設(shè)施番茄灰霉病病原菌的分離與鑒定

高 婧 ，劉 燕 ，楊永青 ，狄潔增 ，王 永 ，康立茹 ，2，肖 猛

（1.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010031；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018；3.阜新蒙古族自治縣住房和城鄉(xiāng)建設(shè)服務(wù)中心園林綠化服務(wù)部，遼寧阜新 123100）

我國關(guān)于番茄的病害有40余種，常見的有番茄灰霉病、番茄早疫病、番茄晚疫病、番茄病毒病、番茄葉霉病、番茄潰瘍病等，其中番茄灰霉病自20世紀(jì)80年代起在我國開始蔓延，對設(shè)施番茄的生產(chǎn)也造成了極大威脅[4]。番茄灰霉病是由灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）引起的一種半腐生型病害，其病原菌寄主廣泛，可侵染蔬菜、水果、花卉等多種植物，易造成嚴(yán)重的產(chǎn)量損失[5]。該病害在溫度低濕度大條件下易發(fā)病，苗期和成株期均可發(fā)病，主要為害花器、果實、葉片和莖稈，但以成株期青果受害最重。發(fā)病時造成落花、果實腐爛，嚴(yán)重時莖稈整段腐爛導(dǎo)致整株枯死。一般減產(chǎn)20%～30%，嚴(yán)重地塊減產(chǎn)可達(dá)60%以上[6]。番茄灰霉病發(fā)病后傳播速度快，尤其設(shè)施番茄棚室較小，濕度較高[7]，且重茬種植較為普遍，造成病原菌的大量積累，冬春季節(jié)溫度低、通風(fēng)不足，使得番茄灰霉病極易發(fā)生，對設(shè)施番茄的生產(chǎn)造成了極大威脅[8]。

近年來，隨著番茄連年種植以及種植面積的不斷擴大，番茄灰霉病在種植區(qū)的發(fā)病面積也不斷增加，且危害日益嚴(yán)重，已成為番茄設(shè)施栽培的主要限制因素[4]。本試驗采集了內(nèi)蒙古呼和浩特市周邊地區(qū)設(shè)施番茄灰霉病的病樣，分離獲得病原菌并進(jìn)行鑒定，旨在明確當(dāng)?shù)胤鸦颐共〔≡姆N類，為進(jìn)一步研究設(shè)施番茄灰霉病的發(fā)生規(guī)律和綜合防治奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料

供試樣本采自內(nèi)蒙古自治區(qū)呼和浩特市根堡村基地、內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院試驗地、烏蘭察布市冷涼蔬菜院士工作站試驗地。

供試番茄品種：普羅旺斯。

1.1.2 供試培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potato dextrose agar，PDA）：去皮馬鈴薯200 g煮汁，濾出汁液中加入葡萄糖 20 g，瓊脂 15～20 g，蒸餾水定容到 1 L；121 ℃高溫滅菌30 min。

2018年8月3日，遼寧省沈陽市沈北新區(qū)發(fā)生一例非洲豬瘟疫情，經(jīng)過中國衛(wèi)生與流行病學(xué)中心確認(rèn)，該疫情為我國首次發(fā)生的非洲豬瘟疫情。疫情發(fā)生后，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部根據(jù)《非洲豬瘟疫情應(yīng)急預(yù)案》啟動了二級應(yīng)急響應(yīng)，采取了封鎖、撲殺、無害化處理以及消毒等措施，禁止所有生豬、易感動物和產(chǎn)品運入或流出封鎖區(qū)，同時沈陽市全面禁止生豬向外調(diào)運。在各部門配合下，此次疫情得到很好的控制，沒有發(fā)生大面積的傳播感染。但是因為非洲豬瘟一直以來都被我國列為一類動物疫病，是重點防控的外來病，近年一直在俄羅斯和東歐國家傳播，我國有必要對該動物疫病進(jìn)行研究。

水瓊脂培養(yǎng)基（water agar，WA）：1 L蒸餾水中加入瓊脂粉15～20 g，121℃高溫滅菌30 min，滅菌結(jié)束后迅速搖勻，備用。

1.1.3 供試試劑

D2000 DNA Marker（BM101-01，北京全式金生物技術(shù)有限公司）、100 bp DNA Ladder（BM301-01，北京全式金生物技術(shù)有限公司）、卡那霉素（K1377，Sigma-Aldrich），聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）引物由北京厚生博泰科技有限公司合成。

1.2 試驗方法

1.2.1 病原菌的分離與純化

用常規(guī)組織分離法分離病原菌。采集發(fā)病初期莖稈，流水沖洗表面，取病樣病健交界組織，切成0.3 cm×0.3 cm大小的薄片，75%酒精處理3～5 s，無菌水沖洗3遍，晾干置于WA培養(yǎng)基上于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。采集發(fā)病較輕且有霉層的果實，用接種針挑取少量霉層或刺入病斑處，在含50 mg/mL卡那霉素的WA培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線，25℃培養(yǎng)恒溫培養(yǎng)1～2 d，待長出菌絲后，將邊緣菌絲轉(zhuǎn)接到PDA培養(yǎng)基上。繼續(xù)培養(yǎng)3 d后進(jìn)行單孢分離，挑取少量菌絲放入裝有無菌水的離心管中，振蕩搖勻后將原液按10的倍數(shù)稀釋3個梯度。每個梯度取50 μL液體涂布于WA培養(yǎng)基上，挑取單菌落到PDA培養(yǎng)基上，繼續(xù)培養(yǎng)，將純化好的菌株保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 病原菌的形態(tài)學(xué)鑒定

活化保存菌株，在PDA培養(yǎng)基上觀察病原菌菌落的形狀、大小、顏色，菌絲生長形態(tài)、致密度、菌核等的特征。然后在顯微鏡（BX51，奧林巴斯，日本）下觀察病原菌的菌絲、分生孢子和分生孢子梗等形態(tài)特征。鏡下觀察時，載玻片上滴無菌水，再用接種針挑取菌落邊緣少量菌絲置于水中，蓋上蓋玻片，濾紙沿邊緣吸去多余水分，制成臨時玻片，觀察并拍照記錄。

1.2.3 病原菌的生長特性測定

菌株生長速度和產(chǎn)孢量的測定：挑選2株菌落形態(tài)有明顯差異的病原菌活化，用5 mm打孔器在菌餅取樣，接種于90 mm平皿中央（每個平皿含PDA培養(yǎng)基20 mL），每株菌接種3皿，25℃恒溫培養(yǎng)，用十字交叉法測量培養(yǎng)7 d的菌落直徑。測量完畢后的平皿中加入10 mL無菌水獲得分生孢子液，用血球計數(shù)板計算分生孢子數(shù)量。每組試驗重復(fù)3次。

1.2.4 病原菌的致病力測定

用72孔穴盤培育番茄育苗，幼苗移栽56 d后，挑選粗細(xì)均勻的健康莖稈作為接種材料，表面消毒后用滅菌牙簽刺出傷口，取培養(yǎng)7 d的病原菌菌餅（直徑5 mm），菌絲面朝里貼在傷口上，以不接菌的PDA培養(yǎng)基作為空白對照，用保鮮膜包裹傷口防止菌餅掉落，置于塑料盒中25℃保濕培養(yǎng)。待第5盤坐果時，挑選2～3盤直徑約8 cm青果作為接種材料，果面消毒后，用滅菌牙簽刺出傷口，接菌方法同莖稈接菌。待出現(xiàn)水浸狀病斑時，采集樣本進(jìn)行病原菌的再分離，分離方法同1.2.1。

1.2.5 病原菌的分子鑒定

采用真菌DNA提取試劑盒（18812ES50，翌圣生物科技股份有限公司）提取病原菌基因組DNA。將純化后的菌株接種到PDA培養(yǎng)基上，25℃恒溫培養(yǎng)7 d后收集菌絲，按照真菌DNA提取試劑盒的說明書提取菌株基因組DNA，ddH2O溶解后于-20℃保存?zhèn)溆?。利用真菌?nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）通用引物（ITS1/ITS4）對菌株基因組DNA進(jìn)行PCR擴增[9]和測序，引物合成和擴增產(chǎn)物測序均由北京厚生博泰科技有限公司完成。

PCR 反 應(yīng) 體 系 （50 μL）：2 ×EasyTaq PCR SuperMix（AS111，翌圣生物科技股份有限公司）25 μL、引物對 ITS1/ITS4（5 μmol/L）各 2 μL、DNA模板（100 ng/μL）2 μL、ddH2O 1 μL。PCR 反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性45 s，55℃退火40 s，72℃延伸40 s，35個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。取5 μL PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，剩余產(chǎn)物送往北京厚生博泰科技有限公司測序。

將測序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）上進(jìn)行比對，根據(jù)比對結(jié)果從GenBank數(shù)據(jù)庫中下載同源性較高的序列，與自測序列進(jìn)行比對和修飾，以核盤菌屬（Sclerotinia sclertiorum）作為外群，應(yīng)用DNAMAN軟件中Maximum likelihood算法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 田間癥狀

北方日光溫室番茄越冬茬和早春茬容易發(fā)生番茄灰霉病，一般從12月到翌年3月是發(fā)病高峰期。番茄灰霉病發(fā)生在全生長期，中后期較嚴(yán)重，可同時為害葉片、莖稈、花、果實（圖1）。葉片先從葉緣尖端開始發(fā)病，病斑呈典型“V”字形，并向內(nèi)輪紋狀擴展延伸，濕度大時病斑處會長出絲狀霉層?；ㄆ谑乔秩靖叻迤?，病原菌侵染后殘留在花瓣或柱頭上，繼而侵染果柄、綠果、果面，造成落花、落果。青果染病后，果面呈灰白色，軟腐，病斑近圓形，果實病部長出大量灰色霉層，后期在霉層上還會長出黑色不規(guī)則顆粒狀的菌核。莖部侵染時，先呈現(xiàn)水浸狀小病斑，逐漸發(fā)展為長橢圓形，濕度大時出現(xiàn)灰色霉層。嚴(yán)重時病部莖稈干枯，病部以上失水、枯死。

圖1 番茄灰霉病田間癥狀Figure 1 The symptoms of tomato gray mold in fields

2.2 病原菌的分離與純化

病樣果實和莖稈采自內(nèi)蒙古自治區(qū)呼和浩特市根堡村基地、內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院試驗地、烏蘭察布市冷涼蔬菜院士工作站試驗地的越冬茬設(shè)施番茄種植棚。利用常規(guī)組織分離法對病樣進(jìn)行病原菌分離，在果實上分離到4株菌，編號為G1～G4，莖稈上分離到3株菌，編號為JW1～JW3。單孢分離后獲得純培養(yǎng)，置于4℃保存待用。

2.3 病原菌的形態(tài)學(xué)鑒定

通過觀察菌株的菌落形態(tài)和顯微鏡下形態(tài)學(xué)的觀察對分離物進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。所有供試菌株的菌落近圓形，邊緣整齊，菌絲呈放射狀（圖2A和圖2E）。以菌株G4和JW1為例，菌絲初為灰白色絲絨狀，后期顏色加深，培養(yǎng)10 d時，菌株G4的菌絲開始成團(tuán)隆起，逐漸有黑色素產(chǎn)生，到培養(yǎng)15 d時，形成大量黑色菌核（圖2B）；菌株JW1在培養(yǎng)12 d時才有少數(shù)菌絲團(tuán)隆起，到培養(yǎng)15 d時，僅在培養(yǎng)皿邊緣有黑色素產(chǎn)生（圖2F）。經(jīng)顯微鏡觀察，菌株G4和JW1分生孢子形態(tài)相似，均為無色、單孢、橢圓形或卵圓形（圖2D和圖2H），分生孢子梗叢生，灰色，有隔膜，頂端分支（圖2C和圖2G）。根據(jù)形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果，確定所有分離菌株均為半知菌亞門，葡萄孢屬（Botrytis spp.）真菌。

圖2 病原菌的形態(tài)學(xué)鑒定Figure 2 Morphology identification of the pathogens

2.4 病原菌的生長特性測定

根據(jù)形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果，選取菌落形態(tài)差異明顯的菌株G4和菌株JW1分別測定生長速度和產(chǎn)孢量，由圖3可知，在PDA培養(yǎng)基上菌株JW1的生長速度明顯快于菌株G4，到培養(yǎng)7 d時，菌株JW1幾乎長滿整個培養(yǎng)皿，菌落直徑為84.24 mm，而菌株G4的菌落直徑為76.14 mm，二者存在顯著差異（P<0.05）。用血球計數(shù)板測定2個菌株分生孢子的數(shù)量，菌株JW1的產(chǎn)孢量為3.05×107個/mL，菌株G4的產(chǎn)孢量為3.47×107個/mL，2株菌的產(chǎn)孢量沒有顯著性差異（P＞0.05）。

圖3 病原菌的生長速度和產(chǎn)孢量Figure 3 The growth speed and conidia amount of the pathogens

2.5 病原菌的致病性測定

選取菌株G4和菌株JW1，根據(jù)科赫氏法則對番茄品種“普羅旺斯”的莖稈和果實進(jìn)行接種（圖4）。接種3 d后，離體莖稈和果實上均出現(xiàn)病斑，病斑早期呈現(xiàn)水浸狀，逐漸向外擴展，中心軟腐狀，后期莖稈和果實的病斑邊緣處均產(chǎn)生灰色菌絲。對發(fā)病莖稈和果實進(jìn)行病菌再分離，得到了相同的病原物，表明分離獲得的灰葡萄孢菌是引起番茄灰霉病的病原菌。

圖4 菌株G4和JW1接種番茄莖稈和果實后的癥狀Figure 4 The symptoms of tomato stems and fruits after inoculation with G4 and JW1 strains

2.6 病原菌的分子生物學(xué)鑒定

利用真菌通用引物ITS1/ITS4對分離菌株ITS序列進(jìn)行PCR擴增，所有分離菌株均擴增出序列大小約為530 bp的條帶，將ITS測序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行BLAST比對分析（圖5）。結(jié)果表明，所有分離得到的病原菌與灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）序列的同源性均在99%以上（表1）。從GenBank數(shù)據(jù)庫中下載已報道的B.cinerea序列（序列登錄號為KP151610），以核盤菌（Sclerotinia sclerotiorum，序列登錄號為KM272352）作為外群，利用DNAMAN軟件構(gòu)建基于ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖6），所有菌株均與B.cinerea聚為一類，證明分離菌株為灰葡萄孢菌。

表1 番茄灰霉病病原菌Table 1 The pathogens of tomato gray mold

圖5 病原菌的分子鑒定Figure 5 Molecular identification of pathogens

圖6 基于ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 6 Phylogenetic tree based on ITS sequence

3 結(jié)論與討論

番茄灰霉病是當(dāng)前番茄生產(chǎn)上重要的世界性病害，尤其以設(shè)施栽培條件下發(fā)生較重。引起番茄灰霉菌的病原菌為灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea），其寄主范圍廣，可以侵染 586屬 1 400種植物，包含多種糧食作物、經(jīng)濟(jì)作物、蔬菜和觀賞植物[10]。本試驗從呼和浩特市和烏蘭察布集寧地區(qū)設(shè)施番茄種植地區(qū)采集分離到的7株灰霉病菌株，通過形態(tài)學(xué)結(jié)合分子生物學(xué)鑒定均為灰葡萄孢菌（B.cinerea），與董友磊[11]、石曉紅等[12]和田志革等[13]的研究結(jié)果一致，他們都對當(dāng)?shù)氐脑O(shè)施番茄灰霉病進(jìn)行分離鑒定，結(jié)果都確定灰葡萄孢菌是引起番茄灰霉病的病原真菌，而LI等[14]還從加工番茄病果中分離到一株灰霉病病原菌，分子鑒定為富氏葡萄孢盤菌（Botryotinia fuckeliana），是灰葡萄孢菌的有性世代。這說明番茄灰霉病已經(jīng)逐步擴展到露地番茄，但是致病菌存在一定的差異。在分離獲得的7株菌中，菌株JW1、G4在菌落形態(tài)上差異較大，菌株JW1菌絲旺盛，很少產(chǎn)生菌核，而菌株G4菌絲放射狀明顯，培養(yǎng)至10 d左右開始產(chǎn)生大量黑色菌核。據(jù)國內(nèi)外學(xué)者的研究表明[15-18]，B.cinerea在 PDA培養(yǎng)基上的形態(tài)特征表現(xiàn)出豐富的多樣性，可分為菌絲型、孢子型和菌核型3種類型[15]，所占比例分別是 39%、28%和33%，沒有明顯的優(yōu)勢類型[19]。本試驗比較了兩種形態(tài)菌株的生長特性和致病性，產(chǎn)孢量沒有顯著差異，在人工接種莖稈和果實時發(fā)病率均為100%。

在內(nèi)蒙古地區(qū)對設(shè)施番茄灰霉病缺乏系統(tǒng)的調(diào)查和研究，本試驗在采樣過程中發(fā)現(xiàn)，番茄灰霉病在內(nèi)蒙古多個地區(qū)發(fā)生較為普遍，日光溫室越冬茬和早春茬栽培期危害嚴(yán)重，塑料大棚春夏茬也有少量發(fā)病情況，一旦有連陰天或降溫天，溫度低、濕度大，病害就會大范圍流行。因此，明確番茄灰霉病的病原菌，獲得致病菌株，可以用于防治設(shè)施番茄病害藥劑篩選、品種抗性鑒定的等進(jìn)一步研究，對掌握病害發(fā)生規(guī)律和研究病害防治措施具有重要意義。