銀杏二萜內(nèi)酯葡胺注射液及其銀杏二萜內(nèi)酯成分抗人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞氧糖剝奪損傷的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究

徐小波，武子寅，張新莊，曹 亮，王振中，肖 偉,

銀杏二萜內(nèi)酯葡胺注射液及其銀杏二萜內(nèi)酯成分抗人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞氧糖剝奪損傷的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究

徐小波1，武子寅2, 3*，張新莊2, 3，曹 亮2, 3，王振中2, 3，肖 偉1, 2, 3*

1. 南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210023 2. 江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，江蘇 連云港 222001 3. 中藥制藥過(guò)程新技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 連云港 222001

研究銀杏二萜內(nèi)酯葡胺注射液（Diterpene Ginkgolides Meglumine Injection，DGMI）及其銀杏二萜內(nèi)酯成分抗人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells-T1，HUVEC-T1）氧糖剝奪（oxygen-glucose deprivation，OGD）損傷的潛在作用通路。采用CCK-8法分別測(cè)定不同濃度銀杏內(nèi)酯A（ginkgolide A，GA）、銀杏內(nèi)酯B（ginkgolide B，GB）、銀杏內(nèi)酯K（ginkgolide K，GK）和DGMI對(duì)HUVEC-T1細(xì)胞的毒性，明確藥物處理細(xì)胞濃度；采用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)對(duì)溶劑對(duì)照組（二甲基亞砜）、模型組（OGD/R 4 h/24 h）及給藥組（造模＋不同劑量DGMI、GA、GB、GK處理）的細(xì)胞樣本分別進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序；通過(guò)生物信息學(xué)分析方法，以GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中缺血性腦卒中患者轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為參考，采用基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）、差異基因富集等分析方法完成對(duì)HUVEC-T1 OGD模型及不同濃度藥物抗OGD損傷能力的評(píng)價(jià)，闡明DGMI及其功效成分的潛在作用機(jī)制。GSEA分析顯示，臨床缺血性腦卒中患者血液轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析獲得的疾病富集通路與本實(shí)驗(yàn)細(xì)胞模型測(cè)序結(jié)果獲得的富集通路相似度為55.6%；DGMI、GA、GB、GK處理組與模型組相比，顯著富集的主要信號(hào)通路包括FcεRI、NOD樣受體、有絲分裂原激活蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）等。差異基因分析顯示，與對(duì)照組相比，模型組共篩選出439個(gè)差異基因，差異基因的基因本體（gene ontology，GO）分析主要富集在應(yīng)激反應(yīng)過(guò)程，京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）分析主要富集在磷脂酶D、FcεRI、NOD樣受體和血小板活化等信號(hào)通路；與模型組相比，給藥組差異基因的GO分析主要富集在造血和代謝過(guò)程，KEGG分析主要富集在血小板活化、磷脂酶D等信號(hào)通路。HUVEC-T1 OGD模型模擬了部分缺血性腦卒中的病理特征；DGMI、GA、GB、GK均具有抗OGD損傷作用，發(fā)揮抗OGD損傷作用的關(guān)鍵基因及信號(hào)通路主要集中在抗炎、抗凋亡、調(diào)控血小板活化等生物學(xué)過(guò)程，可能通過(guò)下調(diào)FcεRI、NOD樣受體、MAPK和VEGF信號(hào)通路，干預(yù)血小板活化、磷脂酶D等信號(hào)通路發(fā)揮作用。

銀杏二萜內(nèi)酯葡胺注射液；銀杏內(nèi)酯A；銀杏內(nèi)酯B；銀杏內(nèi)酯K；人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞；氧糖剝奪模型；轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

腦卒中是世界范圍內(nèi)導(dǎo)致死亡和殘疾的主要原因之一，每年因腦卒中死亡的人數(shù)占全球死亡人數(shù)的12%，這一比例在發(fā)展中國(guó)家更高[1]。隨著人們生活方式的改變與生活水平的提高，腦卒中的發(fā)病率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)[2]，其中血管阻塞導(dǎo)致的缺血性腦卒中約占所有腦卒中類型的85%[3]，引發(fā)腦血管阻塞的機(jī)制十分復(fù)雜，涉及到動(dòng)脈粥樣硬化、動(dòng)脈炎癥等，因此其病理機(jī)制也十分復(fù)雜，缺氧缺糖導(dǎo)致的能量衰竭、谷氨酸等代謝物累積導(dǎo)致的興奮性中毒、炎癥爆發(fā)以及神經(jīng)細(xì)胞凋亡等均參與其中。目前臨床上最有效的治療方法是在時(shí)間窗內(nèi)進(jìn)行重組組織型纖溶酶原激活劑靜脈溶栓或機(jī)械取栓，但這2種救治方法時(shí)間窗窄、成本高且面臨出血風(fēng)險(xiǎn)[1]，無(wú)法滿足目前的臨床需求。因此，開(kāi)發(fā)更可靠的治療藥物和方法至關(guān)重要。

銀杏葉提取物制劑是臨床上使用最廣泛的中藥提取物制劑之一，具有拮抗血小板活化因子、擴(kuò)血管和抗炎等藥理作用[4-6]，被廣泛用于心腦血管疾病治療。銀杏二萜內(nèi)酯葡胺注射液（Diterpene Ginkgolides Meglumine Injection，DGMI）是主要的銀杏提取物制劑之一[7-8]，其主要活性成分為銀杏內(nèi)酯A（ginkgolide A，GA）、銀杏內(nèi)酯B（ginkgolide B，GB）和銀杏內(nèi)酯K（ginkgolide K，GK）。臨床研究顯示DGMI對(duì)中、老年缺血性腦卒中患者均有顯著療效[9-10]。此外，來(lái)自不同實(shí)驗(yàn)室的現(xiàn)有研究顯示，GA有抗炎和神經(jīng)保護(hù)等作用[11-12]；GB有抗炎、抗氧化和血小板拮抗等作用[13-14]；GK有抗腦缺血損傷作用[15]。上述研究表明DGMI及其功效成分可能是治療缺血性腦卒中的潛力藥物。為明確DGMI及其功效成分抗腦缺血損傷的潛在作用通路，本研究通過(guò)建立人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells-T1，HUVEC-T1）氧糖剝奪（oxygen-glucose deprivation，OGD）模型，模擬缺血性腦卒中時(shí)細(xì)胞缺血缺氧的狀態(tài)，再利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)對(duì)對(duì)照組、模型組及給藥組的細(xì)胞樣本進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，并結(jié)合生信分析方法，鑒定DGMI/GA/ GB/GK抗腦缺血損傷的作用通路及生物學(xué)功能，為中藥及中藥功效成分作用機(jī)制的科學(xué)闡釋提供思路。

1 材料

1.1 細(xì)胞

HUVEC-T1細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心。

1.2 藥品與試劑

DGMI（國(guó)藥準(zhǔn)字Z20120024，批號(hào)201201）、GA（批號(hào)F15IB207297，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為97.4%）、GB（批號(hào)S23HB195722，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、GK（批號(hào)J12HB184945，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）由江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司提供；CCK-8試劑盒購(gòu)自美國(guó)Bimake公司；DMEM培養(yǎng)基（批號(hào)AE29422782）、雙抗（批號(hào)J190015）、胰酶（批號(hào)J1900034）購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；胎牛血清（批號(hào)11G292）購(gòu)自依科賽生物；裂解緩沖液（批號(hào)20201211-270-1）、裂解酶（批號(hào)20201211-270-1）購(gòu)自博奧生物集團(tuán)有限公司。

1.3 儀器

Spectra Max Plus 384酶標(biāo)儀（美國(guó)Molecular Devices公司）；T100型PCR儀（美國(guó)Bio-Rad公司；4150型TapeStation自動(dòng)化電泳系統(tǒng)（美國(guó)Agilent公司）；Invitrogen Qubit4.0核酸定量?jī)x、Countess II型細(xì)胞計(jì)數(shù)器、3111型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱、3131型三氣培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）；Illumina HiSeq X Ten型測(cè)序儀（美國(guó)Illumina公司）。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

將HUVEC-T1細(xì)胞用含10%胎牛血清和1%雙抗的完全培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)前用PBS潤(rùn)洗，胰酶消化，顯微鏡下觀察，當(dāng)80%的細(xì)胞呈圓形時(shí)，加入完全培養(yǎng)基終止消化，轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)，800 r/min離心5 min，棄上清，重懸細(xì)胞計(jì)數(shù)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求計(jì)算稀釋體積并稀釋。

2.2 CCK-8法測(cè)定受試藥細(xì)胞毒性

HUVEC-T1細(xì)胞以8000個(gè)/孔接種至96孔板中，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，將細(xì)胞分為對(duì)照組（加入含對(duì)應(yīng)溶劑的培養(yǎng)基）和給藥組（分別加入含12.5、25、50、100、200 μg/mL DGMI或12.5、25、50、100、200 μmol/L GA、GB、GK的培養(yǎng)基），放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。取出96孔板，每孔加入10 μL CCK-8溶液，將96孔板放入培養(yǎng)箱中避光孵育3 h后，移至酶標(biāo)儀中檢測(cè)各組細(xì)胞在450 nm處的吸光度（）值。

2.3 轉(zhuǎn)錄組實(shí)驗(yàn)分組與給藥

HUVEC-T1細(xì)胞以1×104個(gè)/孔接種至96孔板中，培養(yǎng)24 h。設(shè)置對(duì)照組、模型組、給藥組，對(duì)照組于正常條件下培養(yǎng)；模型組將培養(yǎng)基更換為無(wú)糖培養(yǎng)基，置于37 ℃三氣培養(yǎng)箱（94% N2、5% CO2、1% O2）中培養(yǎng)4 h，隨后將培養(yǎng)基換為完全培養(yǎng)基于CO2培養(yǎng)箱中再培養(yǎng)24 h；給藥組相同條件下缺氧培養(yǎng)4 h后分別加入含12.5、25、50、100、200 μg/mL DGMI或12.5、25、50、100、200 μmol/L GA、GB、GK的培養(yǎng)基，于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。加入裂解液，于冰上裂解每個(gè)樣本孔5 min。裂解完成后，收集裂解液于?80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

吸取裂解液上清，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄、PCR擴(kuò)增和純化后，使用雙端引物進(jìn)行建庫(kù)，質(zhì)檢合格后混樣pooling，采用Illumina HiSeq X Ten測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序（委托博奧生物集團(tuán)有限公司完成）。

2.5 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析

2.5.1 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)處理 利用Trimmomatic軟件[16]對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾，獲取高質(zhì)量數(shù)據(jù)信息，再利用HISAT2[17]和StringTie[18]軟件對(duì)高質(zhì)量數(shù)據(jù)進(jìn)行序列比對(duì)和拼接，統(tǒng)計(jì)每組樣本比對(duì)到各個(gè)基因上的reads數(shù)。

2.5.2 體外模型評(píng)價(jià) 從基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(kù)（gene expression omnibus，GEO）中下載3組缺血性腦卒中患者與健康人群血液轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（GSE22255、GSE16561、GSE58294）進(jìn)行基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA），獲得缺血性腦卒中疾病特征通路集合；將本研究中模型組與對(duì)照組的數(shù)據(jù)對(duì)比進(jìn)行GSEA分析，獲得HUVEC-T1細(xì)胞OGD模型的特征通路集合，比較缺血性腦卒中疾病特征通路集合與OGD模型特征通路集合的相似程度，用于判斷本研究構(gòu)建的OGD模型是否可以表征臨床疾病的特征通路，并用于受試藥物評(píng)價(jià)。

2.5.3 藥物處理組逆轉(zhuǎn)通路分析 將上述模型組對(duì)照組GSEA分析獲得的通路集定義為OGD特征通路集；將每組藥物處理后的細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分別以模型組數(shù)據(jù)為對(duì)照進(jìn)行GSEA分析，獲取給藥組富集通路，與OGD特征通路集進(jìn)行比較，并計(jì)算藥物干預(yù)后表達(dá)趨勢(shì)逆轉(zhuǎn)的通路數(shù)與OGD特征通路總數(shù)的比值（響應(yīng)值），將該比值作為評(píng)價(jià)不同受試藥物抗OGD損傷能力的指標(biāo)：若響應(yīng)值≥50%，表明該受試藥物具有強(qiáng)抗OGD損傷能力；若響應(yīng)值為30%～50%，表明該受試藥物有中等抗OGD損傷能力；若響應(yīng)值＜30%，表明該受試藥物不具備抗OGD損傷能力。

2.5.4 差異基因篩選 采用DESeq[19]軟件包對(duì)各組細(xì)胞的基因表達(dá)量進(jìn)行差異分析，模型組差異基因以模型組對(duì)照組篩選，給藥組差異基因以給藥組模型組篩選（篩選標(biāo)準(zhǔn)|log2(fold change)|≥1.5且≤0.05）。

2.5.5 GO和KEGG富集分析 對(duì)各組差異基因進(jìn)行基因本體（gene ontology，GO）功能和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析，獲取富集通路，并用R語(yǔ)言將相關(guān)信息可視化。

3 結(jié)果

3.1 受試藥物的細(xì)胞毒性檢測(cè)

如圖1所示，受試藥物DGMI在質(zhì)量濃度不超過(guò)200 μg/mL，GA、GB、GK在濃度不超過(guò)200 μmol/L時(shí)對(duì)細(xì)胞均無(wú)明顯毒性，且DGMI表現(xiàn)出一定的促細(xì)胞增殖作用。

3.2 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量分析

在所建立的測(cè)序文庫(kù)中，36組樣本堿基質(zhì)量超過(guò)20的比例在91.84%以上，超過(guò)30的比例在84.42%以上，與指定參考基因組的序列比對(duì)率在93.15%以上，表明測(cè)序結(jié)果較好。

3.3 體外模型評(píng)價(jià)

如圖2、3所示，與健康人群相比，3組缺血性腦卒中患者數(shù)據(jù)的富集通路中共有27條通路重合且變化趨勢(shì)相同。與對(duì)照組相比，模型組共富集到66條通路，其中15條與缺血性腦卒中疾病通路集中的通路重合且變化趨勢(shì)相同，包括細(xì)胞凋亡、有絲分裂原激活蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）、Toll樣受體、NOD樣受體等與炎癥、免疫和凋亡相關(guān)的通路。

與對(duì)照組比較：*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001

*重合通路，圖3同

圖3 受試藥物干預(yù)對(duì)OGD損傷后的HUVEC-T1細(xì)胞的影響

3.4 藥物干預(yù)對(duì)GSEA通路的影響

如表2所示，16個(gè)不同濃度藥物處理組中，11組表現(xiàn)出中等及以上抗OGD損傷能力（響應(yīng)值＞30%），其中GB 50 μmol/L（響應(yīng)值38/66＝57.58%）、GK 50 μmol/L（響應(yīng)值40/66＝60.61%）、DGMI 25 μg/mL（響應(yīng)值35/66＝53.03%）均表現(xiàn)出強(qiáng)抗OGD損傷能力，GA 50 μmol/L（響應(yīng)值32/66＝48.48%）表現(xiàn)出中等抗OGD損傷能力。上述4個(gè)組別均逆轉(zhuǎn)了FcεRI、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、MAPK和NOD樣受體信號(hào)通路的表達(dá)趨勢(shì)，且16個(gè)藥物處理組中，F(xiàn)cεRI、VEGF、MAPK和NOD樣受體信號(hào)通路的表達(dá)趨勢(shì)均被8個(gè)以上組別逆轉(zhuǎn)。此外，B細(xì)胞受體、T細(xì)胞受體、血管平滑肌收縮、自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性等通路均在GA、GB、GK 50 μmol/L通路中被逆轉(zhuǎn)，DGMI 25 μg/mL中未被逆轉(zhuǎn)；而轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）信號(hào)通路則僅在DGMI 25 μg/mL中被逆轉(zhuǎn)，單體中未被逆轉(zhuǎn)（圖3）。

表2 藥物干預(yù)后各組的響應(yīng)值

3.5 差異基因分析

如圖4所示，與對(duì)照組相比，模型組共篩選獲得439個(gè)差異表達(dá)基因，其中127個(gè)基因上調(diào)，312個(gè)基因下調(diào)；與模型組相比，藥物處理組細(xì)胞的差異基因數(shù)量見(jiàn)表3，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，部分模型組差異基因在藥物干預(yù)后表達(dá)趨勢(shì)被逆轉(zhuǎn)（圖5、6）。

圖4 模型組差異基因火山圖

表3 受試藥物干預(yù)對(duì)OGD處理后的HUVEC-T1細(xì)胞基因表達(dá)的影響

M-模型組

M-model group

A-模型組上調(diào)基因與給藥組下調(diào)基因的交集 B-模型組下調(diào)基因與給藥組上調(diào)基因的交集

圖6 模型組與藥物處理組細(xì)胞差異基因熱圖

3.6 受試藥物干預(yù)對(duì)細(xì)胞功能的影響

為明確HUVEC-T1細(xì)胞OGD處理以及OGD處理＋不同濃度藥物干預(yù)后所涉及的生物學(xué)功能變化，本研究對(duì)模型組及藥物處理組細(xì)胞的差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能富集分析，主要包括生物學(xué)過(guò)程（GO biological process，GO_BP）、細(xì)胞組分（GO cellular component，GO_CC）和分子功能（GO molecular function，GO_MF）富集分析。

3.6.1 差異基因GO_BP富集分析 結(jié)果顯示，HUVEC-T1細(xì)胞OGD處理后主要富集在機(jī)體內(nèi)凝血功能、血氧運(yùn)輸、細(xì)胞對(duì)外界刺激（生物刺激、剪切應(yīng)力刺激）等生物過(guò)程（圖7-a）。藥物干預(yù)后，GA組細(xì)胞富集在血管生成、碳水化合物代謝等生物過(guò)程；GB組細(xì)胞富集在生長(zhǎng)發(fā)育、TORC1信號(hào)的調(diào)節(jié)等生物過(guò)程；GK組細(xì)胞富集在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞分化等生物過(guò)程；DGMI組富集在鈣離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、對(duì)銨離子的反應(yīng)等生物過(guò)程（圖8）。

3.6.2 差異基因GO_CC富集分析 結(jié)果顯示，模型組細(xì)胞主要富集在細(xì)胞質(zhì)膜、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架與細(xì)胞核等組分（圖7-b）。藥物處理后，GA組細(xì)胞主要富集在細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞復(fù)合物等組分；GB組細(xì)胞主要富集在突觸膜等組分；GK組細(xì)胞主要富集在細(xì)胞器、突觸膜等組分；DGMI組細(xì)胞主要富集在突觸后膜等組分（圖9）。

3.6.3 差異基因GO_MF富集分析 結(jié)果顯示，模型組細(xì)胞主要富集在GTP酶激活及活性調(diào)節(jié)等功能（圖7-c）。藥物處理后，GA、GB和GK組細(xì)胞均主要富集在蛋白結(jié)合、酶活性調(diào)節(jié)等功能；GK組細(xì)胞還在鈣釋放通道活性調(diào)節(jié)功能富集；DGMI組細(xì)胞則主要在酶活性調(diào)節(jié)功能富集（圖10）。

a-GO_BP分析 b-GO_CC分析 c-GO_MF分析

圖8 給藥組差異基因GO_BP富集分析

圖9 給藥組差異基因GO_CC通路富集分析

圖10 給藥組差異基因GO_MF通路富集分析

3.7 差異基因KEGG通路富集分析

為明確DGMI及其功效成分影響OGD處理后HUVEC-T1細(xì)胞的功能和狀態(tài)的KEGG作用通路，本研究對(duì)獲得的差異基因進(jìn)行KEGG通路富集分析。結(jié)果顯示，模型組差異基因富集于13條KEGG疾病通路，主要涉及炎癥、凋亡和免疫反應(yīng)。與模型組相比，16個(gè)藥物處理組中有4組在13條KEGG疾病通路上富集（圖11），主要包括血管平滑肌收縮、血小板活化、自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性和磷脂酶D信號(hào)通路。

中藥制劑及活性成分具有多靶點(diǎn)特性，可能涉及對(duì)其他通路的影響，本研究進(jìn)一步對(duì)給藥組差異基因進(jìn)行KEGG分析，篩選在藥物處理組中顯著富集且屬于心血管疾病、細(xì)胞生長(zhǎng)與死亡、發(fā)育與再生、免疫系統(tǒng)、脂質(zhì)代謝、神經(jīng)系統(tǒng)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)7類二級(jí)通路中的KEGG通路。結(jié)果顯示，不同濃度藥物處理后，細(xì)胞還在神經(jīng)發(fā)育、能量供應(yīng)、血管再生和神經(jīng)保護(hù)相關(guān)通路顯著富集（圖12）。

圖11 差異基因KEGG富集分析

圖12 藥物處理組差異基因在7類KEGG通路中的富集情況

4 討論

近年來(lái)，大量的研究證實(shí)部分銀杏葉提取物制劑對(duì)缺血性腦卒中后腦損傷具有改善作用，如金納多[20-22]、DGMI[9,23-24]等。DGMI作為主要的銀杏葉提取物制劑之一[8]，已有較多抗腦缺血相關(guān)的研究，但這些研究大多以動(dòng)物為載體且主要針對(duì)特定通路或靶標(biāo)，具有研究偏好，忽略了對(duì)潛在作用通路的探索；此外，在動(dòng)物體內(nèi)開(kāi)展中藥提取物制劑作用機(jī)制研究存在動(dòng)物個(gè)體差異大，研究成本高，實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)等缺陷。因此，開(kāi)發(fā)針對(duì)多個(gè)通路、低成本、可重復(fù)性強(qiáng)且普遍適用的研究策略對(duì)于開(kāi)展中藥及中藥功效成分的作用機(jī)制研究具有重要意義。轉(zhuǎn)錄組學(xué)能全面地反映細(xì)胞內(nèi)的基因表達(dá)情況，通過(guò)比較細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)情況可以明確對(duì)照組、模型組以及藥物處理組細(xì)胞的差異，更全面地研究藥物作用機(jī)制及通路。

本研究基于二代測(cè)序技術(shù)的高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序策略，在體外OGD誘導(dǎo)的HUVEC-T1細(xì)胞模型上評(píng)價(jià)中藥提取物注射液DGMI及其功效成分的抗OGD損傷能力及潛在作用通路。通過(guò)對(duì)GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中缺血性腦卒中患者與正常人群轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)及模型組與對(duì)照組細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行GSEA分析并比較，明確了OGD處理后的HUVEC-T1細(xì)胞具有部分缺血性腦卒中的病理特征，提示本研究選用的體外細(xì)胞模型是模擬缺血性腦卒中的合理模型。

進(jìn)一步GSEA分析發(fā)現(xiàn)，經(jīng)DGMI、GA、GB、GK干預(yù)后，模型組細(xì)胞中的OGD特征通路表達(dá)趨勢(shì)被不同程度逆轉(zhuǎn)，提示DGMI及GA/GB/GK均具備一定的抗OGD損傷活性。缺血性腦卒中患者及本研究模型組細(xì)胞的GSEA通路中，NOD樣受體、MAPK、FcεRI、VEGF通路均為上調(diào)趨勢(shì)，在DGMI、GA、GB、GK干預(yù)后，NOD樣受體、MAPK、FcεRI、VEGF通路均變?yōu)橄抡{(diào)趨勢(shì)。過(guò)往的研究證實(shí)，卒中發(fā)生后，由于腦內(nèi)ATP供應(yīng)減少，胞內(nèi)K+外流、Ca2+內(nèi)流，NOD樣受體炎性小體被激活，進(jìn)而激活MAPK和核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）通路，誘導(dǎo)NOD樣受體家族中炎性小體相關(guān)蛋白的轉(zhuǎn)錄翻譯，導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子釋放增加，炎癥加劇，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致大腦損傷[25-27]。也有研究證明FcεRI受體可與IgE分子結(jié)合激活肥大細(xì)胞釋放促炎細(xì)胞因子，加劇炎癥[27-28]。VEGF對(duì)缺血性腦卒中恢復(fù)具有重要作用，但在缺血性腦卒中急性期，急劇增加的VEGF可能會(huì)導(dǎo)致血腦屏障和血管破壞[29]。在系列針對(duì)臨床缺血性腦卒中患者的轉(zhuǎn)錄組研究中，有研究者也認(rèn)為NOD樣受體、MAPK和FcεRI信號(hào)通路是缺血性腦卒中患者診斷與治療的關(guān)鍵通路[30-31]。提示DGMI、GA、GB、GK均具有抗OGD損傷作用，其作用機(jī)制可能為誘導(dǎo)下調(diào)NOD樣受體、MAPK、FcεRI和VEGF信號(hào)通路，發(fā)揮減輕炎癥、抑制細(xì)胞凋亡和保護(hù)血腦屏障等作用，進(jìn)而減輕腦缺血損傷。GSEA分析還發(fā)現(xiàn)與DGMI相比，GA、GB、GK單體對(duì)免疫相關(guān)通路的調(diào)節(jié)作用更為顯著，如調(diào)節(jié)T細(xì)胞受體、B細(xì)胞受體等；而DGMI則還對(duì)促進(jìn)血管生成、抑制氧化應(yīng)激、代謝等通路調(diào)節(jié)能力更強(qiáng)，如TGF-β信號(hào)通路等。

此外，差異基因分析結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模型組細(xì)胞篩選獲得439個(gè)差異表達(dá)基因，其中127個(gè)基因上調(diào)，312個(gè)基因下調(diào)；DGMI、GA、GB、GK干預(yù)后，可逆轉(zhuǎn)31個(gè)差異基因，包括前列腺素內(nèi)過(guò)氧化物合成酶2（prostaglandin-endoperoxide synthase 2，PTGS2）、基質(zhì)金屬肽酶14（matrix metallopeptidase 14，MMP14）、胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白2（insulin like growth factor binding protein 2，IGFBP2）等。在針對(duì)臨床缺血性腦卒中患者的研究中，PTGS2、MMP14被認(rèn)為是與缺血性腦卒中相關(guān)的關(guān)鍵基因、是潛在的診斷生物標(biāo)志物，被推薦為缺血性腦卒中的治療靶點(diǎn)[32-34]，IGFBP2被認(rèn)為是治療缺血性腦卒中的新型生物標(biāo)志物[35-37]。提示DGMI、GA、GB、GK可能通過(guò)調(diào)控MMP14、PTGS2、IGFBP2等多個(gè)基因參與缺血性腦卒中后的大腦修復(fù)過(guò)程。

DGMI、GA、GB、GK干預(yù)可以改變OGD處理后HUVEC-T1細(xì)胞內(nèi)的主要生物學(xué)過(guò)程，由血氧運(yùn)輸和應(yīng)對(duì)外界刺激反應(yīng)轉(zhuǎn)變?yōu)檠苌?、生長(zhǎng)發(fā)育與代謝調(diào)節(jié)等。在差異基因KEGG分析中，模型組共富集到13條通路，其中磷脂酶D信號(hào)通路與腦缺血密切相關(guān)，磷脂酶D活性增加會(huì)促進(jìn)腦缺血的發(fā)生，加劇大腦損傷[38-39]；T細(xì)胞受體、B細(xì)胞受體信號(hào)通路與細(xì)胞內(nèi)免疫反應(yīng)相關(guān)[40]；FcεRI、NOD樣受體信號(hào)通路與炎癥和凋亡相關(guān)[41]。在系列針對(duì)臨床缺血性腦卒中患者與健康人群轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的差異基因KEGG富集分析中，F(xiàn)cεRI、NOD樣受體、T細(xì)胞受體、B細(xì)胞受體等信號(hào)通路也被顯著富集[30-31]。經(jīng)DGMI、GA、GB、GK干預(yù)后，DGMI組細(xì)胞差異基因在血管平滑肌收縮和磷脂酶D信號(hào)通路富集；GB組細(xì)胞差異基因在血管平滑肌收縮、血小板活化、自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性通路富集。提示DGMI可能通過(guò)干預(yù)血管平滑肌收縮和磷脂酶D信號(hào)通路；GB可能通過(guò)干預(yù)血管平滑肌收縮、血小板活化和自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性發(fā)揮抗OGD損傷作用。此外，對(duì)藥物處理組KEGG分析結(jié)果進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)GA組細(xì)胞還在mTOR等信號(hào)通路富集；GK組細(xì)胞還在MAPK等信號(hào)通路富集；DGMI組細(xì)胞還在Hedgehog等信號(hào)通路富集。盡管這3條通路未在模型組差異基因KEGG分析中被富集，但在模型組GSEA分析中，該3條通路均被富集到。有研究表明mTOR信號(hào)通路可維持細(xì)胞基本功能，促進(jìn)軸突再生和神經(jīng)功能恢復(fù)，促進(jìn)缺氧誘導(dǎo)因子1合成以增加能量供應(yīng)，維持線粒體功能，改善大腦損傷[42-44]。也有研究顯示Hedgehog信號(hào)通路參與誘導(dǎo)缺血后新生血管的生成[45]，其中音猬因子（Shh）可以控制部分促進(jìn)新生血管形成和血管成熟的生長(zhǎng)因子表達(dá)[46]，指導(dǎo)血管形成和成熟[47]。提示這部分通路可能也是DGMI、GA、GB、GK抗OGD損傷的潛在作用通路。

本研究采用2類分析方法，即基于全部基因的GSEA分析方法和基于差異基因的GO和KEGG分析方法。在本研究中，與差異基因GO和KEGG分析結(jié)果相比，GSEA分析得出的結(jié)果與臨床缺血性腦卒中患者轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果更吻合。一般而言，中藥提取物制劑及中藥活性成分作用機(jī)制比較復(fù)雜，且具有弱結(jié)合、多靶點(diǎn)的特性，能同時(shí)影響多個(gè)基因的表達(dá)[48]，差異基因相關(guān)分析僅關(guān)注差異最顯著的部分基因，可能無(wú)法完全展示中藥制劑或中藥活性成分潛在的作用機(jī)制及通路。與差異基因分析方法相比，GSEA分析方法可能更適用于中藥制劑及中藥活性成分的作用機(jī)制研究。

綜上，本研究應(yīng)用轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究方法對(duì)DGMI及其功效成分抗OGD損傷的作用機(jī)制及通路進(jìn)行探索，首先通過(guò)對(duì)缺血性腦卒中患者與本研究中模型組細(xì)胞數(shù)據(jù)進(jìn)行分析對(duì)比，證實(shí)HUVEC-T1 OGD模型能夠模擬部分缺血性腦卒中的病理特征。然后對(duì)本研究中的細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行GSEA、差異基因GO和KEGG分析，明確了DGMI及其功效成分具有抗OGD損傷能力以及發(fā)揮抗OGD損傷作用的主要作用機(jī)制及通路，即通過(guò)下調(diào)FcεRI、NOD樣受體、MAPK和VEGF信號(hào)通路發(fā)揮減輕炎癥、抑制細(xì)胞凋亡和保護(hù)血腦屏障作用；通過(guò)影響磷脂酶D、血小板活化等信號(hào)通路發(fā)揮抗OGD損傷作用。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)了部分DGMI及其功效成分抗OGD損傷的潛在作用通路。本研究為后續(xù)深入挖掘DGMI及其功效成分治療缺血性腦卒中的分子機(jī)制和靶點(diǎn)提供了研究思路及參考。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Transcriptome study of Diterpene Ginkgolides Meglumine Injection and its components against oxygen-glucose deprivation damage in HUVEC-T1 cells

XU Xiao-bo1, WU Zi-yin2, 3, ZHANG Xin-zhuang2, 3, CAO Liang2, 3, WANG Zhen-zhong2, 3, XIAO Wei1, 2, 3

1. Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China 2. Jiangsu Kanion Pharmaceutical Co., Ltd., Lianyungang 222001, China 3. State Key Laboratory of New Technology for Pharmaceutical Process of Traditional Chinese Medicine, Lianyungang 222001, China

To study the potential pathway of Diterpene Ginkgolides Meglumine Injection (銀杏二萜內(nèi)酯葡胺注射液, DGMI) and its ginkgo diterpene lactone components against oxygen-glucose deprivation (OGD) injury in human umbilical vein endothelial cells-T1 (HUVEC-T1).CCK-8 method was used to determine the toxicity of ginkgolide A (GA), ginkgolide B (GB), ginkgolide K (GK) and DGMI at different concentrations on HUVEC-T1 cells, and determine the drug treatment cell concentration. Transcriptomic sequencing was performed on the cell samples of solvent control group (DMSO), model group (OGD/R 4 h/24 h) and the drug administration group (modeling + different doses of GA, GB, GK, DGMI treatment), respectively. Through bioinformatics analysis, the transcriptomic data of ischemic stroke patients in GEO database was used as reference, gene set enrichment analysis (GSEA) and differential genes enrichment analysis methods were used to evaluate the HUVEC-T1 OGD model and the anti-OGD ability of different concentrations of drugs, and to clarify the potential mechanism of action of DGMI and its functional components.GSEA analysis showed that the similarity between the disease enrichment pathway obtained from the analysis of blood transcriptome data of clinical ischemic stroke patients and the enrichment pathway obtained from the cell model sequencing results in this experiment was 55.6%. Compared with model group, the main signaling pathways in DGMI, GA, GB, GK treatment group were significantly enriched, including FcεRI, NOD like receptors, mitogen-activated protein kinase (MAPK), vascular endothelial growth factor (VEGF), etc. Differential genes analysis showed that 439 differential genes were detected in model group compared with control group. Gene ontology (GO) analysis of differential genes was mainly enriched in the stress response process, while Kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG) analysis was mainly enriched in phospholipase D, FcεRI, Nod-like receptor and platelet activation signaling pathways. Compared with model group, GO analysis of differential genes in administration group was mainly enriched in hematopoietic and metabolic processes, while KEGG analysis was mainly enriched in signal pathways such as platelet activation and phospholipase D, etc.The HUVEC-T1OGD model simulated the pathological features of partial ischemic stroke. DGMI, GA, GB, GK have anti-OGD damage effects. The key genes and signaling pathways of DGMI, GA, GB, GK in anti-OGD injury mainly focus on anti-inflammatory, anti-apoptosis, regulation of platelet activation and other biological processes, which may down-regulate FcεRI, Nod-like receptor, MAPK and VEGF signaling pathways, and intervene in platelet activation and phospholipase D and other signaling pathways.

Diterpene Ginkgolides Meglumine Injection; ginkgolide A;ginkgolide B; ginkgolide K; human umbilical vein endothelial cells; oxygen-glucose deprivation model; transcriptomic sequencing

R285.5

A

0253 - 2670(2023)13 - 4233 - 12

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.13.016

2022-11-25

江蘇省自然科學(xué)青年基金資助項(xiàng)目（BK20210139）

徐小波，男，碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴幮滤幍难芯颗c開(kāi)發(fā)。E-mail: 1165992664@qq.com

通信作者：肖 偉，中國(guó)工程院院士，研究員，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹兴幮滤幍难芯颗c開(kāi)發(fā)。E-mail: kanionlunwen@163.com

武子寅，博士，研究方向?yàn)橹兴幮滤幯邪l(fā)。E-mail: cs416@qq.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]