松針色素提取與分析

李 丹 , 趙振倫 , 劉冬然 , 閆勝利 , 劉明武

(滄州旭陽化工有限公司 , 河北 滄州 061113)

松針在我國(guó)有22種,其中有10種變種松針,另引栽培16種,其中2種是變種,為木材和樹脂生產(chǎn)的主要樹種,松針是含有多元酚類的混合物[1-3]。這種多元酚類混合物根據(jù)不同的松樹物種而變化,所以其作為樹種的化學(xué)分類標(biāo)準(zhǔn)。松針中富含葉綠素、胡蘿卜素、維生素、黃酮類化合物及植物甾醇。葉綠素具有創(chuàng)傷治愈、脫臭、抗過敏、抗?jié)?、使腸蠕動(dòng)功能亢進(jìn)、抗變異原性、抑癌、降血清膽固醇等藥理功能。這些活性物質(zhì)來自天然植物,安全性高,廣泛應(yīng)用在食品和醫(yī)藥行業(yè)。本課題主要研究從松針中提取色素的有效方法。

1 松針的提取工藝

1.1 有機(jī)溶劑提取法

有機(jī)溶劑提取法是利用有機(jī)溶劑從原料中提取有效成分的方法。選擇對(duì)目的活性成分溶解度大,對(duì)不需要溶出的成分溶解度小的溶劑。溶劑根據(jù)相似相溶原理自由擴(kuò)散,滲透作用通過細(xì)胞壁進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部,溶解可溶性物質(zhì)。細(xì)胞內(nèi)外產(chǎn)生濃度差,細(xì)胞內(nèi)的濃溶液不斷向外擴(kuò)散,溶劑又不斷進(jìn)入原料組織細(xì)胞中,多次往返,直到細(xì)胞內(nèi)外溶液濃度達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡,將此飽和溶液濾出。常見有機(jī)溶劑的親脂性強(qiáng)弱順序?yàn)?石油醚>苯>氯仿>乙醚>乙酸乙酯>丙酮>乙醇>甲醇。浸提法(萃取法)是提取色素采用最多的一種方法。將原料分選、水洗、干燥、粉碎,選用溶劑將色素成分提取出來。浸提過程中,應(yīng)該考慮原料提取溫度、提取時(shí)間、溶劑用量等影響因素,以提高色素提取率。

1.2 超聲波提取法

利用超聲波的機(jī)械振動(dòng)和空化效應(yīng)以及聚束、定向、反射和透射的特性,植物細(xì)胞壁被破壞,細(xì)胞中的有效成分被完全釋放,有效成分進(jìn)入溶劑并與溶劑充分混合[4]。超聲波法具有設(shè)備簡(jiǎn)單,操作方便,提取時(shí)間短,可加速植物活性成分在溶劑中的擴(kuò)散并提高回收率等優(yōu)點(diǎn)。此外,超聲波會(huì)產(chǎn)生副作用,如熱效應(yīng)、乳化、擴(kuò)散、粉碎、化學(xué)作用、生物效應(yīng)和凝聚作用。

本課題主要研究松針色素的提取方法。采用浸提法、超聲輔助法進(jìn)行溫度、時(shí)間、料液比等提取條件的單因素考察,確定最佳提取條件。對(duì)比兩種方法的優(yōu)缺點(diǎn),利用分光光度計(jì)法確定各色素的吸光度,通過計(jì)算確定色素含量大小。

2 實(shí)驗(yàn)

2.1 實(shí)驗(yàn)原料

丙酮,天津市大茂化學(xué)試劑廠;95%乙醇,遼寧新興試劑有限公司;石油醚,天津市大茂化學(xué)試劑廠;乙醚,天津市大茂化學(xué)試劑廠;氫氧化鈉,天津市瑞金特化學(xué)品有限公司。以上試劑均為分析純。

2.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備

可見分光光度計(jì),723PC,上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司;數(shù)顯恒溫水浴鍋,HH-S2,上海上登實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;三頻數(shù)控超聲波清洗器,KQ-200VDE,昆山市超聲儀器有限公司;電子天平,JA300N,上海佑科儀器有限責(zé)任公司。

2.3 光度定量分析

對(duì)提取液進(jìn)行定量分析。吸取1 mL濾液用對(duì)應(yīng)萃取液定容到10 mL,等待2 min,以對(duì)應(yīng)溶劑為空白對(duì)照測(cè)量葉綠素a、葉綠素b分別在663、645 nm波長(zhǎng)下的吸光度A。

2.4 色素的計(jì)算公式

利用Amon公式:

ca=12.7A663-2.69A645

(1)

cb=22.9A645-4.68A663

(2)

ca+b=(ca+cb)×稀釋倍數(shù)

(3)

依據(jù)提取液中葉綠素的總濃度,可換算出松針中總?cè)~綠素的提取率,%。

(4)

式中:ca,葉綠素a濃度,mg/L;cb,葉綠素b濃度,mg/L;ca+b,葉綠素總濃度,mg/L;V,提取液體積,mL。

2.5 實(shí)驗(yàn)步驟

2.5.1松針預(yù)處理

新鮮松針用清水洗凈,60 ℃條件下干燥1 h,剪成0.3～0.5 cm長(zhǎng)備用。

2.5.2有機(jī)溶劑的確定

取5個(gè)250 mL錐形瓶,分別加入5 g 0.3～0.5 cm松針,每個(gè)錐形瓶中加入25 mL萃取液。萃取液分別為乙醇(95%)丙酮混合溶液(體積比為1∶1)、乙醇(95%)、丙酮、石油醚、乙醚。錐形瓶放入50 ℃的超聲波箱中以頻率45 kHz提取色素,提取結(jié)束后迅速抽濾,分離得墨綠色溶液,再以同樣的方法提取一次,合并兩次濾液。提取條件:頻率45 kHz,料液比(g∶mL)為1∶5,提取時(shí)間為15 min,溫度為50 ℃,其他條件相同。吸取1 mL的濾液用對(duì)應(yīng)萃取液定容至10 mL,通過分光光度計(jì)測(cè)得波長(zhǎng)663、645 nm處對(duì)應(yīng)的吸光度值。根據(jù)公式(1)、(2)、(3)計(jì)算提取率。結(jié)果如圖1所示。

圖1 提取葉綠素溶劑種類的考察結(jié)果

由圖1可以直觀看出,乙醇(95%)丙酮混合溶液(體積比為1∶1)對(duì)葉綠素a+b的提取率較高。石油醚對(duì)葉綠素的提取率最低。選擇混合溶液(乙醇∶丙酮體積比為1∶1)作為此課題提取劑。

2.5.3浸提法

2.5.3.1最佳提取溫度的確定

取5個(gè)100 mL圓底燒瓶,分別加入5 g 0.3～0.5 cm長(zhǎng)松針,25 mL乙醇(95%)丙酮混合溶液(體積比為1∶1)。5個(gè)圓底燒瓶分別放入45、50、55、60、65 ℃的水浴鍋中回流提取3 h,提取結(jié)束后迅速抽濾,收集濾液。提取時(shí)間3 h,料液比為1∶5,其他條件相同。測(cè)量吸光度方法同上,通過計(jì)算提取率確定最佳的提取溫度。結(jié)果如圖2所示。

圖2 浸提溫度對(duì)葉綠素提取率的影響

由圖2可知,葉綠素a、葉綠素a+b的提取率在60 ℃條件下最大,葉綠素b的提取率在65 ℃條件下最大。葉綠素a、葉綠素b、葉綠素a+b提取率最高分別為0.059 9%、0.030 5%、0.086 3%。松針中葉綠素a的含量遠(yuǎn)大于葉綠素b,最佳浸提溫度為60 ℃。

2.5.3.2最佳提取時(shí)間的確定

取5個(gè)100 mL圓底燒瓶,分別加入5 g 0.3～0.5 cm長(zhǎng)松針,25 mL乙醇(95%)丙酮混合溶液(體積比為1∶1)。將5個(gè)圓底燒瓶放入實(shí)驗(yàn)(1)中確定的最佳溫度60 ℃的水浴鍋中分別回流2.5、3.0、3.5、4.0、4.5 h提取色素,迅速抽濾,分離得墨綠色溶液,收集濾液。溫度為60 ℃,料液比為1∶5,其他條件相同。測(cè)量吸光度方法同上,通過計(jì)算提取率確定最佳的時(shí)間。結(jié)果如圖3所示。

圖3 浸提提取時(shí)間對(duì)葉綠素提取率的影響

由圖3可以看出,松針在提取3.5 h條件下,葉綠素a、葉綠素b和葉綠素a+b提取率最高,提取率分別為0.072 1%、0.033 5%、0.105 6%。

2.5.3.3最佳提取料液比的確定

取5個(gè)100 mL圓底燒瓶,分別加入5 g 0.3～0.5 cm長(zhǎng)松針,按松針質(zhì)量與溶劑體積比(g∶mL)分別為1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8,加入乙醇(95%)丙酮混合溶液(體積比為1∶1)。將5個(gè)圓底燒瓶放入60 ℃水浴鍋中回流3.5 h提取色素,回流時(shí)間結(jié)束后迅速抽濾,分離得墨綠色溶液,收集濾液。溫度為60 ℃,時(shí)間為3.5 h,其他條件相同。測(cè)量吸光度方法同上,通過計(jì)算提取率確定最佳的料液比。結(jié)果如圖4所示。

圖4 浸提料液比對(duì)葉綠素提取率的影響

由圖4可知,松針在提取料液比1∶7條件下,葉綠素a、葉綠素b和葉綠素a+b提取率最高。提取率分別為0.077 3%、0.035 3%、0.112 6%。綜上所述,浸提法提取葉綠素的最佳提取條件:溫度為60 ℃、時(shí)間為3.5 h、料液比為1∶7。

2.5.4超聲輔助法

2.5.4.1最佳提取頻率的確定

取3個(gè)250 mL錐形瓶中,分別加入5 g 0.3～0.5 cm長(zhǎng)松針,25 mL乙醇(95%)丙酮混合溶液(體積比為1∶1)。將3個(gè)錐形瓶放入為50 ℃水中,分別以頻率45、80、100 kHz超聲15 min進(jìn)行提取,料液比為1∶5,溫度為50 ℃,時(shí)間為15 min,其他條件相同。提取結(jié)束后迅速抽濾,分離得墨綠色溶液,再以同樣的方法提取一次,合并兩次濾液。測(cè)量吸光度方法同上,通過計(jì)算確定最佳的頻率。結(jié)果如圖5所示。

圖5 提取頻率對(duì)葉綠素提取率的影響

由圖5可以看出,松針在45 kHz條件下,葉綠素a、葉綠素b和葉綠素a+b提取率最高。最高提取率分別為0.038 9%、0.076 2%、0.115 1%。

2.5.4.2最佳料液比的確定

取5個(gè)250 mL錐形瓶,分別加入5 g 0.3～0.5 cm長(zhǎng)松針,按松針質(zhì)量與溶劑體積比(g∶mL)分別為1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8,加入乙醇(95%)丙酮混合溶液(體積比為1∶1)。將5個(gè)錐形瓶放入50 ℃水中,以45 kHz頻率超聲15 min進(jìn)行提取。頻率為45 kHz,溫度為50 ℃,時(shí)間為15 min,其他條件相同。提取結(jié)束后迅速抽濾,再以同樣的方法提取一次,合并兩次濾液。測(cè)量吸光度方法同上,通過計(jì)算提取率確定最佳提取的料液比。結(jié)果如圖6所示。

圖6 超聲輔助法料液比對(duì)葉綠素提取率的影響

由圖6可以看出,松針在提取料液比1∶5條件下,葉綠素a、葉綠素b和葉綠素a+b提取率最高。提取率分別為0.076 5%、0.045 1%、0.121 6%。

2.5.4.3最佳提取溫度的確定

取5個(gè)250 mL錐形瓶,分別加入5 g 0.3～0.5 cm長(zhǎng)松針、25 mL乙醇(95%)丙酮混合溶液(體積比為1∶1)。5個(gè)錐形瓶分別放入20、30、40、50、60、70 ℃進(jìn)行提取。頻率為45 kHz,料液比為1∶5,時(shí)間為15 min,其他條件相同。提取結(jié)束后迅速抽濾,再以同樣的方法提取一次,合并兩次濾液。測(cè)量吸光度方法同上,通過計(jì)算提取率確定最佳提取的溫度。結(jié)果如圖7所示。

圖7 提取溫度對(duì)葉綠素提取率的影響

由圖7可以看出,松針在提取溫度60 ℃條件下,葉綠素a、葉綠素b和葉綠素a+b提取率最高。提取率分別為0.065 1%、0.032 1%、0.097 2%。

2.5.4.4最佳提取時(shí)間的確定

頻率為45 kHz,料液比為1∶5,溫度為60 ℃,其他條件相同。取5個(gè)250 mL錐形瓶,分別加入5 g 0.3～0.5 cm長(zhǎng)松針、25 mL乙醇(95%)丙酮混合溶液(體積比為1∶1)。放入水溫為60 ℃,以頻率45 kHz分別超聲9、11、13、15、17 min進(jìn)行提取。提取結(jié)束后迅速抽濾,再以同樣的方法提取一次,合并兩次濾液。測(cè)量吸光度方法同上,通過計(jì)算提取率確定最佳提取的時(shí)間。結(jié)果如圖8所示。

圖8 提取時(shí)間對(duì)松針中葉綠素提取率的影響

由圖8可知,松針在提取時(shí)間15 min條件下,葉綠素a、葉綠素a+b和葉綠素b的提取率最高。提取率分別為0.087 9%、0.049 9%、0.137 8%。

2.6 浸提和超聲輔助條件實(shí)驗(yàn)結(jié)果的比較

浸提法與超聲輔助法提取葉綠素的比較如表1所示。

表1 浸提與超聲輔助的比較

由表1可知,超聲波提取法比浸提法對(duì)葉綠素a、葉綠素b、葉綠素a+b的提取率均高。超聲波提取法最高提取率為0.137 8%。超聲輔助法所需提取時(shí)間短、節(jié)省原料。浸提法最佳提取條件:溫度60 ℃,時(shí)間3.5 h,料液比1∶7;超聲輔助法最佳提取條件:頻率45 kHz,料液比1∶5,溫度60 ℃,時(shí)間15 min。

3 結(jié)論

①浸提法提取松針葉綠素的最佳提取條件: 乙醇(95%)丙酮混合溶液(體積比為1∶1)作提取劑,溫度為60 ℃,料液比為1∶7,時(shí)間為3.5 h。在此條件下葉綠素a提取率為0.077 3%,葉綠素b提取率為0.035 3%,葉綠素a+b提取率為0.112 6%。②超聲輔助法提取松針葉綠素最佳提取條件:乙醇(95%)丙酮混合溶液(體積比為1∶1)作提取劑,頻率為45 kHz,料液比為1∶5,溫度為60 ℃,時(shí)間為15 min。在此條件下葉綠素a提取率為0.087 9%,葉綠素b提取率為0.049 9%,葉綠素a+b提取率為0.137 8%。③超聲波提取法比浸提法對(duì)葉綠素a、葉綠素b、葉綠素a+b的提取率均高。超聲波提取法最高提取率為0.137 8%。超聲輔助法所需提取時(shí)間短、節(jié)省原料。