分散固相萃取-UPLC-MS/MS法測定水蛭中10 種磺胺類藥物殘留

王小喬，許曉輝*，張虹艷，馮 翀, ，孫玉婧，吳福祥，潘秀麗，李 赟

（1. 蘭州市食品藥品檢驗(yàn)檢測研究院/國家市場監(jiān)管重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（食品中農(nóng)藥獸藥殘留監(jiān)控），甘肅 蘭州 730050；2. 蘭州理工大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730050；3. 蘭州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070）

中藥材水蛭是由水蛭科動(dòng)物螞蟥、水蛭或柳葉螞蟥經(jīng)炮制而得的干燥品，具有破血、逐瘀、通經(jīng)的功效，臨床廣泛用于治療徽瘕、痞塊、血瘀閉經(jīng)、跌打損傷等癥[1-2]。隨著水蛭的需求量增加，傳統(tǒng)野生水蛭供應(yīng)已不能滿足市場需求。為了保護(hù)野生資源、化解供需矛盾，人工養(yǎng)殖逐漸成為水蛭的主要來源[3-5]?；前奉愃幬镉锌咕咝?、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、使用方便和價(jià)格便宜等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)。目前，由于在水蛭養(yǎng)殖過程中有不規(guī)范或超量使用抗生素類獸藥的情況，導(dǎo)致獸藥在水蛭體內(nèi)不能完全代謝；且磺胺類藥物在人體內(nèi)蓄積后會(huì)產(chǎn)生細(xì)菌耐藥性，且有潛在的致癌性，不利于人體健康[6-8]。我國食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)《GB 31650-2019 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中獸藥最大殘留限量》對動(dòng)物源性食品中磺胺總量作了明確規(guī)定，動(dòng)物源性食品中磺胺類藥物的最高殘留限量（MRL） 為 0.1 mg/kg[9]。當(dāng)前，水蛭中磺胺類藥物殘留的檢測方法未見報(bào)道，因此，建立一種高效、便捷、準(zhǔn)確檢測水蛭中磺胺類藥物殘留的方法具有重要的研究意義。

目前，關(guān)于磺胺類藥物殘留的檢測技術(shù)方法主要包括酶聯(lián)免疫法、高效液相色譜法、超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS）等[10-16]。前兩種方法檢出限高，對復(fù)雜樣品的檢測靈敏度不高，難以適用基質(zhì)復(fù)雜的樣品；而UPLC-MS/MS能解決這一短板，適用于復(fù)雜組分中痕量藥物殘留測定。本研究采用分散固相萃取方法進(jìn)行前處理，以不同配比的3種凈化填料（PSA，C18，MgSO4）為組合進(jìn)行凈化效果對比試驗(yàn)，優(yōu)化提取凈化條件，建立了一種UPLC-MS/MS測定水蛭中磺胺類藥物殘留的方法，能滿足水蛭中磺胺類藥物殘留的快速檢測需求。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

1290超高效液相色譜-6460C三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀：配有電噴霧離子源（美國安捷倫）；電子天平（梅特勒-托利多）；移液器：20 μl，100 μl，1.0 ml（德國艾本德）；渦旋混勻器（美國Scientific Industries）；5810R離心機(jī)（德國艾本德）；SBL-10DT超聲波清洗器（寧波新芝）；IQ 7000 超純水機(jī)（美國默克密理博）。

1.2 材料

甲醇、乙腈、乙酸乙酯（色譜純，德國默克集團(tuán)）；甲酸、乙酸銨（色譜純，東京化成工業(yè)）；硫酸鈉、氯化鈉（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司）；PSA，C18（月旭科技）；MgSO4（分析純，天津百世）。

對照品：磺胺二甲嘧啶（批號(hào)：100411-200501，純度：100 %，中國食品藥品檢定研究院）；磺胺間二甲氧嘧啶（批號(hào)：G122608，純度：99.5 %）、磺胺鄰二甲氧嘧啶（批號(hào)：G151421，純度：99.1 %）（Dr. Ehrenstorfer GmbH）；磺胺嘧啶（批號(hào)：100026-201404，純度：99.7 %，中國食品藥品檢定研究院）；磺胺間甲氧嘧啶（批號(hào)：97864，純度：99.1 %，曼哈格公司）；磺胺喹噁啉（批號(hào)：G992252，純度：96.3 %）、磺胺甲噁唑（批號(hào)：G150000，純度：99.5 %）、磺胺甲基嘧啶（批號(hào)：G982705，純度：99.1 %）、、磺胺二甲異噁唑（批號(hào)：W1004574，純度：99.53 %）、磺胺噻唑（批號(hào)：G980077，純度：99.2 %）（Dr. Ehrenstorfer GmbH）；實(shí)際檢測樣品購于市場。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：ACQUITY BEH C18柱（1.7 μm，2.1 mm×100 mm）；流動(dòng)相A：含0.1 %甲酸-2 mmol/L乙酸銨-水，流動(dòng)相B：含0.1 %甲酸-乙腈；梯度洗脫程序：0～2.0 min，15 %～30 %B；2.0～3.0 min，30 %～40 %B；3.0～4.5 min，40 %～90 %B；4.5～6.5 min，90 %B；6.5～7.0 min，90 %～15 %B；7.0～8.0 min，15 %B；流速：0.3 ml/min；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣體積：2 μl。

2.2 質(zhì)譜條件

離子源：噴射流電噴霧離子源（AJS ESI）；離子極性：正離子；干燥氣流速：6 L/min；霧化器壓力：45 psi；離子源溫度：325 ℃；毛細(xì)管電壓：4000 V；鞘氣流速：10 L/min；鞘氣溫度：350 ℃；監(jiān)測模式：多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）；優(yōu)化后的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 10 種磺胺類藥物的質(zhì)譜參數(shù)

2.3 溶液制備

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液制備 分別精密稱取各磺胺類藥物對照品適量，用乙腈配制成濃度約為 1 mg/ml的單標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，置 4 ℃冰箱冷藏備用；取各單標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液適量，用乙腈配制成濃度約為 1 μg/ml的混合標(biāo)準(zhǔn)使用液，置 4 ℃冰箱冷藏備用；取混合標(biāo)準(zhǔn)使用液適量，用乙腈配制成濃度分別為0.05，2，5，10，20，30，40，50 ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液。

2.3.2 供試品溶液制備 精確稱取1 g粉碎水蛭樣品置入50 ml離心管，加入3 ml Mcllvaine-Na2EDTA緩沖液，渦旋搖勻，使樣品充分潤濕復(fù)原，加入均質(zhì)子，渦旋1 min，精密加入10.00 ml乙腈，渦旋1 min，在800 W功率下超聲提取5 min ，加入1 g氯化鈉和4 g硫酸鈉，充分渦旋2 min，于4 ℃以3900 r/min離心10 min，取上清待凈化。

取待凈化液2 ml置入預(yù)先裝有100 mgPSA、150 mg C18、900 mg MgSO4的離心管，渦旋1 min，于4 ℃以3900 r/min離心10 min，上清過0.22 μm濾膜，供液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。

2.4 線性關(guān)系、檢出限及定量限

取混合標(biāo)準(zhǔn)使用液適量，配制成不同質(zhì)量濃度的系列標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液，在優(yōu)化的儀器條件下測定，以各待測物質(zhì)譜響應(yīng)值為縱坐標(biāo)（y），對應(yīng)濃度為橫坐標(biāo)（x），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（見表2）。由表2可見，10 種磺胺類藥物在0.05～50 ng/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，R2均大于0.99。以基質(zhì)標(biāo)的3 倍和 10 倍信噪比時(shí)的檢測濃度為方法的檢出限和定量限，檢出限為0.19～1.16 μg/kg，定量限為0.56～3.95 μg/kg。

表2 10種磺胺類藥物的線性關(guān)系、檢出限及定量限

2.5 回收率與精密度

選用水蛭空白樣品作為基質(zhì)進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，添加50，100，200 μg/kg 3個(gè)濃度水平的混合標(biāo)準(zhǔn)使用液，按照2.3.2項(xiàng)下方法與步驟處理加標(biāo)樣品，上機(jī)測定，每個(gè)添加水平重復(fù)6次實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表3。由表 3可見，10 種磺胺類藥物的平均回收率在65.2 %～98.0 %之間，日內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.9 %～8.3 %，日間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為3.5 %～9.2 %，表明此法的準(zhǔn)確度和精密度滿足定性定量檢測要求。

表3 10 種磺胺類藥物的回收率與精密度

2.6 耐用性

在質(zhì)譜條件不變情況下，分別測定用空白基質(zhì)溶液與乙腈稀釋配制的同濃度混合標(biāo)準(zhǔn)使用液，在流速、柱溫、進(jìn)樣量等參數(shù)產(chǎn)生微小變動(dòng)時(shí)，考察提取色譜圖、總離子流圖及質(zhì)譜響應(yīng)的變化。結(jié)果表明，這些參數(shù)發(fā)生微小變動(dòng)對檢測結(jié)果的影響很小，表明此法有良好的耐用性。

2.7 磺胺類藥物殘留穩(wěn)定性

藥物在基質(zhì)殘留的穩(wěn)定性受樣品儲(chǔ)存條件的影響，磺胺類藥物本身化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，在畜禽及水產(chǎn)品中的穩(wěn)定性已被研究證實(shí)。如2011年中國合格評定國家認(rèn)可委員會(huì)組織了畜禽肉中磺胺類藥物殘留的穩(wěn)定性試驗(yàn)的能力驗(yàn)證工作，結(jié)果表明，磺胺類藥物在該類基質(zhì)中化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定[17]。有文獻(xiàn)采用水產(chǎn)品基質(zhì)加標(biāo)的方法[18-19]，考察磺胺類藥物殘留在常溫、反復(fù)凍融和低溫保藏等條件下的穩(wěn)定性，結(jié)果表明，磺胺類藥物殘留在水產(chǎn)品中的穩(wěn)定性較強(qiáng)，同理，樣品水蛭中磺胺類藥物殘留也比較穩(wěn)定。

2.8 樣品測定

采用建立的方法對市售10批次水蛭中10種磺胺類藥物進(jìn)行測定，均未檢出上述10 種磺胺類藥物。

3 討論與結(jié)論

3.1 色譜質(zhì)譜條件優(yōu)化

3.1.1 色譜條件優(yōu)化 因磺胺類藥物有一定酸性，易溶于甲醇、乙腈等有機(jī)溶劑，因此，選擇了常用的反相 C18色譜柱進(jìn)行分離。進(jìn)一步考察不同流動(dòng)相體系的分離效果和響應(yīng)，在流動(dòng)相的選擇上，為了提高目標(biāo)化合物的離子化效率，對比了含不同濃度配比的甲酸和乙酸銨的水溶液，及含不同濃度甲酸的乙腈、甲醇對分離效果和質(zhì)譜響應(yīng)的影響。結(jié)果表明，有機(jī)相為0.1 %甲酸-乙腈，水相為0.1 %甲酸-2 mmol/L乙酸銨-水，各個(gè)被測藥物峰形和分離效果最佳，化合物的質(zhì)譜響應(yīng)值增強(qiáng)，因此，最終選擇0.1 %甲酸-2 mmol/L乙酸銨-水與含0.1 %甲酸-乙腈作為流動(dòng)相。

3.1.2 質(zhì)譜條件優(yōu)化 通過對各藥物對照品溶液單標(biāo)進(jìn)樣，電噴霧正離子掃描模式下，優(yōu)化各個(gè)藥物的母離子、子離子、碎裂電壓、碰撞能量等質(zhì)譜參數(shù)，并選擇干擾小且響應(yīng)值高的離子對作為定性離子和定量離子，建立多反應(yīng)監(jiān)測方法。

3.2 提取溶劑的選擇

比較乙腈、甲醇、乙酸乙酯3種常用提取溶劑的提取效率，結(jié)果表明，當(dāng)甲醇為提取溶劑時(shí)，回收率為43 %～76 %，且大多數(shù)測定藥物的回收率小于70 %；當(dāng)用乙酸乙酯提取時(shí)，回收率為49 %～79 %，且磺胺喹噁啉和磺胺甲噁唑的回收率均小于50 %；當(dāng)乙腈為提取溶劑時(shí)，目標(biāo)物的提取效果最好，回收率提高至79 %～87 %，原因可能是乙腈能很好地使樣品中蛋白質(zhì)變性，并在萃取鹽包及低溫高速離心的作用下，促使提取液的水相和有機(jī)相分層，進(jìn)而通過離心去除蛋白脂肪等雜質(zhì)，降低分析液中基質(zhì)干擾物的含量。因此最終選擇乙腈為提取溶劑（見圖1）。

圖1 不同提取溶劑的提取效率

3.3 凈化方法的確定

設(shè)計(jì)9組不同配比的凈化劑組合（見表4），并考察了不同凈化劑組合的凈化效果，結(jié)果見圖2。用PSA 100 mg、C18150 mg、MgSO4900 mg組合凈化時(shí)，對目標(biāo)檢測物凈化效果較好，10 種磺胺類藥物的回收率分布在80 %～100 %之間。其中，磺胺嘧啶和磺胺二甲嘧啶回收率接近100 %，最終選擇PSA 100 mg、C18150 mg、MgSO4900 mg組合作為凈化劑。

圖2 不同組合凈化劑提取回收率的對比

表4 不同組合的凈化劑

3.4 基質(zhì)效應(yīng)

水蛭作為基質(zhì)較復(fù)雜的樣品，進(jìn)行質(zhì)譜分析時(shí)基質(zhì)殘留對目標(biāo)物的離子化會(huì)產(chǎn)生影響，因此考察基質(zhì)對目標(biāo)物檢測的影響。用空白基質(zhì)溶液與乙腈分別配制同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，以兩者質(zhì)譜響應(yīng)值比值的百分?jǐn)?shù)評價(jià)基質(zhì)效應(yīng)（ME），若ME大于100 %，則有基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，相反，則為抑制效應(yīng)；若ME接近100 %，則不存在基質(zhì)效應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)測試了10 ng/ml和20 ng/ml兩個(gè)濃度水平，結(jié)果表明，20 ng/ml時(shí)，除磺胺二甲嘧啶有基質(zhì)效應(yīng)增強(qiáng)效應(yīng)外，其余目標(biāo)待測物均有不同程度弱的基質(zhì)抑制效應(yīng)，其ME大于75 %。10 ng/ml時(shí)，磺胺二甲嘧啶和磺胺嘧啶ME接近100 %，無基質(zhì)效應(yīng)；磺胺間甲氧嘧啶、磺胺喹噁啉、磺胺甲噁唑、磺胺二甲異噁唑ME在70 %～80 % ，表明有中等基質(zhì)抑制效應(yīng)，其余目標(biāo)待測物ME為80 %～89 %，有弱的基質(zhì)抑制效應(yīng)。雖然各待測物有不同程度弱或中等基質(zhì)效應(yīng)，但均在可接受的范圍內(nèi)，對檢測結(jié)果不產(chǎn)生影響（見圖3）。

圖3 10種磺胺類藥物的基質(zhì)效應(yīng)

3.5 結(jié)論

綜上，本研究首次建立了一種基于分散固相萃取凈化的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定水蛭中10種磺胺類藥物殘留的分析方法。該分析方法以緩沖鹽溶液復(fù)原干燥樣品，以乙腈為提取溶劑變性沉淀樣品中蛋白質(zhì)，通過加入鹽包，使提取液中的水相和有機(jī)相在飽和鹽存在下實(shí)現(xiàn)分層，通過離心去除蛋白質(zhì)。以分散固相萃取為凈化手段，選擇100 mg PSA、150 mg C18、900 mg MgSO4組合為凈化劑，對提取液進(jìn)行進(jìn)一步凈化。對建立的方法進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，其各項(xiàng)參數(shù)均滿足準(zhǔn)確定量檢測的要求。本研究建立的方法操作簡便、準(zhǔn)確性良好，可為中藥材水蛭中磺胺類藥物殘留的快速檢測提供技術(shù)支撐。