黑柳樹皮化學(xué)成分及其抑制脂肪生成活性研究

劉 歡，甲次拉母，蒲沙龍，張吉仲，李麗梅

黑柳樹皮化學(xué)成分及其抑制脂肪生成活性研究

劉 歡，甲次拉母，蒲沙龍，張吉仲，李麗梅*

西南民族大學(xué)藥學(xué)院四川 成都 610041

研究黑柳樹皮的化學(xué)成分，并對(duì)部分化合物進(jìn)行抑制脂肪生成活性研究。采用多種色譜分離技術(shù)進(jìn)行分離和純化，并運(yùn)用核磁共振波譜技術(shù)鑒定其結(jié)構(gòu)。以秀麗隱桿線蟲為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停糜图tO和蘇丹黑B染色，研究從黑柳樹皮中分離到的部分化合物對(duì)秀麗隱桿線蟲脂肪生成的影響。從黑柳樹皮甲醇提取物的正丁醇萃取部位中共分離得到12個(gè)化合物，分別鑒定為柳皮苷（1）、特里楊苷（2）、7-水楊酰-2′-苯甲酰水楊苷（3）、cochinchiside A（4）、2′-苯甲酰水楊苷（5）、胡蘿卜苷（6）、rosin（7）、水楊苷（8）、chalcononaringenin-2′--β--glucopyranoside（9）、3,4-二羥基苯甲酸（10）、苯甲酸（11）和水楊酸（12）。其中化合物1、2、5和9能夠顯著抑制秀麗隱桿線蟲脂肪生成。12個(gè)化合物均為首次從黑柳中分離得到?；衔?對(duì)秀麗隱桿線蟲脂肪生成的抑制作用最強(qiáng)。

黑柳；秀麗隱桿線蟲；抑制脂肪生成活性；柳皮苷；特里楊苷；2′-苯甲酰水楊苷

楊柳科柳屬L. 植物資源豐富，全球約有520種，主要分布于北半球溫帶及寒帶地區(qū)，極少數(shù)分布在亞熱帶和南半球地區(qū)；我國有257種、122變種、33變型，在各省均有分布[1]。其樹皮、枝、葉、花等部位均可入藥，具有悠久的藥用歷史。19世紀(jì)40年代，化學(xué)家首次從柳樹皮中分離出水楊酸并發(fā)現(xiàn)其具有顯著的解熱和鎮(zhèn)痛作用，后來以之為先導(dǎo)化合物誕生了醫(yī)藥史上的經(jīng)典藥物——阿司匹林，至今仍是世界上應(yīng)用最廣泛的解熱、鎮(zhèn)痛和抗炎藥[2]。后續(xù)的研究表明柳屬植物主要含有黃酮類、水楊酸衍生物類、苯丙素類等酚性成分，具有抗腫瘤、鎮(zhèn)痛抗炎、抗氧化、降血糖、調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)等藥理作用[3]。其中酚類成分的減肥作用受到研究者的持續(xù)關(guān)注，例如Han等[4-5]研究證實(shí)旱柳Koidz葉中的多酚組分具有減肥作用；劉可越等[6]發(fā)現(xiàn)垂柳L.葉中木犀草素等黃酮類化合物能夠促進(jìn)去甲腎上腺素分解脂肪，抑制小腸吸收脂肪酸；Lee等[7]從朝鮮垂柳Lévl.樹枝中發(fā)現(xiàn)柳皮苷衍生物，該類成分可通過調(diào)節(jié)C/EBPα和SREBP1c通路，顯著減少脂質(zhì)積累，抑制前脂肪細(xì)胞3T3-L1分化。因此，富含酚類成分的柳屬植物可能是發(fā)現(xiàn)減肥藥物的源泉之一。

黑柳Marshall（black willow）別名北美黑柳、沼澤柳、西南黑柳、海灣黑柳、鐮葉柳，原產(chǎn)北美洲，用于治療咳嗽、痢疾、風(fēng)濕、關(guān)節(jié)炎和痛風(fēng)等[8]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明黑柳醇提物具有抗炎、抗菌活性。Verma等[9]證實(shí)黑柳甲醇提取物具有抗炎活性；此外，Sharma等[10]發(fā)現(xiàn)黑柳甲醇提取物還可以通過抑制前炎癥因子和氧化壓緩解膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎癥狀；Tahir等[11]報(bào)道黑柳乙醇提取物具有抗革蘭陽性菌和革蘭陰性菌活性。然而，暫未見黑柳樹皮化學(xué)成分及其抑制脂肪生成活性方面的相關(guān)報(bào)道。因此，本研究采用多種現(xiàn)代色譜和波譜方法對(duì)黑柳樹皮化學(xué)成分進(jìn)行分離純化和結(jié)構(gòu)鑒定，并以秀麗隱桿線蟲為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，利用油紅O和蘇丹黑B染色，探究分離得到的部分化合物抑制脂肪生成活性，以期為黑柳化學(xué)成分研究及減肥藥物研發(fā)提供參考。從黑柳樹皮70%甲醇提取物中分離鑒定12個(gè)化合物，分別為柳皮苷（salicortin，1）、特里楊苷（tremulacin，2）、7-水楊酰-2′-苯甲酰水楊苷（salicyloyltremuloidin，3）、cochinchiside A（4）、2′-苯甲酰水楊苷（tremuloidin，5）、胡蘿卜苷（daucosterol，6）、rosin（7）、水楊苷（salicin，8）、chalcononaringenin-2′-- β--glucopyranoside（9）、3,4-二羥基苯甲酸（3,4- dihydroxybenzoic acid，10）、苯甲酸（benzoic acid，11）和水楊酸（salicylic acid，12）。12個(gè)化合物均為首次從黑柳中分離得到；其中化合物1、2、5和9具有顯著抑制秀麗隱桿線蟲脂肪生成的作用，化合物5的作用最強(qiáng)。

1. 儀器與材料

1.1 儀器與試劑

ME204E型電子天平（德國Mettler Toledo公司）；半制備色譜柱（250 mm×10 mm，5 μm，日本YMC公司；250 mm×21.2 mm，10 μm，蘇州納微生物科技有限公司）；LC-P100型高效液相色譜儀（上海伍豐科學(xué)儀器有限公司）；AVANCE III-400型核磁共振儀（德國Bruker公司）；Leica DM750型顯微鏡（德國Leica公司）；LDZX-50KBS型立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安公司）；DH-600型電熱恒溫培養(yǎng)箱（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）；ZHWY-211B、ZHWY-2102C型恒溫培養(yǎng)震蕩器（上海智誠分析儀器制造有限公司）；H1650-W型離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司）。

柱色譜硅膠（80～100、200～300目）、薄層硅膠板GF254（青島海洋化工廠）；Sephadex LH-20（GE Healthcare Bio-Sciences AB）；反相硅膠（蘇州納微生物科技有限公司）；油紅O和蘇丹黑B（美國阿拉丁工業(yè)公司）；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。奧利司他（浙江海正藥業(yè)股份有限公司；規(guī)格：0.12 g/片）。

1.2 材料

黑柳樹皮藥材購于成都健騰生物技術(shù)有限公司，由西南民族大學(xué)藥學(xué)院任艷副教授鑒定為楊柳科柳屬植物黑柳Marshall的干燥樹皮，標(biāo)本保存在藥學(xué)院中藥標(biāo)本室；秀麗隱桿線蟲和大腸桿菌OP50（OP50）來源于中國科學(xué)院成都生物研究所應(yīng)用與環(huán)境微生物中心。

2. 方法

2.1 提取與分離

取干燥的黑柳樹皮藥材20 kg，粉碎后，用70%甲醇-水提取3次，濾過，濃縮，隨后加水使其成懸濁液，用正丁醇萃取得總浸膏（100.5 g）。總浸膏用純水溶解后，進(jìn)行反相柱色譜，分別以40%甲醇-水和60%甲醇-水進(jìn)行洗脫，得40%甲醇-水（A，10.5 g）、60%甲醇-水（B，15.3 g）2個(gè)組分。

40%甲醇-水組分（A，10.5 g），用正相硅膠柱色譜（200～300目）分離，以二氯乙烷-丙酮（25∶1、15∶1、10∶1、5∶1、3∶1）洗脫，共得5個(gè)組分A1～A5。化合物6（3 mg）從A2（8 mg）的甲醇溶液中以白色松軟固體析出；A3（3 g）經(jīng)半制備液相色譜（12%乙腈-水，30 mL/min）分離得到化合物8（1.1 g，R＝6 min）和10（15 mg，R＝24 min）；A4（1.2 g）進(jìn)行Sephadex LH-20柱色譜，以二氯乙烷-甲醇（1∶1）洗脫，分得3個(gè)組分A3-1～A3-3，其中A3-3（300 mg）經(jīng)半制備液相色譜分離（15 mL/min），得化合物9（22 mg，R＝16 min）；A5（3 g）用正相硅膠柱色譜（200～300目）分離，以石油醚-丙酮（2∶1）混合溶劑洗脫，得A5-1（2.4 g），A5-1經(jīng)半制備液相色譜（22%乙腈-水，30 mL/min）分離得到A5-1-1（0.65 g，R＝9.5 min）和化合物7（9 mg，R＝13 min），A5-1-1再進(jìn)行Sephadex LH-20柱色譜，以甲醇-水（1∶1）洗脫，得到化合物1（0.61 g）。

60%甲醇-水組分（B，15.3 g），經(jīng)半制備液相色譜（60%甲醇-水，50 mL/min）分離得到6個(gè)組分B1～B6。B1（2.2 g）經(jīng)半制備液相色譜（30%乙腈-水，30 mL/min）分離得B1-1（1 g，R＝5 min），B1-1用正相硅膠柱色譜（200～300目）分離，依次以二氯乙烷-丙酮（10∶1、3∶1）洗脫，得化合物11（12 mg）、4（61.6 mg）和5（130 mg）；B6（2.9 g）用正相硅膠柱色譜（200～300目）分離，分別以二氯乙烷-丙酮（25∶1、15∶1、3∶1）混合溶劑洗脫，得B6-1～B6-3，其中B6-1的甲醇溶液中析出化合物12（1.7 g），B6-2進(jìn)行Sephadex LH-20柱色譜，以甲醇-水（1∶1）為溶劑洗脫，分離得到化合物2（0.69 g）和3（8 mg）。

2.2 抑制脂肪生成活性篩選

2.2.1的培養(yǎng)與同期化 將接種于長滿OP50的線蟲生長培養(yǎng)基（nematode growth medium，NGM）上，于18.5 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5 d，約3 d轉(zhuǎn)板1次，防止線蟲過老或處于饑餓抑制狀態(tài)，同時(shí)要保證線蟲干凈[12]。培養(yǎng)完成后，選取50～70條用700 μL M9緩沖液沖洗轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP管中，離心后棄去上清液。用M9緩沖液定容至500 μL，加入等體積的現(xiàn)配裂解液，再次離心棄去上清液。加入M9緩沖液，孵化12 h，得L1期的。離心后，沉淀轉(zhuǎn)入含有OP50的NGM培養(yǎng)基上培養(yǎng)48～72 h，即可得到L4期的。

2.2.2 加樣培養(yǎng) 預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示化合物質(zhì)量濃度為50 μg/mL時(shí)抑制體內(nèi)脂肪生成的作用較強(qiáng)。因此，設(shè)置樣品質(zhì)量濃度為50 μg/mL以測定其對(duì)脂肪生成抑制活性。吸取等量配制好的樣品溶液和活化后的OP50于EP管中混合均勻，均勻涂布于NGM培養(yǎng)基上，置于恒溫培養(yǎng)箱（37 ℃）中，培養(yǎng)18 h，待NGM培養(yǎng)基上長滿OP50后，將同期化至L1期的轉(zhuǎn)移到該培養(yǎng)基上（為了方便區(qū)分，只接種于NGM培養(yǎng)基的半邊），于恒溫培養(yǎng)箱（18.5 ℃）培養(yǎng)3～5 d即可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。觀察樣品對(duì)脂肪生成的影響，陽性對(duì)照和陰性對(duì)照分別為奧利司他和DMSO。

2.2.3 油紅O染色 給藥3～5 d后，挑選出50條至EP管中，在室溫下，加入500 μL 4%多聚甲醛固定，30 min后，迅速轉(zhuǎn)移至?80 ℃的冷凍箱內(nèi)冷藏15 min，緊接著快速置于水浴鍋（43 ℃）中使之融化，其后加入700 μL M9緩沖液清洗，并于1500 r/min離心3 min后棄去上清液，重復(fù)清洗操作3次。加入油紅O染液染色12 h后，用PBS緩沖液清洗3次，置于顯微鏡下觀察、拍照[13]。

2.2.4 蘇丹黑B染色 給藥3～5 d后，挑選出50條至EP管中，在室溫下，加入500 μL 4%多聚甲醛固定，30 min后，離心棄去上清液，并依次用25%甲醇溶液、50%甲醇溶液和70%甲醇溶液（500 μL）對(duì)進(jìn)行脫水處理（8～10 min），每次脫水結(jié)束后，置于1500 r/min離心機(jī)中離心3 min，棄去上清液。脫水處理后用蘇丹黑B染液染色，浸潤，待過夜后用70%乙醇沖洗，然后再加入M9緩沖液沖洗3次，置于顯微鏡下觀察、拍照[14]。

3 結(jié)果

3.1 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：白色無定形吸濕性粉末，易溶于甲醇。分子式C20H24O10。1H-NMR (400 MHz, CD3OD): 7.32 (1H, m, H-5), 7.30 (1H, d,= 7.52 Hz, H-3), 7.20 (1H, d,= 8.1 Hz, H-6), 7.01 (1H, t,= 7.4 Hz, H-4), 6.14 (1H, dt,= 9.7, 3.8 Hz, H-11), 5.75 (1H, dt,= 9.8, 1.6 Hz, H-10), 5.37, 5.26 (各1H, d,= 12.4 Hz, H-7), 4.92 (1H, d,= 7.5 Hz, H-1′), 3.88 (1H, dd,= 12.0, 1.8 Hz, H-6a′), 3.69 (1H, dd,= 12.0, 5.2 Hz, H-6b′), 3.37～3.47 (4H, m, H-2′～5′), 2.89 (1H, m, H-13a), 2.71～2.60 (3H, m, H-12, 13b)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD): 207.5 (C-14), 171.4 (C-8), 157.0 (C-1), 133.2 (C-10), 131.1 (C-5), 130.7 (C-11), 129.4 (C-3), 125.9 (C-6), 123.4 (C-4), 117.0 (C-2), 102.3 (C-1′), 79.5 (C-9), 78.1 (C-3′), 78.0 (C-5′), 74.9 (C-2′), 71.2 (C-4′), 64.4 (C-7), 62.5 (C-6′), 36.8 (C-13), 27.2 (C-12)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)基本一致[15-16]，故鑒定化合物1為柳皮苷。

化合物2：白色無定形粉末，易溶于氯仿。分子式C27H28O11。1H-NMR (400 MHz, CDCl3): 8.00 (2H, d,= 7.3 Hz, H-3′′′, 7′′′), 7.51 (1H, t,= 7.4 Hz, H-5′′′), 7.36 (2H, t,= 7.7 Hz, H-4′′′, 6′′′), 7.24 (1H, td,= 7.9, 1.4 Hz, H-5), 7.16 (1H, dd,= 7.5, 1.0 Hz, H-3), 7.02 (1H, d,= 8.2 Hz, H-6), 6.98 (1H, t,= 7.5 Hz, H-4), 6.03 (1H, dt,= 9.6, 3.7 Hz, H-3′), 5.69 (1H, d,= 9.8 Hz, H-2′), 5.32 (1H, t,= 8.5 Hz, H-2′′), 5.15 (1H, d,= 7.8 Hz, H-1′′), 5.09, 4.95 (各1H, d,= 12.5 Hz, H-7a, 7b), 3.90 (3H, m, H-3′′～6′′), 3.52 (1H, m, H-5′′), 2.94 (1H, dt,= 14.7, 8.0 Hz, H-5′), 2.39～2.66 (3H, m, H-5′, 4′)；13C-NMR (100 MHz, CDCl3): 207.6 (C-6′), 170.0 (C-7′), 166.2 (C-1″′), 156.1 (C-1), 133.5 (C-5″′), 132.1 (C-3′), 130.0 (C-5), 129.9 (C-3″′, 7″′), 129.6 (C-2″′), 129.5 (C-3), 128.7 (C-4″′, 6″′), 127.6 (C-2), 127.4 (C-2′), 123.2 (C-4), 115.7 (C-6), 99.7 (C-1″), 78.3 (C-1′), 76.1 (C-5″), 75.0 (C-3″), 74.0 (C-2″), 70.1 (C-4″), 63.5 (C-7), 60.9 (C-6″), 35.4 (C-5′), 26.7 (C-4′)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[17]，故鑒定化合物2為特里楊苷。

化合物3：白色無定形粉末，微溶于甲醇。分子式C27H26O10。1H-NMR (400 MHz, DMSO-6): 10.43 (1H, s, 10-OH), 7.93 (2H, d,= 7.3 Hz, H-2′′, 6′′), 7.41～7.55 (3H, m, H-12, 14, 4′′), 7.40 (2H, t,= 7.8 Hz, H-3′′, 5′′), 7.35 (2H, m, H-3, 5), 7.25 (1H, d,= 8.2 Hz, H-6), 7.04 (1H, t,= 7.4 Hz, H-4), 6.95 (1H, d,= 8.3 Hz, H-11), 6.80 (1H, t,= 7.5 Hz, H-13), 5.51 (1H, d,= 5.8 Hz, 3′-OH), 5.33～5.41 (2H, m, 4′-OH, H-1′), 5.12 (2H, s, H-7), 5.05～5.11 (1H, m, H-2′), 4.74 (1H, t,= 5.5 Hz, 6′-OH), 3.78 (1H, dd,= 9.8, 5.3 Hz, H-6′), 3.71 (1H, td,= 9.2, 5.9 Hz, H-3′), 3.51～3.59 (2H, m, H-5′, 6′), 3.35 (1H, m, H-4′)；13C-NMR (100 MHz, DMSO-6): 168.7 (C-8), 165.2 (C-7″), 160.4 (C-10), 155.0 (C-1), 135.7 (C-12), 133.0 (C-4″), 130.1 (C-3, 5), 129.7 (C-14), 129.5 (C-1″), 129.3 (C-2″, 6″), 128.5 (C-3″, 5″), 124.0 (C-2), 122.2 (C-4), 119.5 (C-11), 117.3 (C-13), 115.0 (C-6), 112.7 (C-9), 98.5 (C-1′), 77.5 (C-5′), 74.3 (C-2′), 74.0 (C-3′), 70.1 (C4′), 61.7 (C-7), 60.2 (C-6′)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[18]，故鑒定化合物3為7-水楊酰-2′-苯甲酰水楊苷。

化合物4：淺黃色無定形粉末，微溶于甲醇。分子式C27H28O11。1H-NMR (600 MHz, DMSO-6): 7.95 (2H, dd,= 8.2, 1.2 Hz, H-2′′′, 6′′′), 7.58 (1H, t,= 7.4 Hz, H-4′′′), 7.46 (2H, t,= 7.8 Hz, H-3′′′, 5′′′), 7.24 (1H, t,= 6.8 Hz, H-5), 7.17 (1H, dd,= 7.6, 1.3 Hz, H-3), 7.12 (1H, d,= 8.1 Hz, H-6), 6.96 (1H, t,= 7.3 Hz, H-4), 6.03 (1H, dt,= 9.8, 3.8 Hz, H-3′′), 5.66 (1H, dt,= 9.8, 1.8 Hz, H-2′′), 5.18 (1H, d,= 13.1 Hz, H-7a), 5.14～5.07 (2H, m, H-7b, 3′), 5.02 (1H, d,= 7.7 Hz, H-1′), 3.45～3.65 (5H, m, H-2′, 4′～6′), 2.46～2.64 (4H, m, H-4′′, 5′′)；13C-NMR (150 MHz, DMSO-6): 206.1 (C-6′′), 170.1 (C-7′′), 165.4 (C-7′′′), 154.7 (C-1), 133.1 (C-4′′′), 131.7 (C-3′′), 130.4 (C-5), 129.5 (C-3, 2′′′, 6′′′), 128.8 (C-1′′′), 128.6 (C-3′′′, 5′′′), 128.4 (C-2′′), 124.6 (C-2), 122.1 (C-4), 115.1 (C-6), 100.4 (C-1′), 78.5 (C-1′′), 77.4 (C-5′), 76.7 (C-3′), 71.5 (C-2′), 67.6 (C-4′), 62.2 (C-7), 60.4 (C-6′), 35.7 (C-5′′), 26.0 (C-4′′)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[19]，故鑒定化合物4為cochinchiside A。

化合物5：白色粉末，微溶于甲醇。分子式C20H22O8。1H-NMR (400 MHz, DMSO-6): 7.99 (2H, d,= 7.5 Hz, H-2′′, 6′′), 7.65 (1H, t,= 7.3 Hz, H-4′′), 7.52 (2H, t,= 7.7 Hz, H-3′′, 5′′), 7.30 (1H, d,= 7.4 Hz, H-3), 7.17 (1H, t,= 7.5 Hz, H-5), 7.08 (1H, d,= 8.1 Hz, H-6), 6.98 (1H, t,= 7.4 Hz, H-4), 5.49 (1H, d,= 5.7 Hz, 3′-OH), 5.34 (1H, d,= 5.4 Hz, 4′-OH), 5.24 (1H, d,= 8.0 Hz, H-1′), 5.06 (1H, t,= 8.8 Hz, H-2′), 4.89 (1H, t,= 5.6 Hz, 7-OH), 4.71 (1H, t,= 5.3 Hz, 6′-OH), 4.38, 4.11 (各1H, dd,= 15.1, 5.5 Hz, H-7), 3.76 (1H, dd,= 10.3, 5.1 Hz, H-6′), 3.65～3.72 (1H, m, H-3′), 3.49～3.57 (3H, m, H-6′～4′)；13C-NMR (100 MHz, DMSO-6): 165.5 (C-7′′), 153.8 (C-1), 133.8 (C-4′′), 131.6 (C-2), 130.3 (C-1′′), 129.8 (C-2′′, 6′′), 129.2 (C-3′′, 5′′), 127.8 (C-5), 126.8 (C-3), 122.4 (C-4), 114.4 (C-6), 98.7 (C-1′), 77.7 (C-5′), 74.7 (C-2′), 74.3 (C-3′), 70.4 (C-4′), 61.0 (C-6′), 57.7 (C-7)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[18]，故鑒定化合物5為2′-苯甲酰水楊苷。

化合物6：白色固體，微溶于甲醇。分子式C35H60O6。1H-NMR (400 MHz, DMSO-6): 5.32 (1H, brs, H-6), 4.87 (3H, m, OH), 4.43 (1H, t,= 5.7 Hz, H-3), 4.20 (1H, d,= 7.7 Hz, H-1′), 2.88～3.63 (m, 5H of glucose), 0.94 (3H, s, H-19), 0.89 (3H, d,= 6.3 Hz, H-21), 0.80 (9H, overlapped, H-26, 27, 29), 0.64 (3H, s, H-18)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[20]，且與胡蘿卜苷對(duì)照品對(duì)照，多種展開體系下TLC的Rf值一致，故鑒定化合物6為胡蘿卜苷。

化合物7：白色無定形粉末，易溶于甲醇。分子式C15H20O6。1H NMR (400 MHz, CD3OD): 7.40 (2H, d,= 7.3 Hz, H-2, 6), 7.28 (2H, t,= 7.5 Hz, H-3, 5), 7.20 (1H, m, H-4), 6.67 (1H, d,= 16.0 Hz, H-7), 6.36 (1H, dt,= 16.0, 6.1 Hz, H-8), 4.52 (1H, ddd,= 12.8, 5.6, 1.3 Hz, H-9a), 4.35 (1H, d,= 7.8 Hz, H-1′), 4.31 (1H, ddd,= 12.9, 9.6, 1.1 Hz, H-9b), 3.87 (1H, d,= 11.9 Hz, H-6a′), 3.66 (1H, dd,= 11.9, 5.4 Hz, H-6b′), 3.20～3.37 (4H, overlapped, H-2′～5′)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD): 136.8 (C-1), 132.4 (C-7), 128.2 (C-3, 5), 127.3 (C-4), 126.1 (C-2, 6), 125.3 (C-8), 101.9 (C-1′), 76.7 (C-3′), 76.6 (C-5′), 73.7 (C-2′), 70.3 (C-4′), 69.3 (C-9), 61.4 (C-6′)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[21]，故鑒定化合物7為rosin。

化合物8：白色針狀結(jié)晶（甲醇），易溶于甲醇。分子式C13H18O7。1H-NMR (400 MHz, DMSO-6): 7.36 (1H, d,= 7.3 Hz, H-3), 7.19 (1H, t,= 7.2 Hz, H-5), 7.09 (1H, d,= 8.0 Hz, H-6), 7.00 (1H, t,= 7.3 Hz, H-4), 5.35 (1H, d,= 4.0 Hz, 4′-OH), 5.09 (1H, d,= 3.4 Hz, 3′-OH), 5.03 (1H, d,= 5.2 Hz, 2′-OH), 4.99 (1H, t,= 5.9 Hz, 7-OH), 4.76 (1H, d,= 7.2 Hz, H-1′), 4.64 (1H, dd,= 14.3, 5.5 Hz, H-7a), 4.59 (1H, t,= 5.7 Hz, 6′-OH), 4.46 (1H, dd,= 14.3, 6.2 Hz, H-7b), 3.74～3.66 (1H, m, H-6a′), 3.47 (1H, dt,= 11.8, 6.0 Hz, H-6b′), 3.33～3.16 (4H, m, H-2′～5′)；13C-NMR (100 MHz, DMSO-6): 155.1 (C-1), 132.4 (C-2), 128.1 (C-5), 127.7 (C-3), 122.5 (C-4), 115.4 (C-6), 101.6 (C-1′), 82.9 (C-5′), 82.3 (C-3′), 73.7 (C-2′), 70.0 (C-4′), 61.0 (C-6′), 58.8 (C-7)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[22]，故鑒定化合物8為水楊苷。

化合物9：黃色針狀結(jié)晶（甲醇），易溶于甲醇。分子式C20H22O8。1H-NMR (400 MHz, DMSO-6): 7.99 (1H, d,= 15.5 Hz, H-α), 7.64 (2H, d,= 8.4 Hz, H-2, 6), 7.60 (1H, d,= 15.6 Hz, H-β), 6.82 (2H, d,= 8.2 Hz, H-3, 5), 6.15 (1H, brs, H-5′), 5.94 (1H, brs, H-3′), 5.07 (1H, d,= 7.3 Hz, H-1′′), 3.23～3.71 (6H, m, of glucose)；13C-NMR (100 MHz, DMSO-6)191.9 (C＝O), 166.1 (C-2′), 164.8 (C-4′), 160.4 (C-4), 160.0 (C-6′), 142.7 (C-β), 130.8 (C-2, 6), 126.3 (C-1), 124.3 (C-α), 116.02 (C-3, 5), 105.3 (C-1′), 100.4 (C-1′′), 97.1 (C-3′), 94.9 (C-5′), 77.4 (C-5′′), 76.8 (C-3′′), 73.7 (C-2′′), 69.5 (C-4′′), 60.5 (C-6′′)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)基本一致[23]，故鑒定化合物9為chalcononaringenin-2′--β--glucopyranoside。

化合物10：白色粉末，易溶于甲醇。分子式C7H6O4。1H-NMR (400 MHz, CD3OD): 7.46 (1H, d,= 2.1 Hz, H-2), 7.43 (1H, dd,= 7.9, 2.1 Hz, H-6), 6.82 (1H, d,= 7.9 Hz, H-5)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD): 170.3 (C-7), 151.5 (C-4), 146.0 (C-3), 123.9 (C-1), 123.0 (C-6), 117.7 (C-2), 115.7 (C-5)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[24]，故鑒定化合物10為3,4-二羥基苯甲酸。

化合物11：白色粉末，易溶于甲醇。分子式C7H6O2。1H-NMR (400 MHz, CDCl3): 8.12 (2H, m, H-2, 6), 7.59 (1H, m, H-4), 7.46 (2H, m, H-3, 5)；13C- NMR (100 MHz, CDCl3): 172.4 (C-7), 134.0 (C-4), 130.5 (C-2, 6), 129.5 (C-1), 128.5 (C-3, 5)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[25]，故鑒定化合物11為苯甲酸。

化合物12：白色針狀結(jié)晶（甲醇），mp 160～161 ℃。在3種展開體系中TLC行為與水楊酸對(duì)照品一致，且混合熔點(diǎn)不下降。故鑒定為水楊酸。

3.2 抑制脂肪生成活性篩選結(jié)果

由于苯乙醇苷類化合物是從黑柳樹皮中分離得到的主要成分，所以本研究選擇3個(gè)代表性化合物即柳皮苷（1）、特里楊苷（2）和2′-苯甲酰水楊苷（5）進(jìn)行抑制脂肪生成活性篩選，同時(shí)也選擇了黃酮類化合物chalcononaringenin-2′--β-- glucopyranoside（9），以對(duì)比2類化合物的抑制脂肪生成活性，為后續(xù)研究提供參考。

3.2.1 油紅O染色結(jié)果 油紅O染色結(jié)果如圖1所示，脂肪率根據(jù)脂肪顆粒占線蟲整體體積的比例確定。實(shí)驗(yàn)樣品作用于后，與陰性對(duì)照組比較（脂肪率為42.05%），體內(nèi)被染色部分明顯減少，線蟲體內(nèi)脂肪率分別降低為柳皮苷11.77%、特里楊苷25.23%、2′-苯甲酰水楊苷11.35%和chalcononaringenin-2′--β--glucopyranoside 15.98%，說明4個(gè)化合物對(duì)體內(nèi)脂肪生成均有明顯的抑制作用，其中化合物1、5和9的活性強(qiáng)于陽性對(duì)照（脂肪率為21.57%）。

3.2.2 蘇丹黑B染色結(jié)果 蘇丹黑B對(duì)染色結(jié)果如圖2所示，與陰性對(duì)照組相比較（脂肪率為26.70%），可看到體內(nèi)被染成黑色的脂肪顆粒明顯減少，線蟲體內(nèi)脂肪率分別降低為柳皮苷13.35%、特里楊苷14.15%、2′-苯甲酰水楊苷10.15%和chalcononaringenin-2′--β--gluco- pyranoside 11.75%，這表明4個(gè)化合物對(duì)體內(nèi)脂肪生成均有明顯的抑制作用，且強(qiáng)于陽性對(duì)照（脂肪率為14.46%）。

4 討論

本研究從黑柳樹皮中分離鑒定了12個(gè)化學(xué)成分，包括6個(gè)水楊苷類化合物（化合物1～5和8）、1個(gè)查耳酮類化合物（化合物9）、1個(gè)甾體皂苷類化合物（化合物6）、1個(gè)苯丙烯醇苷類化合物（化合物7）和3個(gè)苯甲酸衍生物（10～12），所有化合物均為首次從黑柳中分離得到。選擇其中4個(gè)化合物進(jìn)行了線蟲體內(nèi)抑制脂肪生成活性研究，油紅O和蘇丹黑B 2種染色結(jié)果都顯示，4個(gè)化合物樣品具有較好的抑制脂肪生成的作用，其中2′-苯甲酰水楊苷（5）在2種染色實(shí)驗(yàn)中均呈現(xiàn)最強(qiáng)的抑制活性。

圖1 化合物1、2、5、9抑制C. elegans體內(nèi)脂肪生成的油紅O染色結(jié)果

圖2 化合物1、2、5、9抑制C. elegans體內(nèi)脂質(zhì)累積的蘇丹黑B染色結(jié)果

此外，通過對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的觀察，發(fā)現(xiàn)油紅O能將脂肪染成滴狀，易觀察，而蘇丹黑B很難將脂肪染成滴狀或顆粒，通常呈現(xiàn)為黑色堆積，但是蘇丹黑B能夠?qū)?nèi)脂肪顯示的更完整。因此，結(jié)合2種染色方法，才能夠更好地觀察體內(nèi)脂肪的分布和數(shù)量。

本研究首次報(bào)道了黑柳樹皮提取物的化學(xué)成分，并探究了部分化合物對(duì)脂肪生成的影響，為從該植物中發(fā)現(xiàn)具有抑制脂肪生成作用的化合物提供了一定的參考，并為黑柳植物的開發(fā)與應(yīng)用提供科學(xué)基礎(chǔ)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Chemical constituents from barks ofand its anti-adipogenic activity

LIU Huan, JIACI Lamu, PU Sha-long, ZHANG Ji-zhong, LI Li-mei

College of Pharmacy, Southwest Minzu University, Chengdu 610041, China

To study the chemical composition from the barks ofMarshall and its anti-adipogenic activity.The chemical constituents from the barks ofwere isolated by chromatographic methods and the structures of the isolated compounds were elucidated on the basis of NMR spectroscopic analyses. The anti-adipogenic activity of some compounds was evaluated inby oil red O and Sudan black B staining methods.A total of 12 compounds were isolated from barks ofand identified as salicortin (1), tremulacin (2), salicyloyltremuloidin (3), cochinchiside A (4), tremuloidin (5), daucosterol (6), rosin (7), salicin (8), chalcononaringenin-2′--β--glucopyranoside (9), 3,4-dihydroxybenzoic acid (10), benzoic acid (11), and salicylic acid (12), respectively. Among them, compounds 1, 2, 5 and 9 could significantly reduce adipose accumulation in.All twelve compounds were isolated fromfor the first time. Compound 5 exhibited the strongest effect to reduce adipose accumulation in

Marshall;; anti-adipogenic activity; salicortin; tremulacin; tremuloidin

R284.1

A

0253 - 2670(2023)13 - 4111 - 07

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.13.004

2023-01-09

大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（S202210656135）

劉 歡，本科生。E-mail: 1115935565@qq.com

通信作者：李麗梅，教授，研究方向?yàn)橹兴幣c民族藥研究與開發(fā)。E-mail: limeili@swun.edu.cn

[責(zé)任編輯 王文倩]