高劑量白酒糟對山羊瘤胃發(fā)酵、菌群結(jié)構(gòu)及炎性基因的影響

張余蓬,郭靈君,羅怡茜,張芝金,李亞均,朱 瑞,張德志,2,李前勇,2,3*

(1.西南大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院,重慶 榮昌 402460;2.重慶市獸醫(yī)科學(xué)工程研究中心,重慶 榮昌 402460;3.重慶市肉牛工程技術(shù)研究中心,重慶 榮昌 402460)

白酒糟是白酒釀造后剩余的產(chǎn)物,又名丟糟。資料顯示,白酒糟中粗蛋白質(zhì)為(16.75±1.64)%,干物質(zhì)(89.40±3.18)%,粗灰分(9.91±2.04)%,粗脂肪(4.83±2.29)%,粗纖維(28.57±3.10)%,中性洗滌纖維(53.43±5.29)%,酸性洗滌纖維(45.93±3.76)%,非蛋白氮(3.68±1.41)%,淀粉(13.68±3.32)%,鈣(0.46±0.17)%,總磷(1.55±0.66)%,Fe、Cu、Mn、Zn含量也較豐富[1],是一種傳統(tǒng)的動物飼料原料。動物飼料中補(bǔ)飼一定比例的白酒糟可顯著提高干物質(zhì)的采食量、平均日增質(zhì)量、營養(yǎng)物質(zhì)的表觀消化率,進(jìn)而提高生長性能,顯著降低料重比,可達(dá)到降低飼養(yǎng)成本、提高經(jīng)濟(jì)效益的作用[2-4]。近年來,隨著豆粕、玉米等大宗飼料原料價格的不斷上漲,動物生產(chǎn)尤其是牛羊養(yǎng)殖中白酒糟的使用現(xiàn)象越來越普遍,據(jù)報(bào)道,重慶地區(qū)肉牛飼養(yǎng)中酒糟的使用率達(dá)94.41%,在育肥肉牛日采食量中酒糟添喂比例在70.00%以上的牛只可占調(diào)查牛只的13.50%～14.50%,繁殖母牛采用高劑量(占日采食量的50.00%～60.00%)酒糟添喂的牛只也達(dá)9.38%～13.73%[5],高劑量酒糟飼喂現(xiàn)象在牛羊生產(chǎn)中比較常見。

然而,白酒糟中不僅富含蛋白質(zhì)、粗纖維、粗脂肪、淀粉及部分礦物元素等營養(yǎng)物質(zhì),還含有各種醇類、醛類、酸類、霉菌毒素等有害物質(zhì),動物長期高劑量或突然大劑量飼喂,會引起牛、羊機(jī)體不適,導(dǎo)致瘤胃內(nèi)環(huán)境紊亂,瘤胃發(fā)酵功能異常,進(jìn)而影響牛、羊健康,誘發(fā)瘤胃黏膜及其下層組織的炎癥、酒糟中毒等疾病[6],目前國內(nèi)關(guān)于牛羊酒糟中毒的病例報(bào)道較常見[7-9],但國內(nèi)外對高劑量酒糟飼喂對瘤胃發(fā)酵功能及黏膜組織損傷的影響研究鮮見報(bào)道。為此,本試驗(yàn)通過飼糧中添加65.00%和75.00%白酒糟,探究高劑量白酒糟對山羊瘤胃的發(fā)酵功能、菌群結(jié)構(gòu)及瘤胃炎性基因的影響,旨在為白酒糟在牛、羊養(yǎng)殖的安全使用中提供部分理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)選用重慶榮昌本地健康雜交山羊15只(購自重慶榮昌某山羊養(yǎng)殖基地),3月齡,體質(zhì)量(14.16±1.30)kg及體況相近。試驗(yàn)采用單因素完全隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì),隨機(jī)分成3組,每組5只,對照組(LC)飼喂基礎(chǔ)飼糧,Ⅰ組替換65%飼糧白酒糟(LM),Ⅱ組替換75%飼糧白酒糟(LH),以《肉羊飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》(NY/T816-2004)為參考設(shè)計(jì)日糧中能量和蛋白水平[10],試驗(yàn)日糧組成和營養(yǎng)水平如表1所示。每只羊獨(dú)立圈舍,半漏縫式地板,自由飲水,分別于每日09:00和18:00喂食。預(yù)試期14 d,正式試驗(yàn)期90 d。期間定期進(jìn)行疫苗接種、驅(qū)蟲、環(huán)境消毒等。

1.2 樣本采集與測定

1.2.1瘤胃液采集 在試驗(yàn)第90天晨飼前利用胃導(dǎo)管采取參試山羊瘤胃液,丟棄含有大量唾液的部分,每只羊采集50 mL,將瘤胃液經(jīng)4層無菌紗布過濾后,取5 mL瘤胃液立即測量pH,其余瘤胃液于-80℃冰箱冷凍保存,以便后續(xù)試驗(yàn)。

表1 試驗(yàn)日糧組成和營養(yǎng)水平 %

1.2.2瘤胃組織采集 山羊瘤胃液采集完成之后,由經(jīng)驗(yàn)豐富的外科獸醫(yī)在山羊瘤胃腹側(cè)切除約10 g的瘤胃組織。采集的瘤胃組織經(jīng)生理鹽水和無水乙醇洗滌干凈,液氮冷凍0.5 h后儲存于-80℃冰箱中,用于RNA的提取。

1.2.3瘤胃液發(fā)酵參數(shù)測定 瘤胃液pH采用PHS-3E 酸度計(jì)測定,測定前用標(biāo)準(zhǔn)品對酸度計(jì)進(jìn)行校準(zhǔn)。瘤胃液VFA濃度由7890B-7000D GC-MS/MS氣相色譜儀與質(zhì)譜儀聯(lián)用測定,使用氦氣作為載氣,流速為1.2 mL/min。在分離模式下進(jìn)行注射,注射量為2 μL。烘箱溫度在90℃保持1 min,加熱速度為25℃/min到100℃,并且以20℃/min的速度升到150℃,保持36 s,以25℃/min的速度升至200℃,保持30 s,運(yùn)行3 min后。進(jìn)樣器入口和傳輸線溫度分別為200和230℃。瘤胃液組胺和LPS濃度參照羊LPS、組胺ELISA檢測試劑盒(上海優(yōu)選生物科技有限公司)說明書測定。

1.2.4瘤胃液16S rDNA測序 將合格的樣品用細(xì)菌通用引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACNNGGGTATCT-AAT-3′)擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA基因的V3～V4區(qū)。PCR反應(yīng)體系(25.0 μL):12.5 μL 2×Taq Plus Master Mix、3 μL BSA(2 mg/L)、1.0 μL Forward Primer(5 μmol/L)、1.0 μL Reverse Primer(5 μmol/L)、2.0 μL DNA,最后加入5.5 μL ddH2O 補(bǔ)足至25.0 μL。反應(yīng)參數(shù):95℃預(yù)變性5 min;95℃變性45 s,55℃退火50 s,72℃延伸45 s,28個循環(huán);72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增目的條帶大小,并用Agencourt AMPure XP核酸純化試劑盒純化。純化后的PCR產(chǎn)物用于構(gòu)建微生物多樣性測序文庫,在北京奧維森基因科技有限公司使用Illumina Miseq PE300高通量測序平臺進(jìn)行Paired-end測序。

1.2.5瘤胃組織炎性基因表達(dá)量測定 各瘤胃組織RNA的提取參照RNAiso Plus(TaKaRa)說明書提取。按照TaKaRa反轉(zhuǎn)錄說明書步驟,將各樣本RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。在八連管中加入10 μL TB Green Premix Ex Taq Ⅱ,1 μL PCR Forward Primer,1 μL PCR Reverse Primer,2 μL cDNA模板,1 μL dd H2O,共20 μL。qRT-PCR擴(kuò)增程序?yàn)?5℃預(yù)變性30 s,1個循環(huán);95℃變性5 s,65℃延伸30 s,40個循環(huán)。各基因引物如表2所示,內(nèi)參基因?yàn)棣?actin。

表2 基因引物序列

2 結(jié)果

2.1 高劑量白酒糟對山羊瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響如表3所示,試驗(yàn)90 d后,與對照組相比,65%白酒糟組和75%白酒糟組山羊瘤胃液pH顯著降低(P<0.05);同時隨著白酒糟飼喂量的增多,山羊瘤胃pH呈下降趨勢。與對照組比較,65%白酒糟組山羊瘤胃液乙酸和丁酸含量無顯著性變化(P>0.05),而75%白酒糟組山羊瘤胃液乙酸和丁酸含量顯著降低(P<0.05),各組間丙酸、異丁酸、異戊酸、戊酸含量均未發(fā)生顯著變化(P>0.05)。 與對照組相比,65%白酒糟組乙丙比無顯著性變化,75%白酒糟組乙丙比顯著下降(P<0.05),65%和75%白酒糟組總VFA含量顯著降低(P<0.05)。與對照組比較,65%和75%白酒糟組瘤胃液組胺和LPS濃度極顯著上升(P<0.01)。

表3 高劑量白酒糟對山羊瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響

2.2 高劑量白酒糟對山羊瘤胃微生物群落的影響

2.2.1OTU韋恩圖結(jié)果分析 如圖1所示,3組共同擁有612個OTU,LC和LH組共有196個OTU,LH和LM組共有135個OTU,LC和LM組共有83個OTU,LC組獨(dú)有300個OTU,LH組獨(dú)有97個OTU,LM組獨(dú)有83個OTU,與對照組相比,白酒糟組的OTU有所降低。

圖1 OTU韋恩圖

2.2.2Alpha多樣性分析 如圖2 A、B所示,稀釋性曲線趨于平緩,表明有合理的測序數(shù)據(jù)量,而香農(nóng)曲線趨于平緩,表明測序數(shù)據(jù)量大,足以反映樣品中的大部分微生物信息。

圖2 稀釋性曲線(A)和香農(nóng)曲線(B)

表4顯示了最低序列數(shù)最終樣本數(shù)及其Alpha指數(shù)的并列分析,Chao1、Shannon、Simpson和Observed指數(shù)在各組之間沒有顯著性差異(P>0.05),且白酒糟組Alpha指數(shù)相比對照組有所下降。各組間種群數(shù)量及結(jié)構(gòu)類似,但菌群豐度較大,菌群多樣性處于較高水平。

表4 山羊瘤胃液Alpha多樣性指數(shù)

2.2.3山羊瘤胃微生物門水平比較 本試驗(yàn)的優(yōu)勢菌門為厚壁菌門(Firmicutes)和擬桿菌門(Bac'teroidota),占瘤胃微生物門類90%以上(圖3)。其中,厚壁菌門和擬桿菌門在酒糟組和對照組中無顯著性差異(P>0.05),但厚壁菌門隨著白酒糟飼喂量的增多呈下降趨勢,擬桿菌門隨著白酒糟飼喂量的增多呈上升趨勢。

2.2.4山羊瘤胃微生物科水平比較 在科水平上的優(yōu)勢菌為普雷沃菌科(Prevotellaceae)、瘤胃菌科(Ruminococcaceae)、毛螺菌科(Lachnospiraceae)、真桿菌科(Eubacterium)(圖4)。其中,普雷沃菌科、瘤胃菌科隨著白酒糟飼喂量的增多呈上升趨勢,而毛螺菌科呈下降趨勢,但各組間的差異均不顯著(P>0.05)。

A.優(yōu)勢菌門;B.組間優(yōu)勢菌門變化

A.優(yōu)勢菌科;B.組間優(yōu)勢菌科水平變化

2.2.5山羊瘤胃微生物屬水平比較 在屬水平上的優(yōu)勢菌為普雷沃菌屬(Prevotella)、瘤胃球菌屬(Ruminococcus)(圖5),但普雷沃菌屬豐度與白酒糟飼喂量呈正比例趨勢。

2.3 高劑量白酒糟對山羊瘤胃炎性基因表達(dá)的影響結(jié)果如圖6所示,與對照組相比,65%和75%白酒糟組山羊瘤胃組織中p65/COX2/VCAM1 mRNA相對表達(dá)量極顯著升高(P<0.01)。

A.優(yōu)勢菌屬;B.組間優(yōu)勢菌屬水平變化

*.差異顯著(P<0.05);**.差異極顯著(P<0.01)

3 討論

3.1 高劑量白酒糟對山羊瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響瘤胃pH是判斷瘤胃發(fā)酵狀況及其瘤胃微生物狀態(tài)是否正常的標(biāo)志性指標(biāo)[11]。對瘤胃消化和代謝的主要影響是纖維物質(zhì)的分解和VFA的吸收[12]。紀(jì)宇等[13]添加不同比例白酒糟飼喂育肥山羊發(fā)現(xiàn),隨著白酒糟比例的增高,瘤胃pH下降,本試驗(yàn)結(jié)果與其相似,可能白酒糟中的酸性物質(zhì)較多,加之谷物在瘤胃內(nèi)二次發(fā)酵,瘤胃pH顯著降低。VFA是厭氧消化過程中一個重要的中間產(chǎn)物,瘤胃發(fā)酵產(chǎn)生乙酸、丙酸、丁酸占據(jù)總VFA的95%左右[14]。本試驗(yàn)中飼喂65%和75%白酒糟導(dǎo)致山羊瘤胃總VFA含量降低,同時,75%白酒糟組乙酸、丁酸的濃度也明顯降低。有研究發(fā)現(xiàn)[15],丁酸和乙酸可以相互轉(zhuǎn)化,從丁酸到乙酸有1個ATP生成,增加了能量供應(yīng)。曹廣等[16]研究表明,飼喂2%和5%的發(fā)酵酒糟均能使牦牛瘤胃液中的丁酸濃度顯著降低,與本試驗(yàn)結(jié)果類似。VFA是腸道中抑制病原微生物的重要因素,當(dāng)VFA濃度升高時可抑制沙門菌的生長,瘤胃中抑制病原微生物的能力還與pH有關(guān)。由此推測,較高劑量的白酒糟飼喂,可能有導(dǎo)致山羊腸道致病菌感染的風(fēng)險(xiǎn)。

組胺和LPS等致炎物質(zhì)可通過瘤胃屏障進(jìn)入血液和淋巴液中,引發(fā)全身炎癥[17]。ASCHENBACH等[18]研究發(fā)現(xiàn),瘤胃中的大量組胺可以通過瘤胃屏障進(jìn)入血液,導(dǎo)致全身組胺的增加,加速瘤胃的炎癥反應(yīng)。此外,組胺還可作炎癥誘導(dǎo)劑,參與炎性細(xì)胞因子的調(diào)控和表達(dá),進(jìn)而誘導(dǎo)炎癥的發(fā)生、發(fā)展[19-21]。本試驗(yàn)65%,75%白酒糟組山羊瘤胃液組胺含量顯著高于對照組,與SUN等[22]和CHANG等[23]研究結(jié)果類似,可能由于飼喂白酒糟會降低瘤胃液pH,造成瘤胃發(fā)酵異常,微生物結(jié)構(gòu)改變,產(chǎn)生大量脫羧細(xì)菌,進(jìn)而讓組氨酸脫羧形成組胺[24]。LPS是一種超強(qiáng)的致炎因子,一旦進(jìn)入內(nèi)循環(huán)發(fā)生紊亂,就會造成動物機(jī)體免疫系統(tǒng)混亂,巨噬細(xì)胞通過釋放大量的炎癥細(xì)胞因子來應(yīng)對身體的免疫反應(yīng)[25-26]。本試驗(yàn)65%和75%白酒糟組山羊瘤胃液LPS濃度顯著高于對照組,與MIZUGUCHI等[27]和MONTERIRO等[28]研究結(jié)果一致,可能因飼喂白酒糟會顯著降低瘤胃液pH,使許多革蘭陰性菌加速破裂、溶解,細(xì)菌壁大量釋放LPS,導(dǎo)致LPS濃度顯著升高[29]。

3.2 高劑量白酒糟對山羊瘤胃微生物群落的影響本試驗(yàn)基于山羊瘤胃微生物門水平的優(yōu)勢菌為厚壁菌門和擬桿菌門,且占瘤胃微生物門類的90%以上,與郭婷婷等[31]研究甘露寡糖對奶牛瘤胃微生物結(jié)構(gòu)的影響時的結(jié)果相符,也與索效軍等[32]利用16S rDNA擴(kuò)增子測序分析湖北黑頭羊瘤胃微生物多樣性結(jié)果一致。擬桿菌門主要功能是從碳水化合物和蛋白質(zhì)中獲取能量,含有更多的制造維生素C、B2、B5和H的菌類,本試驗(yàn)擬桿菌門隨著白酒糟飼喂的增多呈上升趨勢,提示飼喂白酒糟可使瘤胃攝取能量的能力得到適應(yīng)性增加;而厚壁菌門隨著白酒糟飼喂量的增多呈下降趨勢。有研究發(fā)現(xiàn)[33],肥胖者與苗條者相比,都出現(xiàn)了體內(nèi)的厚壁菌門減少,擬桿菌門增多的現(xiàn)象,本試驗(yàn)結(jié)果與之一致,提示飼喂白酒糟可能會增加山羊的脂肪,提升動物的生產(chǎn)性能。造成這一改變發(fā)生的原因是很寬泛的,并不是某種細(xì)菌增加或減少造成的,因?yàn)槲⑸锒鄻有栽谕粋€體內(nèi)隨時間變化不大[34]?；诳坪蛯偎降臍w類,山羊瘤胃中的普雷沃菌占絕對優(yōu)勢,都?xì)w屬于擬桿菌門,可分解非纖維素植物多糖,如木聚糖等,在利用果膠和分解蛋白質(zhì)等方面起關(guān)鍵性作用[35-36]。本試驗(yàn)中,毛螺菌科(Lachnospiraceae)隨白酒糟飼量的增加呈下降趨勢,其分類下的瘤胃球菌屬(Ruminococcus)是山羊瘤胃中的第二大菌屬,擅長消化胃腸道中的糖蛋白,含有較多的制造維生素B1和葉酸的菌類[37-38],提示了飼喂高劑量白酒糟可能會降低瘤胃的消化代謝能力。最新人類研究表明[39-40],普雷沃菌與促炎功能有關(guān),隨著普雷沃菌豐度的增加,會減少IL-18的產(chǎn)生,從而加劇腸道炎癥,并可能導(dǎo)致機(jī)體自身免疫,還可能引發(fā)慢性功能性胃腸道疾病。本試驗(yàn)中,普雷沃菌科和屬相對豐度均隨白酒糟飼喂量的增多呈上升趨勢,提示飼喂大量白酒糟可能會引發(fā)山羊胃腸道產(chǎn)生炎癥,引起病變。

3.3 高劑量白酒糟對山羊瘤胃炎性基因表達(dá)的影響p65/COX2/VCAM1是NF-κB信號通路中的細(xì)胞因子,在炎癥和免疫信號通路中發(fā)揮重要作用,p65是最常見的異源二聚體,也是作用最強(qiáng),分布最廣,活性最強(qiáng)的信號分子,被激活后可參與大量的基因表達(dá)和調(diào)控[41]。在一定程度上,可以近似地認(rèn)為p65的功能作用就是NF-κB的功能作用。p65可促進(jìn)下游多種黏附分子、炎癥因子的表達(dá)[42]。本試驗(yàn)中,65%和75%白酒糟組瘤胃液的p65 mRNA表達(dá)量顯著升高,與趙晨旭[43]研究奶牛亞急性瘤胃酸中毒結(jié)果一致,LPS和組胺可以誘發(fā)瘤胃上皮細(xì)胞炎癥,激活NF-κB炎癥通路,促進(jìn)炎性細(xì)胞因子的釋放,進(jìn)而誘發(fā)瘤胃上皮細(xì)胞的炎性反應(yīng)。

COX2的作用機(jī)制是促進(jìn)單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、血管平滑肌或內(nèi)皮細(xì)胞等細(xì)胞,從而誘發(fā)后續(xù)的炎癥反應(yīng)[44]。COX2在正常組織的細(xì)胞中的活性非常低,然而,當(dāng)細(xì)胞受到炎癥的刺激時,它在炎癥細(xì)胞中的表達(dá)量比正常水平增加10～80倍,而且在炎癥部位的PEG2、PGI2和PGE1的水平也會升高,導(dǎo)致炎癥反應(yīng)和組織損傷[45]。仇瑋等[46]研究胃癌病例患者時發(fā)現(xiàn),NF-κB、COX2和VEGF的表達(dá)量增高,可能與胃癌的血管生成有關(guān),并起促進(jìn)作用,本試驗(yàn)65%,75%白酒糟組的COX2 mRNA表達(dá)量顯著上升,可能會誘發(fā)促炎因子釋放,造成瘤胃炎癥。

VCAM1在腫瘤轉(zhuǎn)移、炎癥、寄生蟲感染和自身免疫性疾病等病變過程當(dāng)中具有不可替代的作用[47]。NF-κB可調(diào)控VCAM1基因的表達(dá)。因?yàn)镹F-κB在所有細(xì)胞中廣泛存在,故此VCAM1具備特殊性的細(xì)胞表達(dá)[48]。KHACHIGIAN等[49]證實(shí)了p65可直接地調(diào)節(jié)VCAM1基因的表達(dá)。沈開慧等[50]研究VCAM1含量與神經(jīng)損傷和炎性反應(yīng)的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)VCAM1含量的多少與患者的神經(jīng)損傷和炎癥反應(yīng)嚴(yán)重程度直接相關(guān)。本試驗(yàn)飼喂65%和75%白酒糟導(dǎo)致山羊瘤胃液VCAM1 mRNA相對表達(dá)量顯著升高,可能是p65表達(dá)上調(diào),導(dǎo)致VCAM1上調(diào),進(jìn)而可激活瘤胃組織的炎癥通路。