清在线观看| 久久久久国产网址| 亚洲国产精品国产精品| 亚洲一区高清亚洲精品| 偷拍熟女少妇极品色| 看免费成人av毛片| 一本精品99久久精品77| 日韩亚洲欧美综合| 久久久精品94久久精品| 亚洲国产精品sss在线观看| 99久久九九国产精品国产免费| 精品人妻一区二区三区麻豆 | 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 成人午夜高清在线视频| 国产高清有码在线观看视频| 免费看av在线观看网站| 午夜视频国产福利| 久久久久九九精品影院| 床上黄色一级片| 午夜影院日韩av| 波野结衣二区三区在线| 久久久精品大字幕| 美女 人体艺术 gogo| 久久6这里有精品| 亚州av有码| 久久久午夜欧美精品| 少妇高潮的动态图| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 乱系列少妇在线播放| 亚洲av第一区精品v没综合| 国产精品一及| 国产爱豆传媒在线观看| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 国产精品永久免费网站| 能在线免费观看的黄片| 最近中文字幕高清免费大全6| 色吧在线观看| 神马国产精品三级电影在线观看| 精品少妇黑人巨大在线播放 | 国产精品爽爽va在线观看网站| 香蕉av资源在线| 国产三级中文精品| 欧美不卡视频在线免费观看| 亚洲av成人精品一区久久| 国产亚洲欧美98| 国模一区二区三区四区视频| 变态另类丝袜制服| 美女大奶头视频| 国产一级毛片七仙女欲春2| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 一本精品99久久精品77| 麻豆乱淫一区二区| 亚洲五月天丁香| 久久久久久久午夜电影| 一区福利在线观看| 高清午夜精品一区二区三区 | 美女被艹到高潮喷水动态| 亚洲av电影不卡..在线观看| 欧美色视频一区免费| 校园人妻丝袜中文字幕| 日韩欧美三级三区| 无遮挡黄片免费观看| av.在线天堂| 免费看光身美女| 少妇熟女欧美另类| 99riav亚洲国产免费| 中文字幕熟女人妻在线| 日日撸夜夜添| 欧美日本亚洲视频在线播放| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 欧美日韩在线观看h| 国产午夜福利久久久久久| 少妇熟女aⅴ在线视频| 中文字幕久久专区| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 51国产日韩欧美| 99riav亚洲国产免费| 观看美女的网站| 久久精品影院6| www.色视频.com| 日本与韩国留学比较| 国产成人精品久久久久久| 天天一区二区日本电影三级| 99久久精品一区二区三区| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 国产视频内射| 国产精品嫩草影院av在线观看| 99国产精品一区二区蜜桃av| 丰满乱子伦码专区| 久久久久久久久久黄片| 亚洲欧美日韩无卡精品| 亚洲精品国产av成人精品 | 91精品国产九色| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 少妇熟女aⅴ在线视频| 伦精品一区二区三区| 十八禁网站免费在线| 超碰av人人做人人爽久久| 韩国av在线不卡| 久久久久久久久中文| 国内精品美女久久久久久| 色综合亚洲欧美另类图片| 校园人妻丝袜中文字幕| 亚洲成a人片在线一区二区| 国产av麻豆久久久久久久| 亚洲最大成人中文| 亚洲av中文av极速乱| 91麻豆精品激情在线观看国产| 波多野结衣高清作品| 18禁在线无遮挡免费观看视频 | ponron亚洲| 久久久久久久久久黄片| 大香蕉久久网| 校园春色视频在线观看| 国产69精品久久久久777片| 精品人妻熟女av久视频| 国产精华一区二区三区| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 日本免费a在线| a级毛片a级免费在线| 五月玫瑰六月丁香| 丰满的人妻完整版| eeuss影院久久| 村上凉子中文字幕在线| 中文字幕av成人在线电影| 国内精品美女久久久久久| 在线观看免费视频日本深夜| 伦理电影大哥的女人| 日韩,欧美,国产一区二区三区 | 久久这里只有精品中国| 日韩中字成人| 亚洲国产精品sss在线观看| 免费看a级黄色片| 亚洲18禁久久av| 69人妻影院| 久久久久性生活片| 麻豆av噜噜一区二区三区| 午夜激情福利司机影院| 黑人高潮一二区| 变态另类丝袜制服| 日本黄大片高清| 白带黄色成豆腐渣| 人人妻人人看人人澡| 淫妇啪啪啪对白视频| 晚上一个人看的免费电影| 精品人妻熟女av久视频| 美女内射精品一级片tv| 在线观看美女被高潮喷水网站| 97超视频在线观看视频| 色视频www国产| 中国美女看黄片| 国产精品女同一区二区软件| 亚洲av免费在线观看| 国产一区二区在线观看日韩| 欧美又色又爽又黄视频| 亚洲一区二区三区色噜噜| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 久久精品国产亚洲av天美| 女人被狂操c到高潮| 国产成人aa在线观看| 日韩欧美精品免费久久| 男女之事视频高清在线观看| 亚洲国产欧美人成| 精品乱码久久久久久99久播| 精华霜和精华液先用哪个| 久久精品人妻少妇| 亚洲欧美精品自产自拍| 一级黄色大片毛片| 欧美+日韩+精品| 18+在线观看网站| 中出人妻视频一区二区| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 亚洲av免费高清在线观看| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 乱人视频在线观看| 国产男人的电影天堂91| 久久99热这里只有精品18| av国产免费在线观看| 午夜福利在线在线| 久久久久久九九精品二区国产| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 久久久久国产网址| 搡老熟女国产l中国老女人| 亚洲丝袜综合中文字幕| 乱码一卡2卡4卡精品| 夜夜夜夜夜久久久久| 最近2019中文字幕mv第一页| 好男人在线观看高清免费视频| 高清毛片免费观看视频网站| 成人午夜高清在线视频| 精品免费久久久久久久清纯| 激情 狠狠 欧美| 淫秽高清视频在线观看| 亚洲精品粉嫩美女一区| 国产男人的电影天堂91| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 日韩大尺度精品在线看网址| 麻豆一二三区av精品| av专区在线播放| 国产探花在线观看一区二区| 成人美女网站在线观看视频| 级片在线观看| 午夜久久久久精精品| 精品久久久久久成人av| 成人二区视频| 如何舔出高潮| 亚洲av电影不卡..在线观看| 欧美成人精品欧美一级黄| 啦啦啦啦在线视频资源| 日本黄色片子视频| 又爽又黄无遮挡网站| 成年免费大片在线观看| 久久99热6这里只有精品| 亚洲成人久久爱视频| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 亚洲av免费高清在线观看| 男人和女人高潮做爰伦理| 男人和女人高潮做爰伦理| 久久九九热精品免费| 国产亚洲av嫩草精品影院| 久久久久九九精品影院| 美女cb高潮喷水在线观看| 午夜免费激情av| 男人和女人高潮做爰伦理| 久久久色成人| 精品人妻熟女av久视频| 热99re8久久精品国产| 午夜激情欧美在线| 韩国av在线不卡| 久久久国产成人精品二区| 91精品国产九色| 亚洲不卡免费看| 又爽又黄a免费视频| 精品一区二区三区av网在线观看| 成人美女网站在线观看视频| 青春草视频在线免费观看| 国产激情偷乱视频一区二区| 日韩在线高清观看一区二区三区| 中文资源天堂在线| 久久鲁丝午夜福利片| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜 | 久久久久免费精品人妻一区二区| 午夜影院日韩av| 国产精品一区二区三区四区久久| 在线免费十八禁| 可以在线观看的亚洲视频| 久久精品夜色国产| 亚洲成a人片在线一区二区| 色视频www国产| 欧美另类亚洲清纯唯美| 中文字幕av在线有码专区| 人人妻人人澡欧美一区二区| 69人妻影院| 国产av一区在线观看免费| 日韩欧美在线乱码| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜 | 国产亚洲精品av在线| 午夜福利18| а√天堂www在线а√下载| 色尼玛亚洲综合影院| 亚洲欧美日韩东京热| 亚洲av中文av极速乱| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 长腿黑丝高跟| 两个人视频免费观看高清| 麻豆成人午夜福利视频| 午夜福利成人在线免费观看| 欧美最黄视频在线播放免费| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 91久久精品电影网| 精品久久久久久久久亚洲| 99在线人妻在线中文字幕| 亚洲国产精品成人综合色| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 午夜精品国产一区二区电影 | 99国产极品粉嫩在线观看| 高清日韩中文字幕在线| 日韩欧美免费精品| 欧美色视频一区免费| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 18+在线观看网站| 亚洲国产高清在线一区二区三| 欧美日本亚洲视频在线播放| 国产精品人妻久久久影院| 狠狠狠狠99中文字幕| 欧美xxxx性猛交bbbb| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 国产精品不卡视频一区二区| 亚洲第一区二区三区不卡| 看非洲黑人一级黄片| or卡值多少钱| 久久国内精品自在自线图片| 91精品国产九色| 亚洲中文日韩欧美视频| 欧美三级亚洲精品| eeuss影院久久| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 最近手机中文字幕大全| 午夜福利成人在线免费观看| 免费av观看视频| 欧美三级亚洲精品| 精品国产三级普通话版| 中国国产av一级| 亚洲最大成人手机在线| 晚上一个人看的免费电影| 久久久欧美国产精品| 日本-黄色视频高清免费观看| 精品久久久久久久久亚洲| 激情 狠狠 欧美| av女优亚洲男人天堂| 天堂影院成人在线观看| 黄色配什么色好看| 2021天堂中文幕一二区在线观| 亚洲内射少妇av| 男插女下体视频免费在线播放| 校园春色视频在线观看| 久久久久免费精品人妻一区二区| 一进一出抽搐gif免费好疼| 99久久精品热视频| 国产高清有码在线观看视频| 韩国av在线不卡| 亚洲丝袜综合中文字幕| 成人特级黄色片久久久久久久| 日韩精品有码人妻一区| 搡老妇女老女人老熟妇| 国产中年淑女户外野战色| 国产在视频线在精品| 成年版毛片免费区| 搡老岳熟女国产| 欧美一区二区亚洲| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 国产 一区 欧美 日韩| 大香蕉久久网| 91av网一区二区| 免费大片18禁| 在线看三级毛片| 人人妻人人看人人澡| 成人毛片a级毛片在线播放| 国产成人91sexporn| 免费人成视频x8x8入口观看| 欧美色欧美亚洲另类二区| 亚洲人成网站在线观看播放| 一进一出抽搐gif免费好疼| 日本精品一区二区三区蜜桃| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 国产中年淑女户外野战色| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 午夜视频国产福利| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 国产爱豆传媒在线观看| 长腿黑丝高跟| 99在线视频只有这里精品首页| 日本一本二区三区精品| 高清午夜精品一区二区三区 | 亚洲精品久久国产高清桃花| 成年免费大片在线观看| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 国产乱人视频| 国国产精品蜜臀av免费| 亚洲成人久久爱视频| a级一级毛片免费在线观看| 成人毛片a级毛片在线播放| 长腿黑丝高跟| 亚洲国产精品成人久久小说 | 久久精品国产鲁丝片午夜精品| av天堂中文字幕网| 久久久久久久久大av| 一边摸一边抽搐一进一小说| 亚洲第一电影网av| 欧美日韩综合久久久久久| 日日撸夜夜添| 99久久精品国产国产毛片| 99热这里只有是精品50| 精品熟女少妇av免费看| 天堂动漫精品| 亚洲国产色片| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 22中文网久久字幕| 91久久精品国产一区二区三区| 欧美色视频一区免费| 一级毛片aaaaaa免费看小| 免费在线观看影片大全网站| 99在线人妻在线中文字幕| 国产成人aa在线观看| 18+在线观看网站| 亚洲自拍偷在线| 69人妻影院| 中文字幕免费在线视频6| 亚洲最大成人中文| 成人国产麻豆网| 最后的刺客免费高清国语| 99热这里只有是精品50| 两个人的视频大全免费| 国产精品日韩av在线免费观看| 最近的中文字幕免费完整| 国产伦精品一区二区三区四那| 日韩精品有码人妻一区| 1024手机看黄色片| 国产激情偷乱视频一区二区| 波多野结衣高清无吗| 欧美日韩乱码在线| 欧美激情国产日韩精品一区| 亚洲成人精品中文字幕电影| 99久久无色码亚洲精品果冻| 成人永久免费在线观看视频| 日韩强制内射视频| 看黄色毛片网站| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 精品久久久久久久久久免费视频| 亚洲欧美日韩无卡精品| 高清毛片免费观看视频网站| 国产麻豆成人av免费视频| 婷婷亚洲欧美| 国产私拍福利视频在线观看| 精品一区二区三区视频在线| 国产伦精品一区二区三区四那| 久久久午夜欧美精品| 日本爱情动作片www.在线观看 | 精品一区二区三区人妻视频| 九九热线精品视视频播放| 色视频www国产| 网址你懂的国产日韩在线| 美女黄网站色视频| 亚洲成人久久爱视频| 国产伦一二天堂av在线观看| 国内揄拍国产精品人妻在线| 高清毛片免费观看视频网站| 国产精品电影一区二区三区| 午夜影院日韩av| 久久午夜福利片| 黄色欧美视频在线观看| 日本五十路高清| 国产成人a∨麻豆精品| 日韩大尺度精品在线看网址| 亚洲精品一区av在线观看| 男女视频在线观看网站免费| 中文在线观看免费www的网站| 永久网站在线| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 欧美国产日韩亚洲一区| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 亚洲无线观看免费| 婷婷六月久久综合丁香| 亚洲国产色片| 伊人久久精品亚洲午夜| 在线免费观看的www视频| 久久人人爽人人片av| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 国产av不卡久久| 久久精品国产亚洲网站| 网址你懂的国产日韩在线| 校园人妻丝袜中文字幕| 高清毛片免费看| 99久久精品热视频| av黄色大香蕉| 国产伦精品一区二区三区视频9| 久久久国产成人免费| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 国产高清激情床上av| 国产真实乱freesex| 伊人久久精品亚洲午夜| 国产一区亚洲一区在线观看| 欧美3d第一页| 国产极品精品免费视频能看的| 国产精品精品国产色婷婷| 久久久久久久久久久丰满| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 午夜免费男女啪啪视频观看 | 成年女人毛片免费观看观看9| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 久久精品影院6| 国产精品av视频在线免费观看| 99riav亚洲国产免费| 亚洲欧美成人精品一区二区| 国产精品av视频在线免费观看| 国产麻豆成人av免费视频| 亚洲av二区三区四区| a级毛片a级免费在线| 又爽又黄a免费视频| 欧美+亚洲+日韩+国产| videossex国产| av在线亚洲专区| 波多野结衣高清作品| 欧美成人免费av一区二区三区| 12—13女人毛片做爰片一| 亚洲国产精品成人综合色| 天堂av国产一区二区熟女人妻| av中文乱码字幕在线| 99久久精品国产国产毛片| 国产免费男女视频| 亚洲熟妇熟女久久| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 国模一区二区三区四区视频| 中国美白少妇内射xxxbb| 天堂动漫精品| 成年av动漫网址| 日日啪夜夜撸| 给我免费播放毛片高清在线观看| 18+在线观看网站| 亚洲欧美成人综合另类久久久 | 日本-黄色视频高清免费观看| 69人妻影院| 日韩欧美在线乱码| 日韩三级伦理在线观看| 午夜精品国产一区二区电影 | 国产精品女同一区二区软件| 中文字幕久久专区| 久久这里只有精品中国| 久久99热6这里只有精品| 人妻夜夜爽99麻豆av| 亚洲五月天丁香| 久久久久久久久久成人| 成年女人永久免费观看视频| 久久久久精品国产欧美久久久| 国产真实伦视频高清在线观看| 人妻少妇偷人精品九色| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 69人妻影院| 中国美白少妇内射xxxbb| 变态另类丝袜制服| 老师上课跳d突然被开到最大视频| av国产免费在线观看| 51国产日韩欧美| 亚洲欧美精品自产自拍| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 内射极品少妇av片p| 国产精品爽爽va在线观看网站| 天堂网av新在线| 一进一出好大好爽视频| 午夜激情福利司机影院| 人妻夜夜爽99麻豆av| 国产成人影院久久av| 白带黄色成豆腐渣| 国产黄色小视频在线观看| 少妇的逼水好多| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 又爽又黄a免费视频| www日本黄色视频网| 麻豆av噜噜一区二区三区| 久久久久久九九精品二区国产| 春色校园在线视频观看| av福利片在线观看| 日韩av在线大香蕉| 国产免费男女视频| 中国国产av一级| 看黄色毛片网站| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 亚洲在线自拍视频| 亚洲av.av天堂| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 看非洲黑人一级黄片| 老司机午夜福利在线观看视频| 婷婷精品国产亚洲av在线| 最近2019中文字幕mv第一页| 两个人的视频大全免费| 99久国产av精品国产电影| 你懂的网址亚洲精品在线观看 | 老熟妇乱子伦视频在线观看| 一夜夜www| 日韩国内少妇激情av| 欧美日韩乱码在线| 搡老熟女国产l中国老女人| 九九热线精品视视频播放| 99久久精品一区二区三区| 长腿黑丝高跟| 联通29元200g的流量卡| 十八禁网站免费在线| 亚洲在线自拍视频| 五月玫瑰六月丁香| 成人美女网站在线观看视频| 久久久久久久久久黄片| av在线老鸭窝| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 99热网站在线观看| 精品久久久久久久久久久久久| 色综合亚洲欧美另类图片| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 国产男人的电影天堂91| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 我要看日韩黄色一级片| 伦理电影大哥的女人| 18禁在线无遮挡免费观看视频 | 淫秽高清视频在线观看| 18+在线观看网站| 亚洲美女视频黄频| 直男gayav资源| 日日撸夜夜添| 男女那种视频在线观看| 日本精品一区二区三区蜜桃| 精品久久久噜噜| 免费高清视频大片| 99久久精品一区二区三区| 久久久精品94久久精品| 亚洲精华国产精华液的使用体验 | 国产黄a三级三级三级人| 国产av麻豆久久久久久久| 成人特级av手机在线观看| 97超碰精品成人国产|