金絲桃苷磷脂復合物及其介孔二氧化硅納米粒的制備和口服藥動學研究

李偉宏，鄭 偉，王風云*，隋海娟

金絲桃苷磷脂復合物及其介孔二氧化硅納米粒的制備和口服藥動學研究

李偉宏1，鄭 偉1，王風云1*，隋海娟2

1. 河南應(yīng)用技術(shù)職業(yè)學院，河南 鄭州 450042 2. 錦州醫(yī)科大學，遼寧 錦州 121001

制備金絲桃苷磷脂復合物（hyperoside phospholipids complex，Hyp-PC）介孔二氧化硅納米粒（Hyp-PC mesoporous silica nanoparticles，Hyp-PC-MSN），考察口服藥動學行為。以復合率為指標，單因素實驗結(jié)合Box-Behnken設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)化Hyp-PC處方。X射線粉末衍射（X-ray powder diffraction，XRPD）對Hyp-PC進行晶型分析，并測定Hyp-PC的油水分配系數(shù)。溶劑揮發(fā)法制備Hyp-PC-MSN，掃描電子顯微鏡觀察Hyp-PC-MSN微觀形態(tài)，并與Hyp-PC比較Hyp-PC-MSN體外溶出情況。SD大鼠分為金絲桃苷組、Hyp-PC組和Hyp-PC-MSN組，測定大鼠血漿中金絲桃苷質(zhì)量濃度，計算Hyp-PC和Hyp-PC-MSN主要藥動學參數(shù)及相對口服吸收生物利用度。Hyp-PC最佳處方的復合率接近100%，金絲桃苷在Hyp-PC中以無定型狀態(tài)存在，油水分配系數(shù)明顯增大。Hyp-PC-MSN外觀形態(tài)呈球形，包封率為（93.17±0.85）%，載藥量為（7.54±0.33）%，粒徑為（163.87±6.15）nm，PDI值為0.108±0.009，ζ電位為（?0.28±0.05）mV。Hyp-PC-MSN明顯提高了釋藥速率和累積釋放度。藥動學結(jié)果顯示，Hyp-PC-MSN的達峰時間（max）顯著性提前，半衰期（1/2）延長至（4.56±0.82）h，達峰濃度（max）提高至（1 462.62±163.94）ng/mL，相對口服生物利用度提高至3.47倍。Hyp-PC-MSN可提高金絲桃苷體外溶出速率、累積溶出度及口服吸收生物利用度。

金絲桃苷；磷脂復合物；油水分配系數(shù)；介孔二氧化硅納米粒；溶出速率；累積溶出度；生物利用度

金絲桃苷（hyperoside，Hyp）屬于黃酮醇苷類化合物，廣泛存在于金絲桃科、唇形科、薔薇科、藤黃科、衛(wèi)矛科、豆科等植物中。現(xiàn)代藥理學表明金絲桃苷具有腎臟保護、肝臟保護、心腦血管保護、降血糖、抗炎等作用[1]，在卵巢癌、宮頸癌等婦科腫瘤也有較強活性[1-2]。據(jù)文獻報道[3]，金絲桃苷具有較好的安全性，長期毒性顯示雖對機體肝臟和腎臟具有一定損傷，但損傷是可逆的，因而金絲桃苷具有一定的開發(fā)價值。測得金絲桃苷在37 ℃下水中的平衡溶解度僅為（224.97±1.60）mg/L，容易影響其溶出速率及溶出度，油水分配系數(shù)較低（lg＝?0.04）[4]，導致胃腸道吸收較差[5]，口服吸收生物利用度為10%左右[6]，限制了該成分臨床應(yīng)用。李園園等[7]制備了金絲桃苷固體分散體，但固體分散體存在易吸潮、穩(wěn)定性差等問題。Feng等[8]對金絲桃苷脂質(zhì)體進行了研究，但工藝較復雜，普通脂質(zhì)體在體內(nèi)易被破壞[9]，降低了促吸收作用。Shen等[10]制備了金絲桃苷納米混懸劑，但粒徑接近400 nm，較大的粒徑可能會影響生物利用度改善幅度[11]。

磷脂復合物（phospholipids complex，PC）是磷脂與晶型藥物在一定條件下通過氫鍵等作用力結(jié)合在一起，從而使藥物以無定型狀態(tài)存在，調(diào)節(jié)油水分配系數(shù)，促進藥物口服吸收并提高藥效等[12-15]。因此，本研究采用單因素結(jié)合Box-Behnken設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)化了金絲桃苷磷脂復合物（hyperoside phospholipids complex，Hyp-PC）處方工藝，并對油水分配系數(shù)、晶型狀態(tài)等進行研究。但后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)Hyp-PC存在黏性較大、溶出度低等缺陷，制備成片劑、膠囊劑等口服制劑時非常困難。

近年來，介孔二氧化硅納米粒（mesoporous silica nanoparticles，MSN）作為藥物載體頗受關(guān)注，具有制備工藝簡便、重復性好等優(yōu)勢[16]。藥物通常以無定型或分子狀態(tài)存在于介孔（孔徑在2～50 nm）孔道內(nèi)，可極大促進藥物溶出，提高生物利用度[17-19]。為了改善Hyp-PC自身存在的缺陷，故對金絲桃苷磷脂復合物介孔二氧化硅納米粒（hyperoside phospholipids complex mesoporous silica nanoparticles，Hyp-PC-MSN）進行了研究，并對Hyp-PC-MSN體外性質(zhì)及體內(nèi)藥動學等進行比較。國內(nèi)外鮮見將PC與MSN技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用的報道，期望通過本研究為金絲桃苷納米制劑及其他難溶性中藥活性成分研究提供新策略。

1 儀器與材料

1.1 儀器

RE-52C型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海一凱儀器設(shè)備有限公司；1100型高效液相色譜儀，美國Agilent公司；XB120A型電子天平，瑞士普利賽斯公司；RG-18型磁力攪拌器，鄭州邦博仕儀器設(shè)備有限；AT612型溶出儀，上海卓光儀器科技有限公司；DS360-15L超聲儀，無錫鼎實電子科技有限公司；JSM-IT800型掃描電子顯微鏡（SEM），日本電子株式會社；Mastersizer 3000型粒度分析儀，英國馬爾文儀器公司；TD-3500型X射線粉末衍射儀，丞普諾儀器蘇州有限公司；TH-80型恒溫恒濕箱，廣東艾思荔檢測儀器有限公司；LD-D12SY型氮吹儀，山東萊恩德智能科技有限公司。

1.2 材料

金絲桃苷原料藥，批號20201024，質(zhì)量分數(shù)94.0%，武漢市恒沃科技有限公司；乙酰苯胺，批號200518，質(zhì)量分數(shù)98.9%，上海如吉生物科技有限公司；金絲桃苷對照品，批號111521-202027，質(zhì)量分數(shù)94.3%，中國食品藥品檢定研究院；大豆磷脂，批號200422，磷脂酰膽堿質(zhì)量分數(shù)88%，上海太偉藥業(yè)股份有限公司；四氫呋喃，色譜級，批號20191022，瑞典歐普森色譜試劑公司；MSN，批號20210514，材料為SBA-15，博華斯納米科技寧波有限公司；十二烷基苯磺酸鈉（SDS，批號20200223）、羧甲基纖維素鈉（CMC-Na，批號20200916）、乙醚（批號20201124），國藥化學試劑集團有限公司；肝素鈉，北京金克隆生物技術(shù)有限公司。

1.3 動物

清潔級SD大鼠，雌雄兼具，購自河南省動物實驗中心，許可證號SCXK（豫）2020-0001，于實驗室（溫度25 ℃、濕度60%）飼養(yǎng)至體質(zhì)量為200～240 g。動物實驗遵循河南應(yīng)用技術(shù)職業(yè)學院有關(guān)實驗動物管理和使用的規(guī)定，均符合3R原則。

2 方法與結(jié)果

2.1 Hyp-PC和Hyp-PC-MSN的制備工藝

2.1.1 Hyp-PC[12-15]取40 mg金絲桃苷（經(jīng)45 ℃真空干燥12 h）和處方量磷脂置于圓底燒瓶，加入50 mL四氫呋喃（色譜級），密封后置于一定溫度水浴中，磁力攪拌一定時間（速度為800 r/min），得澄清溶液。于50 ℃水浴中真空旋蒸除去有機溶劑，即得Hyp-PC，密封保存。

2.1.2 Hyp-PC-MSN[18-19]取0.1 g的Hyp-PC置于20 mL無水乙醇，室溫下磁力攪拌溶解（速度為800 r/min），按照Hyp-PC與MSN質(zhì)量比1∶2、1∶3、1∶4、1∶5分別加入MSN粉末，繼續(xù)磁力攪拌1 d得Hyp-PC-MSN混懸液。45 ℃下減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去無水乙醇，收集粉末，置于45 ℃真空干燥箱中干燥1 d，即得Hyp-PC-MSN粉末。

2.2 HPLC法測定Hyp-PC和Hyp-PC-MSN中金絲桃苷含量

2.2.1 色譜條件 Hypersil ODS C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；檢測波長為360 nm；柱溫為30 ℃；流動相為乙腈-0.1%磷酸水溶液（20∶80）；體積流量1.0 mL/min；進樣量10 μL。理論塔板數(shù)以金絲桃苷峰計不低于6500。

2.2.2 線性關(guān)系考察 精密稱取金絲桃苷對照品，加入甲醇配制成質(zhì)量濃度為1.98 mg/mL的金絲桃苷對照品儲備液，密封保存。取乙腈-0.1%磷酸水溶液（20∶80）稀釋至3 960.0、1 980.0、990.0、495.0、99.0、49.5 ng/mL，進樣測定。采用金絲桃苷質(zhì)量濃度（）對峰面積（）進行線性回歸，得回歸方程：＝548.3＋228.5，＝0.999 5，結(jié)果表明，金絲桃苷在49.5～3 960.0 ng/mL線性關(guān)系良好。

2.2.3 Hyp-PC和Hyp-PC-MSN供試品溶液的配制

（1）Hyp-PC：稱取Hyp-PC約10 mg至100 mL量瓶中，加入60 mL甲醇超聲溶解，繼續(xù)用甲醇稀釋至刻度，取0.5 mL置于10 mL量瓶中，加入流動相稀釋至刻度，即得Hyp-PC供試品溶液。

（2）Hyp-PC-MSN：稱取Hyp-PC-MSN約10 mg至100 mL量瓶中，加入60 mL甲醇超聲溶解，繼續(xù)用甲醇稀釋至刻度，過0.45 μm微孔濾膜，取2.5 mL續(xù)濾液至10 mL量瓶中，加入流動相稀釋至刻度，即得Hyp-PC-MSN供試品溶液。

2.2.4 專屬性考察 取磷脂、MSN等輔料制備空白樣品溶液，另取Hyp對照品溶液、Hyp-PC樣品溶液和Hyp-PC-MSN樣品溶液分別進樣分析，色譜圖見圖1，結(jié)果表明輔料未對根皮素色譜峰產(chǎn)生干擾，專屬性較高。

圖1 空白輔料(A)、Hyp對照品(B)和Hyp-PC(C)、Hyp-PC-MSN(D)樣品溶液的HPLC圖

2.2.5 重復性考察 分別平行制備6份Hyp-PC和Hyp-PC-MSN供試品溶液，分別進樣測定，計算得金絲桃苷質(zhì)量濃度的RSD分別為1.58%和1.77%，表明該實驗重復性良好。

2.2.6 穩(wěn)定性考察 取Hyp-PC和Hyp-PC-MSN供試品溶液，于制備后0、4、8、12、16、24 h分別進樣測定，計算得金絲桃苷峰面積的RSD分別為0.50%和0.83%，表明Hyp-PC和Hyp-PC-MSN供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.7 精密度考察 取質(zhì)量濃度為3 960.0、990.0、49.5 ng/mL的金絲桃苷對照品溶液，分別連續(xù)測試6次，計算得金絲桃苷峰面積的RSD分別為0.18%、0.68%、0.60%，表明儀器精密度良好。

2.2.8 加樣回收率考察 分別稱取9份Hyp-PC和Hyp- PC-MSN，每份均約5 mg，分為低、中、高3組，分別加入金絲桃苷標示量的80%、100%、120%，按照“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，按照“2.2.1”項色譜條件測定金絲桃苷含量，計算其回收率。結(jié)果計算得Hyp-PC中金絲桃苷的平均加樣回收率為99.42%，RSD為1.27%；Hyp-PC-MSN中金絲桃苷的平均加樣回收率為100.65%，RSD為1.87%，結(jié)果表明該實驗準確度較高。

2.3 Hyp-PC的制備及表征

2.3.1 Hyp-PC復合率的測定 金絲桃苷幾乎不溶于石油醚[4]，但Hyp-PC在石油醚中易溶。稱取金絲桃苷（0）按照“2.1.1”項下方法制備Hyp-PC，加入石油醚震蕩溶解，經(jīng)0.45 μm有機濾膜濾過，除去未復合的金絲桃苷，按照“2.2”項下方法操作，測定濾液中金絲桃苷的質(zhì)量濃度，并計算參加復合反應(yīng)的金絲桃苷的質(zhì)量（1），計算Hyp-PC復合率。

復合率＝1/0

2.3.2 單因素考察Hyp-PC的制備工藝

（1）制備溶劑的選擇：在保持金絲桃苷40 mg、磷脂75 mg、制備溫度為45 ℃，制備時間為2 h條件不變情況下，分別考察無水乙醇、醋酸乙酯、二氯甲烷、丙酮、四氫呋喃作為制備溶劑時對Hyp-PC復合率的影響，結(jié)果Hyp-PC的復合率分別為（52.64±1.03）%、（47.15±1.62）%、（68.40±1.04）%、（45.68±0.95）%、（84.73±1.56）%（＝3）?？赡苡捎跓o水乙醇是一種質(zhì)子溶劑，而PC在非質(zhì)子溶劑中往往具有較高的復合率，因而在無水乙醇中制得的Hyp-PC復合率不高。金絲桃苷在醋酸乙酯、二氯甲烷、丙酮中的溶解度較低，不利于藥物與磷脂之間結(jié)合，導致制得的Hyp-PC復合率也不高。四氫呋喃作為制備溶劑時復合率最高，且沸點較低，易于除去，故最終采用四氫呋喃作為制備溶劑。

（2）磷脂用量的考察：在保持金絲桃苷40 mg、制備溶劑為四氫呋喃，制備溫度為45 ℃，制備時間為2 h條件不變情況下，分別考察磷脂用量25、50、75、100、125 mg時對Hyp-PC復合率的影響，結(jié)果Hyp-PC的復合率分別為（33.14±1.26）%、（70.20±1.14）%、（88.44±1.47）%、（95.03±1.25）%、（97.17±1.76）%（＝3）。隨著磷脂用量的逐漸增加，Hyp-PC復合率增加后趨穩(wěn)，可能是由于磷脂用量較小時部分金絲桃苷未能形成Hyp-PC，因而復合率較低。磷脂用量較大時復合率仍未達100%，可能是由于Hyp-PC復合率還受制備溫度、時間等其他制備條件制約。根據(jù)考察結(jié)果，后續(xù)選擇磷脂用量在50～100 mg繼續(xù)進行優(yōu)化。

（3）制備溫度的考察：在保持金絲桃苷40 mg、磷脂用量為100 mg，制備溶劑為四氫呋喃，制備時間為2 h條件不變情況下，分別考察制備溫度35、40、45、50、55、60、65 ℃對Hyp-PC復合率的影響，結(jié)果Hyp-PC的復合率分別為（60.25±1.18）%、（70.94±1.72）%、（87.92±1.80）%、（89.23±1.48）%、（90.26±1.09）%、（85.67±1.26）%、（71.46±0.99）%（＝3）。隨著制備溫度的升高，Hyp-PC復合率先增加后減小，可能是由于制備溫度較低時影響了金絲桃苷與磷脂分子的結(jié)合，導致復合率較低，但磷脂在高溫時容易被氧化[13]，因而制備溫度過高時會導致Hyp-PC復合率出現(xiàn)下降情況。根據(jù)考察結(jié)果，后續(xù)可選擇制備溫度在40～60 ℃繼續(xù)進行優(yōu)化。

（4）制備時間的考察：在保持金絲桃苷40 mg、磷脂用量為100 mg，制備溶劑為四氫呋喃，制備溫度為45 ℃條件不變情況下，分別考察制備時間0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 h對Hyp-PC復合率的影響，結(jié)果Hyp-PC的復合率分別為（45.60± 1.33）%、（76.21±1.42）%、（86.83±1.07）%、（90.11± 1.72）%、（96.45±1.26）%、（88.23±1.92）%、（79.92± 1.58）%（＝3）。隨著制備時間的增加，Hyp-PC復合率先增加后下降，可能是由于制備時間較短時影響了金絲桃苷與磷脂分子的結(jié)合，故Hyp-PC復合率較低，但制備時間過長時同樣會影響磷脂的穩(wěn)定性[13]，從而導致Hyp-PC復合率下降。根據(jù)考察結(jié)果，后續(xù)選擇制備時間在1.0～3.0 h繼續(xù)進行優(yōu)化。

2.3.3 Box-Behnken設(shè)計-響應(yīng)面法優(yōu)化Hyp-PC處方工藝

（1）試驗設(shè)計及結(jié)果：采用Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化Hyp-PC處方工藝，據(jù)“2.4”項下單因素考察發(fā)現(xiàn)，Hyp-PC復合率主要受處方工藝中磷脂用量、制備溫度和制備時間影響較大，故分別作為主要影響因素1、2、3，各影響因素的水平見表1。以Hyp-PC復合率（）為優(yōu)化指標，測定不同處方工藝制得Hyp-PC的復合率（設(shè)置5組平行試驗），結(jié)果見表1。

（2）數(shù)學模型的建立與方差分析：根據(jù)表1得到的實驗數(shù)據(jù)，對Hyp-PC主要影響因素即因變量（1、2、3）和響應(yīng)值即自變量（）進行擬合，得到二次多元回歸方程為＝98.01＋7.351＋3.132＋8.213＋1.0312＋3.9013－0.4823－11.8612－6.1422－12.9032，決定系數(shù)2和校正系數(shù)adj2分別為0.995 3和0.989 1，均大于0.98，所以測得的Hyp-PC復合率與擬合值吻合度較高。

方差分析結(jié)果見表2，數(shù)學模型值＜0.000 1（極顯著性），失擬度值＝0.105 4＞0.05（無顯著性），因此，該數(shù)學模型可信度較高，可用于Hyp-PC處方工藝研究。二次多元回歸方程中，1、2、3、13、12、22和32等均具極顯著差異（＜0.01），1和3系數(shù)相對較大，因此，磷脂用量和制備溫度對Hyp-PC復合率的影響程度大于制備時間的影響程度。

（3）效應(yīng)面結(jié)果及最佳處方工藝：兩兩因素交互作用的三維曲面圖見圖2，固定1、2、3某因素不變時（分別取中間值），其他兩兩因素對Hyp-PC復合率的影響均是先增加后下降趨勢，因此Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化Hyp-PC處方工藝是必要的。設(shè)置Hyp-PC復合率最小值為50%，最大值為100%，得Hyp-PC最佳處方工藝為大豆磷脂用量1＝74.85 mg，制備溫度2＝50.06 ℃，攪拌時間3＝2.47 h，預測Hyp-PC復合率為100.1%。

2.3.4 Hyp-PC最佳處方工藝的確定及驗證 為便于實際操作，將Hyp-PC最佳處方工藝略作調(diào)整，大豆磷脂用量調(diào)整為75 mg，制備溫度為50 ℃，攪拌時間為2.5 h。平行制備3批Hyp-PC，按照“2.3.1”項下方法測定Hyp-PC復合率，并計算偏差［偏差＝(實際值－預測值)/預測值］。結(jié)果見表3，平均復合率為（99.68±0.50）%，與預測值100.1%相比偏差僅?0.42%，證明采用Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化Hyp-PC處方工藝較強的指導意義。

圖2 自變量與響應(yīng)值的三維圖

2.3.5 X射線粉末衍射（X-ray powder diffraction，XRPD）法分析Hyp-PC的晶型 采用Cu-K α靶，為不缺失必要的晶型信息將掃描速度降低至4°/min，掃描范圍（2）為3°～45°。取金絲桃苷原料藥、磷脂、物理混合物（金絲桃苷與磷脂比例同Hyp-PC）和Hyp-PC適量置于玻璃槽，壓制平整后進行掃描，結(jié)果見圖3。金絲桃苷原料藥在7.3°、8.6°、11.3°、19.5°、20.2°、25.5°等處出現(xiàn)特征晶型峰。物理混合物中仍可見金絲桃苷特征晶型峰，但強度有所下降，說明簡單混合未能使金絲桃苷晶型發(fā)生改變。Hyp-PC的XRPD圖譜顯示金絲桃苷特征晶型峰完全消失，證明金絲桃苷晶型發(fā)生了改變，轉(zhuǎn)變?yōu)闊o定形物質(zhì)。

表3 Hyp-PC處方驗證(, n = 3)

圖3 Hyp-PC的XRPD結(jié)果

2.3.6 Hyp-PC油水分配系數(shù)的測定 按照《中國藥典》2020年版四部配制pH值為2.0、4.5、5.0、6.8、7.4的磷酸鹽緩沖液（PBS），分別取各pH值PBS 50 mL及蒸餾水50 mL分別作為水相，各水相中加入50 mL正辛醇，置于（37.0±0.5）℃的恒溫振蕩器中振搖2 d，分別取上層和下層即得水相飽和正辛醇及正辛醇飽和水相。取各個水相飽和正辛醇5 mL，加入過量的金絲桃苷原料藥，同條件下振搖2 d，經(jīng)0.45 μm濾膜濾過，測定續(xù)濾液中金絲桃苷質(zhì)量濃度（o）。分別精密吸取2 mL，加入相應(yīng)正辛醇飽和水相5 mL，同條件下繼續(xù)振搖2 d，取水層測定質(zhì)量濃度（w），計算油水分配系數(shù)（），＝(o－w)/w，并計算lg值。同法測定物理混合物（金絲桃苷與磷脂用量比例與Hyp-PC一致）和Hyp-PC的lg值。結(jié)果見表4，將金絲桃苷制備成Hyp-PC后，金絲桃苷在不同pH值及水中的lg值均得到明顯增加，為促進機體吸收奠定了基礎(chǔ)。物理混合物的lg值有一定增加，但增加幅度遠低于Hyp-PC。

2.4 Hyp-PC-MSN的制備及表征

2.4.1 Hyp-PC與MSN質(zhì)量比考察 取金絲桃苷原料藥、Hyp-PC、物理混合物（Hyp-PC與MSN質(zhì)量比為1∶4）和不同處方的Hyp-PC-MSN粉末適量（金絲桃苷含量均為10 mg），加入5 mL空白釋藥介質(zhì)，置于活化后透析袋中（截留相對分子質(zhì)量為8000～12 000），兩端扎緊。溶出介質(zhì)為1.0% SDS溶液900 mL，溶出儀轉(zhuǎn)速為75 r/min，待介質(zhì)溫度恒溫至37 ℃后進行實驗，分別于5、10、15、30、45、60、90、120、180、240 min取樣5 mL，立即補加5 mL空白介質(zhì)，使釋藥介質(zhì)總體積不變。樣品過0.45 μm微孔濾膜后進行HPLC測定，結(jié)果見圖4。金絲桃苷原料藥和Hyp-PC在240 min的累積溶出率分別為18.03%和29.88%。不同處方的Hyp-PC-MSN溶出速率和累積溶出率均明顯提高，其中質(zhì)量比為1∶4和1∶5時累積溶出率相對較高且無明顯差別，為減少輔料用量故確定Hyp-PC和MSN的質(zhì)量比為1∶4來制備Hyp-PC-MSN。

表4 油水分配系數(shù)測定結(jié)果(, n = 3)

Hyp-PC-MSN粉末及超聲分散于水后混懸液外觀見圖5。

2.4.2 Hyp-PC-MSN包封率及載藥量的測定 取Hyp-PC-MSN粉末約20 mg分散于50 mL蒸餾水中，取2 mL至離心管中，12 500 r/min高速離心45 min（離心半徑4.6 cm，溫度為4 ℃），取續(xù)濾液進樣測定游離金絲桃苷量（游離）。取Hyp-PC-MSN混懸液按“2.2.3”項下方法進樣測定總金絲桃苷的量（總藥量）。取Hyp-PC-MSN混懸液50 mL，45 ℃下減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去無水乙醇，收集粉末，置于45 ℃真空干燥箱中干燥1 d，稱定質(zhì)量（總），計算Hyp-PC-MSN的包封率和載藥量。

載藥量＝(總藥量－游離)/總

包封率＝(總藥量－游離)/總藥量

結(jié)果顯示，3批Hyp-PC-MSN的平均包封率為（93.17±0.85）%，平均載藥量為（7.54±0.33）%。

2.4.3 Hyp-PC-MSN的粒徑及ζ電位測定 取“2.4.1”項下Hyp-PC-MSN混懸液，轉(zhuǎn)移至比色皿中于粒度分析儀上測定粒徑及多分散指數(shù)（polydispersity index，PDI）值。另取適量轉(zhuǎn)移至測定ζ電位專用器皿中，測定Hyp-PC-MSN的ζ電位。結(jié)果顯示，3批Hyp-PC-MSN樣品平均粒徑為（163.87±6.15）nm，粒徑分布見圖6-A，PDI值為0.108±0.009；Hyp-PC-MSN的ζ電位為（?0.28±0.05）mV，ζ電位分布見圖6-B。

圖5 Hyp-PC-MSN粉末(A)及混懸液(B)外觀

2.4.4 Hyp-PC-MSN的溶解度測定 取過量的金絲桃苷原料藥、Hyp-PC和Hyp-PC-MSN粉末，分別加入20 mL蒸餾水，置于37 ℃水浴中磁力攪拌2 d（700 r/min），12 500 r/min高速離心45 min（離心半徑4.6 cm，溫度為4 ℃），分別上清液進樣測定金絲桃苷質(zhì)量濃度。測得金絲桃苷原料藥、Hyp-PC和Hyp-PC-MSN粉末的溶解度分別為（224.97±1.60）、（384.73±1.15）、（1 196.82±10.28）mg/L?？梢奌yp-PC和Hyp-PC-MSN均可增加金絲桃苷溶解度，但Hyp-PC-MSN優(yōu)勢更大。

2.4.5 SEM觀察Hyp-PC-MSN的微觀外貌 取銅膠帶黏貼至T型臺上，用無水乙醇沖洗3次，并擦拭干凈。取“2.4.1”項下的Hyp-PC-MSN混懸液，滴2滴加至銅膠帶上，蕩平后于室溫自然晾干，噴金1 min（真空度為3.7 Pa），置于SEM觀察Hyp-PC-MSN的微觀外貌，放大倍數(shù)為14 000。結(jié)果見圖7，可見Hyp-PC-MSN呈球形或橢圓形，外觀圓整。

2.4.6 X射線衍射法分析Hyp-PC-MSN的晶型 取金絲桃苷原料藥、物理混合物（金絲桃苷與輔料比例同Hyp-PC-MSN）和Hyp-PC-MSN粉末適量，置于玻璃槽，壓制平整后按“2.3.5”項下條件進行掃描，結(jié)果見圖8。金絲桃苷原料藥在7.3°、8.6°、11.3°、19.5°、20.2°、25.5°等處出現(xiàn)特征晶型峰，物理混合物中仍可見原料藥特征晶型峰，但在Hyp-PC-MSN的XRPD圖譜中金絲桃苷特征晶型峰均完全消失，證明將Hyp-PC制備成Hyp-PC-MSN后金絲桃苷仍以無定形狀態(tài)存在。

圖7 Hyp-PC-MSN的SEM圖

圖8 Hyp-PC-MSN的XRPD結(jié)果

2.4.7 Hyp-PC-MSN的穩(wěn)定性考察 取Hyp-PC- MSN粉末密封后置于溫度為30 ℃、濕度為65%的恒溫恒濕箱中，分別于0、1、5、10、15、30、45、60、75、90 d取樣，分別測定粒徑、包封率和載藥量，結(jié)果見表5。Hyp-PC-MSN的粒徑、包封率和載藥量與0 d相比，變化幅度均小于±5%，說明Hyp-PC-MSN粉末在90 d內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5 Hyp-PC和Hyp-PC-MSN的藥動學研究

2.5.1 給藥及取血方案 取質(zhì)量濃度為5.0 mg/mL的CMC-Na水溶液配制金絲桃苷原料藥、Hyp-PC和Hyp-PC-MSN粉末的ig液，超聲10 s使之分散，臨用現(xiàn)配。取18只SD大鼠，分為3組，按大鼠體質(zhì)量進行ig給藥，劑量均為20 mg/kg。ig后計時，分別于0、0.5、1、2、3、4、6、8、10、12、18 h采用乙醚麻醉后于眼眶靜脈叢取血約0.25 mL，玻璃毛細管引流至肝素浸潤的離心管中，渦旋震蕩10 s，并3500 r/min離心（離心半徑為6.8 cm）2 min，取上層淺黃色血漿至空白離心管中，密封并冷凍保存。

表5 穩(wěn)定性研究結(jié)果(, n = 3)

2.5.2 血漿樣品的制備[20]精密稱取乙酰苯胺對照品適量，使用乙腈稀釋至978.8 ng/mL，即得內(nèi)標溶液。取100 μL血漿樣品和50 μL內(nèi)標溶液至離心管中，密封，渦旋混勻3 min。加入1 mL乙腈，渦旋震蕩5 min，10 000 r/min離心（離心半徑為6.8 cm）10 min（溫度為4 ℃），收集有機相，于40 ℃氮吹儀吹干，加入100 μL流動相復溶，再次以 10 000 r/min離心10 min，即得血漿樣品溶液。

2.5.3 線性關(guān)系考察 取采用乙腈稀釋配制1980.0、990.0、495.0、247.5、99.0、49.5 ng/mL的金絲桃苷對照品溶液，各質(zhì)量濃度分別取100 μL置于離心管中，于40 ℃氮吹儀吹干，分別加入100 μL空白血漿渦旋震蕩5 min復溶，按照“2.5.2”項下方法處理，即得質(zhì)量濃度為1 980.0、900.0、495.0、247.5、90.0、49.5 ng/mL的金絲桃苷血漿對照品溶液（均含乙酰苯胺內(nèi)標）。按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，以金絲桃苷質(zhì)量濃度為橫坐標（），金絲桃苷和乙酰苯胺峰面積比值為縱坐標（），進行線性回歸，得回歸方程＝0.002 3－0.101 7，＝0.996 4，因此，金絲桃苷血漿對照品在49.5～1 980.0 ng/mL線性關(guān)系良好。

2.5.4 專屬性考察 取空白血漿、血漿樣品（金絲桃苷原料藥ig 18 h樣品）和血漿對照品（金絲桃苷質(zhì)量濃度為49.5 ng/mL），按“2.5.2”項下方法處理后進樣HPLC測定，結(jié)果見圖9，金絲桃苷和乙酰苯胺均不受內(nèi)源性雜質(zhì)干擾，專屬性良好。

2.5.5 穩(wěn)定性考察 取Hyp-PC給藥3 h的血漿樣品（處理后），分別于0、3、6、9、12、24 h進樣測定，計算得金絲桃苷與乙酰苯胺峰面積比值的RSD為6.82%，因此血漿樣品穩(wěn)定性良好。

2.5.6 日內(nèi)精密度及日間精密度考察 取金絲桃苷質(zhì)量濃度為49.5 ng/mL（低）、495.0 ng/mL（中）、1 980.0 ng/mL（高）的血漿對照品溶液，1 d內(nèi)連續(xù)測定6次，計算得金絲桃苷與乙酰苯胺峰面積比值的RSD分別為9.17%、5.69%、8.54%，說明日內(nèi)精密度良好；連續(xù)測試6 d，每天1次，計算得金絲桃苷與乙酰苯胺峰面積比值的RSD分別為7.60%、9.43%、9.02%，說明日間精密度良好。

2.5.7 準確度考察 取質(zhì)量濃度為49.5 ng/mL（低）、495.0 ng/mL（中）、1 980.0 ng/mL（高）的金絲桃苷血漿對照品溶液，分別按照“2.5.2”項下方法處理，測定金絲桃苷與乙酰苯胺的峰面積，帶入血漿對照品標準曲線方程計算測得質(zhì)量濃度，并與實際質(zhì)量濃度對比，計算回收率，結(jié)果顯示低、中、高質(zhì)量濃度平均回收率為96.71%，RSD值為7.52%，可見準確度較高。

圖9 空白血漿(A)、血漿對照品溶液(B)、血漿樣品(C)的HPLC圖

2.5.8 定量限考察 取金絲桃苷質(zhì)量濃度為49.5 ng/mL血漿對照品，逐步稀釋，采用信噪比為10時作為定量限，測試結(jié)果顯示，金絲桃苷定量限為9.9 ng/mL。

2.5.9 藥動學結(jié)果 金絲桃苷原料藥、Hyp-PC和Hyp-PC-MSN組的血藥濃度-時間曲線，結(jié)果見圖10。使用DAS 2.0軟件包擬合數(shù)據(jù)，結(jié)果見表6。Hyp-PC的達峰時間（max）與金絲桃苷原料藥相比無統(tǒng)計學意義（＞0.05），半衰期（1/2）有所延長（＞0.05），達峰濃度（max）顯著性提高至1.68倍，說明Hyp-PC在一定程度上可促進金絲桃苷的口服吸收，Hyp-PC的口服吸收生物利用度（Fr）提高至2.08倍。

圖10 血藥濃度-時間曲線(, n = 6)

表6 主要藥動學參數(shù)(, n = 6)

與Hyp原料藥比較：*＜0.05**＜0.01；與Hyp-PC比較：#＜0.05##＜0.01

*< 0.05**< 0.01Hyp drug substance;#< 0.05##< 0.01Hyp-PC

將Hyp-PC制備成Hyp-PC-MSN后，max、1/2、max、AUC0～t和AUC0～￥均有極顯著性提高（＜0.05、0.01），與金絲桃苷原料藥相比Hyp-PC-MSN的Fr提高至3.47倍。與Hyp-PC相比，Hyp-PC-MSN的max、1/2、max、AUC0～t和AUC0～￥均有極顯著性改變（＜0.05、0.01），可見將Hyp-PC制備成Hyp-PC-MSN后更進一步促進了金絲桃苷口服吸收，為藥效提高奠定基礎(chǔ)。

3 討論

據(jù)文獻報道[14-15]，磷脂與藥物分子按照物質(zhì)的量比1∶1形成PC，雖然加大磷脂用量可以提高復合率，但磷脂用量過大時會對PC的存在形式產(chǎn)生較大影響，甚至以液態(tài)存在，因此需對磷脂用量進行精確優(yōu)化。本研究采用Box-Behnken響應(yīng)面法篩選出Hyp-PC最佳條件，復合率接近100%，Hyp-PC以固態(tài)形式存在，但由于較大的黏性給后續(xù)片劑、膠囊劑等制備帶來了很大不便。

XRPD法結(jié)果顯示，金絲桃苷在Hyp-PC中轉(zhuǎn)變?yōu)闊o定型狀態(tài)，但磷脂的晶型峰也消失不見，可能是由于金絲桃苷分子與磷脂的極性端通過氫鍵、范德華力等作用力結(jié)合在一起，使金絲桃苷和磷脂晶型峰均被抑制[12-13]，因而導致金絲桃苷和磷脂的晶型峰均消失。磷脂具有兩親性特點，將金絲桃苷制備成Hyp-PC后，其水溶性和脂溶性均得到改善，但脂溶性的提高幅度，往往高于其水溶性的提高幅度[14-15]，因而最終使金絲桃苷在不同介質(zhì)中的油水分配系數(shù)均得到顯著提高，利于藥物經(jīng)胃腸道黏膜吸收進入體循環(huán)。

PC疏水性較強，且黏性較大，因而釋藥速率和累積釋放度均受到較大影響，最終也影響了藥物的口服吸收生物利用度提高幅度[21]。國內(nèi)外研究者進一步將PC制備成固體分散體、納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體、固體脂質(zhì)納米粒等[21-24]，但固體分散體容易吸潮，對存儲條件要求較高，而磷脂復合物納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體和固體脂質(zhì)納米粒均存在制備工藝復雜、輔料種類較多、載藥量較低等缺陷。本研究借助MSN納米粒技術(shù)將Hyp-PC制備成Hyp-PC-MSN粉末，不僅穩(wěn)定性良好，載藥量高，而且無需額外添加凍干保護劑，減少了輔料種類，具有推廣意義。體外釋藥結(jié)果顯示，Hyp-PC-MSN提高了Hyp-PC釋藥速率和累積釋放度，使Hyp-PC本身缺陷得到明顯改善。

與金絲桃苷相比，Hyp-PC生物利用度提高至2.08倍，至少與金絲桃苷轉(zhuǎn)變?yōu)闊o定型態(tài)、溶出度及油水分配系數(shù)提高等因素有關(guān)。但Hyp-PC在240 min的累積溶出率仍不足30%，對藥物溶出速率和溶出度改善作用有限，因而口服吸收提高效果受到較大限制[23]。Hyp-PC-MSN相對口服生物利用度提高至3.47倍，改善幅度高于Hyp-PC，可能是由于將Hyp-PC制備成Hyp-PC-MSN后藥物的溶出速率及溶出度得到明顯改善；Hyp-PC-MSN充分融合了PC和MSN技術(shù)優(yōu)勢，增強了藥物吸收；藥物比表面積劇增，增加了與胃腸道吸收部位的接觸面，利于藥物吸收[23-24]；藥物在Hyp-PC-MSN中仍以無定型態(tài)存在，而無定型態(tài)的藥物更易被吸收[25-26]；納米藥物在胃腸道具有較強黏附性，有益于藥物吸收[27-28]。

本研究完成了Hyp-PC-MSN制備工藝、晶型、體外溶出及口服藥動學等評價，為后續(xù)制劑學（片劑、膠囊劑等口服制劑）、毒理學、藥效學等研究奠定了基礎(chǔ)。此外，MSN表面含大量的羥基賦予其更好的可控性和修飾性[29-31]，可通過表面功能化修飾進而實現(xiàn)靶向、控釋藥物等目的，達到提高藥物療效、降低毒副作用目的，后續(xù)也將作進一步研究。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Preparation of hyperoside phospholipids complex and its mesoporous silica nanoparticles and oral pharmacokinetics study

LI Wei-hong1, ZHENG Wei1, WANG Feng-yun1, SUI Hai-juan2

1. Henan Vocational College of Applied Technology, Zhengzhou 450042, China 2. Jinzhou Medical University, Jinzhou 121001, China

To prepare hyperoside phospholipids complex (Hyp-PC) mesoporous silica nanoparticles (Hyp-PC-MSN), and study oral pharmacokinetics behavior.Taking the recombination rate as index, single factor experiment combined with Box-Behnken design-response surface methodology to optimize the formulation of Hyp-PC. Crystalline form of Hyp-PC was analyzed by X-ray powder diffraction (XRPD). Oil-water partition coefficient of Hyp-PC was determined. Solvent evaporation was used to prepare Hyp-PC-MSN. Microscopic appearance of Hyp-PC-MSN was observed by scanning electron microscope (SEM), and its dissolutionwas compared to Hyp-PC. SD rats were divided into hyperoside suspension group, Hyp-PC group and Hyp-PC-MSN group, hyperoside concentration in plasma was determined, and main pharmacokinetic parameters and relative oral bioavailability of Hyp-PC and Hyp-PC-MSN were calculated.Recombination rate of optimized formulations of Hyp-PC was close to 100%. Hyperoside was an amorphous substance in Hyp-PC and the oil-water partition coefficient was enhanced greatly. Microscopic appearance of Hyp-PC-MSN was spherical in shape. Average envelopment efficiency was (93.17 ± 0.85) %, drug loading was (7.54 ± 0.33)%, particle size was (163.87 ± 6.15) nm, PDI value was 0.108 ± 0.009 and ζ potential was (?0.28 ± 0.05) mV. Drug release rate and cumulative releaseratewas greatly promoted. Pharmacokinetics results showed thatmaxof Hyp-PC-MSN was advanced significantly,1/2was prolonged to (4.56 ± 0.82) h,maxwas increased to (1 462.62 ± 163.94) ng/mL and oral bioavailability was enhanced to 3.47 times.Hyp-PC-MSN could increase dissolution rate, cumulative dissolution rateand the oral bioavailability of hyperoside.

hyperoside; phospholipids complex; oil-water partition coefficient; mesoporous silica nanoparticles; dissolution rate; cumulative dissolution rate; bioavailability

R283.6

A

0253 - 2670(2023)13 - 4157 - 11

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.13.009

2023-01-07

河南省高等學校重點科研項目計劃（23B320013）；婦科腫瘤科研創(chuàng)新團隊（2021-TD-02）；河南應(yīng)用技術(shù)職業(yè)學院骨干教師（2020-GGJS-Y008）

李偉宏（1980—），女，碩士，副教授，從事臨床藥學研究。Tel: (0371)67673862 E-mail: liweihong5168@126.com

通信作者：王風云（1973—），女，碩士，教授，從事臨床藥學及婦科腫瘤研究。Tel: (0371)67673862 E-mail: wangfengyun1973@126.com

[責任編輯 鄭禮勝]