miR-137通過調(diào)控血紅素鐵輸出蛋白FLVCR、BCRP對(duì)大鼠I/R損傷的保護(hù)作用*

袁莉 鄧秋媚 向軍軍 陳煒 胡躍強(qiáng) 姚春

(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué),廣西 南寧 530020;2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,廣西 南寧 530020)

缺血性中風(fēng)(Ischemic stroke, IS)是一種致殘率和死亡率很高的腦血管疾病,為全球第二大死亡原因[1]。目前,急性缺血性腦卒中可用的治療方法是再通治療策略。由于時(shí)間或適應(yīng)癥的限制,它們僅適用于少數(shù)患者,并且效果中等。此外,抗血小板藥物具有高顱內(nèi)出血風(fēng)險(xiǎn),并且抗凝劑不能改善長(zhǎng)期結(jié)果。與世界其他國(guó)家相比,我國(guó)IS的復(fù)發(fā)率最高[2]。研究[3]表明,線粒體鐵死亡和miRNA等在IS的病理機(jī)制中起到重要作用。腦缺血再灌注(Ischemia/reperfusion,I/R)損傷時(shí),游離鐵與血紅素的過度積累,引起神經(jīng)毒性和線粒體鐵死亡,是卒中損傷的新機(jī)制[4]。因此研究與鐵的轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白或受體以及調(diào)控miRNA均可以作為I/R損傷的切入點(diǎn)。其中乳腺癌抗性蛋白(Breast cancer resistance protein,BCRP)和貓白血病病毒C亞組受體(Feline leukenmia virus receptor,FLVCR)是新近發(fā)現(xiàn)的血紅素鐵輸出蛋白,在缺血或缺氧條件下,兩者的表達(dá)和功能會(huì)發(fā)生變化,導(dǎo)致運(yùn)輸屏障發(fā)生改變,調(diào)控其表達(dá)可能會(huì)對(duì)I/R損傷發(fā)揮保護(hù)作用。miR-137在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中起著重要而復(fù)雜的作用,可能是通過調(diào)節(jié)鐵死亡對(duì)IS產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)作用,但對(duì)miR-137是否通過調(diào)控血紅素鐵輸出蛋白對(duì)IS產(chǎn)生作用的相關(guān)機(jī)制鮮少有報(bào)道。因此,初步探討B(tài)CRP和FLVCR在大鼠腦I/R損傷后的表達(dá)變化以及miR-137對(duì)二者的調(diào)控作用,從而進(jìn)一步了解miR-137與血紅素鐵輸出蛋白在IS的相關(guān)機(jī)制,為改善IS的預(yù)后提供一定的實(shí)驗(yàn)和理論參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性SD大鼠60只(2～3月齡,250±50 g,SPF級(jí)),購(gòu)自廣西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。由長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司提供,生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(湘)2019-0014。將大鼠飼養(yǎng)在溫度為25 ℃、濕度為45%～65%的條件下,自由獲取食物和水,適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d。本實(shí)驗(yàn)方案通過廣西中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào)DW20211204-195)。

1.2 試驗(yàn)試劑及儀器 ①主要儀器:石蠟切片機(jī)(HS-2205,山東歐萊博醫(yī)療器械有限公司),高速低溫組織研磨儀(Servicebio),Stereo Drive立體定位系統(tǒng)(NEUROSTAR,德國(guó)),PCR擴(kuò)增儀(瑞士Roche公司),高速離心機(jī)(賽默飛世爾科技,USA),光學(xué)顯微鏡(Olympus)。②主要試劑:rno-miR-137-3p mimics AAV和rno-miR-137-3p inhibitor AAV購(gòu)自上海吉滿生物科技有限公司,mRNA擴(kuò)增試劑盒(上海生物科技有限公司),TRIzolTM試劑(Ambion),mRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和miRNA擴(kuò)增試劑盒購(gòu)自新貝生物科技有限公司,二抗山羊抗兔IgG HRP(Biosharp,中國(guó)),Anti-FLVCR抗體(上?？道噬锟萍加邢薰?,Anti-BCRP抗體(北京Affinity Biosciences公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組 將大鼠隨機(jī)分成假手術(shù)(Sham operation, SO)組、模型(MCAO/R)組、miR-137模擬物(Mimic)組、miR-137模擬對(duì)照(Mimic對(duì)照)組、miR-137抑制物(Inhibitor)組、miR-137抑制對(duì)照(Inhibitor對(duì)照)組(n=10)。SO組:以假手術(shù)代替缺血再灌注,僅暴露大鼠頸動(dòng)脈并縫合。MCAO/R組:大鼠行大腦中動(dòng)脈閉塞2 h后拔出線栓造成再灌注損傷。miR-137mimic組:顱內(nèi)缺血側(cè)MCA區(qū)注射miR-137mimic,參照大鼠腦立體定位圖譜,將miR-137 mimic 2μl注射到缺血側(cè)MCA附近;7 d后制作MCAO/R模型。miR-137mimic對(duì)照組:miR-137mimic空載體代替miR-137mimic,余操作同Mimic組。miR-137 inhibitor組:顱內(nèi)缺血側(cè)MCA區(qū)注射miR-137inhibitor 2 μL,余操作同Mimic組。Inhibitor對(duì)照組:顱內(nèi)缺血側(cè)MCA區(qū)注射miR-137inhibitor空載體,余操作同Mimic組。每只大鼠再灌注后12、24 h處死,取材大鼠缺血半暗帶區(qū)腦組織。

1.4 腦立體定位 注射腺相關(guān)病毒將大鼠麻醉后固定在腦立體定位儀框架中[5]。吸取2 μL純化后的腺相關(guān)病毒,并固定在定位儀上。將注射器針尖移至大腦中動(dòng)脈標(biāo)記并鉆孔:AP:0,ML:-2.5 mm,DV:-3.5 mm(相對(duì)于前囟點(diǎn)和硬腦膜表面)。進(jìn)針深度為3 mm后緩慢注射腺相關(guān)病毒miR-137mimic或miR-137inhibitor或空載體。7 d后制備MCAO/R模型。

1.5 大鼠MCAO/R模型制備 在Longa線栓法的基礎(chǔ)上加以改良制備大鼠腦MCAO/R模型[6]。根據(jù)再灌注方案,2 h后固定大鼠把線栓拔出大約9 mm。Longa＇s評(píng)分大于1分則證實(shí)造模成功。后再按各組的處理方法處理大鼠,在12 h和24 h兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)處死大鼠。

1.6 檢測(cè)方法

1.6.1 神經(jīng)功能評(píng)分 大鼠清醒后用Zea-Longa 5級(jí)評(píng)分法對(duì)大鼠神經(jīng)功能進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分[7]。其中評(píng)分為1～3分且無蛛網(wǎng)膜下腔出血的大鼠進(jìn)入實(shí)驗(yàn),評(píng)分為0分和4分的大鼠剔除。評(píng)分越高,說明大鼠神經(jīng)功能障礙越嚴(yán)重。

1.6.2 免疫組織化學(xué)染色 腦組織脫水和包埋,石蠟切片切成4 μm并在60 ℃烘烤2 h,將切片用二甲苯Ⅰ和Ⅱ以及梯度酒精進(jìn)行脫蠟和脫水,高壓修復(fù),PBS沖洗3 min×3次,3%過氧化氫孵育10 min,PBS沖洗3 min×3次,用一抗FLVCR(1∶200)和BCRP(1∶200)37 ℃孵育60 min,PBS沖洗3 min×3次,二抗山羊抗小鼠/兔IgG室溫孵育30 min,PBS沖洗3 min×3次。用DAB顯色,蘇木素復(fù)染,梯度酒精脫水,二甲苯透化,中性膠封片。光學(xué)顯微鏡觀測(cè),每個(gè)切片隨機(jī)選擇6個(gè)視野。陽性細(xì)胞漿或細(xì)胞核著色呈棕黃色,采用 Image J軟件檢測(cè)圖片的陽性細(xì)胞面積,算出AOD值[8]。

1.6.3 qRT-PCR檢測(cè) 使用TRIzolTM試劑從腦組織中提取總RNA,mRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA合成cDNA。使用擴(kuò)增試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增。以GAPDH為內(nèi)參,以2-ΔΔCT法計(jì)算計(jì)算FLVCR和BCRP的相對(duì)mRNA表達(dá)水平[9]。引物序列,見表1。

表1 qRT-PCR中的引物序列Table 1 Primer sequence in qRT-PCR

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分比較 與SO組相比,MCAO/R組大鼠評(píng)分明顯升高(P<0.01);與Mimic對(duì)照組相比,Mimic組評(píng)分明顯降低(P<0.01);與Inhibitor對(duì)照組比較,Ihnibitor組評(píng)分明顯升高(P<0.05)。見圖1。

2.2 各組大鼠腦組織miR-137、FLVCR、BCRP mRNA表達(dá)變化的比較 與SO組相比,MCAO/R組miR-137表達(dá)水平明顯降低(P<0.05);與Mimic對(duì)照組相比,Mimic組miR-137表達(dá)水平明顯升高(P<0.01),且以24 h升高更明顯(P<0.05);與Inhibitor對(duì)照組同期比較,Inhibitor組miR-137表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)。 與SO組各時(shí)間點(diǎn)比較,MCAO/R組FLVCR和BCRPmRNA表達(dá)降低(P<0.05);與Mimic對(duì)照組比較,Mimic組二者表達(dá)明顯升高(P<0.01),BCRP mRNA在24 h升高最明顯(P<0.05);與Inhibitor對(duì)照組比較,Inhibitor組二者降低(P<0.05),FLVCR mRNA在24 h降低更明顯(P<0.05)。見表2、表3。

表2 大鼠miR-137的表達(dá)量比較Table 2 Comparison of miR-137 expression in rats

表3 大鼠FLVCR、BCRPmRNA表達(dá)的比較Table 3 Comparison of FLVCR and BCRP mRNA expression in rats

2.3 各組大鼠腦組織FLVCR和BCRP蛋白表達(dá)變化的比較 SO組可見大量的FLVCR和BCRP陽性表達(dá)。與SO組同期比較,MCAO/R組二者的表達(dá)明顯降低(P<0.01);與Mimic對(duì)照組比較,Mimic組二者的表達(dá)明顯升高(P<0.01),且以24 h升高更明顯(P<0.05);與Inhibitor對(duì)照組相比,Inhibitor組二者的表達(dá)明顯降低(P<0.05)。見表4、圖2、圖3。

圖2 12 h大鼠FLVCR、BCRP蛋白表達(dá)免疫組化圖(400×)Figure 2 Immunohistochemical diagram of FLVCR and BCRP protein expression in 12 h rats 注:A.SO組;B.MCAO/R組;C.Mimic組;D.Mimic對(duì)照組;E.Inhibitor組;F.Inhibitor對(duì)照組。

圖3 24 h大鼠FLVCR、BCRP蛋白表達(dá)免疫組化圖(400×)Figure 3 Immunohistochemical diagram of FLVCR and BCRP protein expression at 24 h in rats注:A.SO組;B.MCAO/R組;C.Mimic組;D.Mimic對(duì)照組;E.Inhibitor組;F.Inhibitor對(duì)照組。

表4 大鼠FLVCR和BCRP的AOD值比較Table 4 Comparison of AOD values of FLVCR and BCRP in rats

3 討論

鐵元素與中風(fēng)的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān),I/R可導(dǎo)致組織的進(jìn)一步損傷,這涉及鐵離子穩(wěn)態(tài)的改變導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鐵的積累以及隨之出現(xiàn)的一種新的程序性細(xì)胞壞死形式——鐵死亡[10]。在缺氧條件下血紅素的細(xì)胞濃度增加,游離血紅素的存在引起有害炎癥和氧化應(yīng)激[11]。首先,細(xì)胞內(nèi)血紅素的積累最終會(huì)導(dǎo)致鐵的積累,并通過芬頓反應(yīng)(Fenton reaction)產(chǎn)生破壞細(xì)胞的活性氧;其次,鐵和血紅素的積累也會(huì)導(dǎo)致線粒體功能障礙[12]。細(xì)胞內(nèi)血紅素水平的調(diào)節(jié)是神經(jīng)元存活的基礎(chǔ),FLVCR和BCRP作為血紅素鐵輸出蛋白,能特異性結(jié)合或轉(zhuǎn)運(yùn)血紅素來減少血紅素的積累,在缺氧狀況下能保護(hù)細(xì)胞和組織不受游離血紅素的損傷,維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài),在IS中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。本研究顯示,MCAO/R組大鼠腦組織中FLVCR和BCRP蛋白表達(dá)均明顯降低,提示I/R損傷可抑制腦組織中FLVCR和BCRP表達(dá)[13]。研究表明干細(xì)胞中的BCRP表達(dá)通過防止導(dǎo)致線粒體死亡的血紅素積累來保護(hù)造血干細(xì)胞免受缺氧環(huán)境的影響,提高細(xì)胞存活能力。抑制人紅細(xì)胞系中的FLVCR功能會(huì)減少血紅素輸出,損害紅細(xì)胞成熟,并導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

miRNA可介導(dǎo)腦缺血再灌注損傷的發(fā)生發(fā)展[14-15]。其中miR-137可以保護(hù)神經(jīng)元免受OGD/R誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷[16]。星形膠質(zhì)細(xì)胞中miR-137的水平從缺氧和缺糖環(huán)境到正常環(huán)境也會(huì)增加[15]。miR-137作為腦血管疾病預(yù)測(cè)的新型生物標(biāo)志物[17],本研究結(jié)果顯示,MCAO/R處理的大鼠腦組織中miR-137水平顯著降低,表明miR-137參與了大鼠腦I/R過程,和之前的研究結(jié)果基本一致。Zhang等[18]發(fā)現(xiàn)miR-137過表達(dá)可減輕腦缺血大鼠腦組織損傷程度,減少氧-葡萄糖剝奪再灌注誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷,有效改善局灶性腦缺血后的損傷。Liu等[19]發(fā)現(xiàn)miR-137可增強(qiáng)腦缺血性卒中小鼠內(nèi)皮祖細(xì)胞的增殖和血管生成。miR-137還可能通過抑制炎癥標(biāo)志物的釋放來減少腦梗死體積,改善MCAO大鼠的認(rèn)知功能[20]。本研究中通過表達(dá)miR-137改善了MCAO/R誘導(dǎo)的 miR-137 水平的降低,改善了MCAO/R處理的大鼠神經(jīng)功能缺損,升高FLVCR/BCRP的表達(dá)。提示miR-137能增加內(nèi)源性FLVCR和BCRP水平,改善MCAO/R大鼠神經(jīng)功能損傷。miR-137抑制劑使 大鼠腦組織中miR-137、FLVCR和BCRP 表達(dá)明顯低于模型組,提示抑制miR-137能進(jìn)一步抑制 FLVCR和BCRP的合成與表達(dá),從而加重神經(jīng)功能缺損情況。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果提示,miR-137可能是診斷IS和預(yù)測(cè)腦血管不良事件發(fā)生的潛在臨床工具。miR-137可能通過促進(jìn)血紅素鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白FLVCR和BCRP水平,從而阻止腦組織鐵和血紅素的積累,達(dá)到保護(hù)神經(jīng)元的目的。