山萘酚調(diào)控VPS9D1-AS1/miR-377-3p對(duì)人宮頸癌細(xì)胞系SiHa增殖和凋亡的影響

張禹鑫，朱紫薇，張 燕，胡玉紅

佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院 婦產(chǎn)科，黑龍江 佳木斯 154000

宮頸癌起源于子宮頸的上皮贅生性轉(zhuǎn)化,是全世界婦女與癌相關(guān)死亡的第四大原因[1-2]。尋找更有效的抑制宮頸癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的新藥將有助于宮頸癌的治療。作為一種從蔬菜和水果中分離出來(lái)的天然類黃酮化合物,山萘酚(kaempferol)具有豐富的藥理特性,例如抗菌、抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗糖尿病和心臟保護(hù)活性[3-4],因此,引起了越來(lái)越多的關(guān)注。迄今為止已經(jīng)在多種惡性腫瘤中進(jìn)行了山萘酚的研究。例如,山萘酚可以抑制卵巢癌[5]、乳腺癌[6]和非小細(xì)胞肺癌[7]的細(xì)胞增殖。但山萘酚在宮頸癌中的系統(tǒng)性作用尚不清楚。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)和微小RNA(microRNA,miRNA)是調(diào)控生物過(guò)程和病理進(jìn)展的重要因子,近年來(lái)備受關(guān)注。根據(jù)競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA(competing endogenous RNA,ceRNA)理論,lncRNA競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合并螯合某些miRNA,隨后釋放miRNA靶基因并增加轉(zhuǎn)錄和翻譯產(chǎn)物的水平[8]。LncRNA VPS9D1反義RNA 1(VPS9D1 antisense RNA 1,VPS9D1-AS1)可作為miR-525-5p的分子海綿,促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的致癌性[9]。VPS9D1-AS1敲低可抑制急性髓細(xì)胞性白血病細(xì)胞增殖,阻滯細(xì)胞周期以及抑制皮下腫瘤的形成。此外,VPS9D1-AS1敲低增強(qiáng)了新型組蛋白脫乙酰基酶抑制劑chidamide對(duì)急性髓細(xì)胞性白血病細(xì)胞增殖的抑制作用[10]。miR-377-3p在宮頸癌中低表達(dá)[11],其下調(diào)可預(yù)測(cè)宮頸癌患者的不良預(yù)后,miR-377-3p過(guò)表達(dá)抑制宮頸癌中的細(xì)胞侵襲遷移和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[12]。此外,山萘酚通過(guò)下調(diào)miRNA抑制肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[13]。但是,尚無(wú)有關(guān)山萘酚對(duì)宮頸癌細(xì)胞中VPS9D1-AS1/miR-377-3p表達(dá)的影響的報(bào)告。因此,本研究擬探討山萘酚對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移侵襲和凋亡以及VPS9D1-AS1/miR-377-3p表達(dá)的影響,以闡明其可能的分子途徑,進(jìn)而,有助于進(jìn)一步了解山萘酚對(duì)宮頸癌的抗癌作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞:人宮頸癌細(xì)胞系SiHa(武漢普諾賽生命科技有限公司),在37 ℃、5% CO2的條件下,于補(bǔ)充10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

1.1.2 試劑:Lipofectamine 2000(Invitrogen公司);si-NC、si-VPS9D1-AS1、pcDNA-VPS9D1-AS1、miR-377-3p抑制劑(anti-miR-377-3p)、miR-377-3p模擬物和miR-NC(GenePharma公司);Annexin V-FITC/碘化丙錠(propidium iodide,PI)試劑盒(武漢艾美捷科技有限公司),BCA蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司),抗Bcl-2和抗Bax抗體(Abcam Biotechnology公司),質(zhì)粒pmirGLO(Promega Corporation公司);PrimeScript RT試劑盒和SYBR Premix Ex TaqTM(TaKaRa公司)以及All-in-OneTMmiRNA RT-qPCR檢測(cè)試劑盒(GeneCopoeia公司)。山萘酚(kaempferol,25 mg,含量≥97.0%;Sigma-Aldrich公司),溶解并于二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)中儲(chǔ)存。然后,將山萘酚溶液通過(guò)0.22 μm的過(guò)濾器滅菌,并在-4 ℃下保存。用時(shí)用RPMI-1640將山奈酚溶液稀釋至實(shí)驗(yàn)濃度5 μmol/L、10 μmol/L和20 μmol/L。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的分組:將細(xì)胞分為對(duì)照組、山萘酚低、中、高劑量組(5、10和20 μmol/L山萘酚作用24 h組[7])、si-NC組(轉(zhuǎn)染si-NC)、si-VPS9D1-AS1組(轉(zhuǎn)染si-VPS9D1-AS1)、山萘酚+pcDNA-VPS9D1-AS1組(20 mg/L山萘酚+轉(zhuǎn)染pcDNA-VPS9D1-AS1)、山萘酚+anti-miR-377-3p組(20 mg/L山萘酚+轉(zhuǎn)染anti-miR-377-3p)。轉(zhuǎn)染前24 h,將細(xì)胞接種到6孔板中,當(dāng)細(xì)胞達(dá)到50%匯合時(shí),根據(jù)Lipofectamine 2000的說(shuō)明手冊(cè)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。孵育6～8 h后,用含20 mg/L山萘酚或不含山萘酚的完全培養(yǎng)基更新培養(yǎng)基。進(jìn)一步孵育24～48 h后,收獲細(xì)胞。用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction,RT-qPCR)評(píng)估轉(zhuǎn)染效率。

1.2.2 RT-qPCR檢測(cè)mRNA:用試劑Trizol分離細(xì)胞(1×105)總RNA,并在NanoDrop 2000分光光度計(jì)上定量。用PrimeScript RT試劑盒和SYBR Premix Ex TaqTM測(cè)量VPS9D1-AS1表達(dá)水平,以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)作為對(duì)照。用All-in-OneTMmiRNA RT-qPCR檢測(cè)試劑盒確定miR-377-3p表達(dá),以U6作為對(duì)照。在Thermal Cycler CFX6系統(tǒng)上進(jìn)行RT-qPCR,用2-△△Ct方法進(jìn)行計(jì)算。引物序列如下:VPS9D1-AS1(F:5′-AGTGGCCGTTTTACA GAGACA-3′,R:5′-CATGCCAAGCTACGGGAAGG-3′)。miR-377-3p(F:5′-GGGAGGCAGTGTATTGTT A-3′,R:5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′);GAPDH(F:5′-TGTTCGTCATGGGTGTGAGA-3′,R:5′-ATGG CATGGACTGTGGTCAT-3′)和U6(F:5′-ATTGGAA CGATACAGAGAAGATT-3′,R:5′-GGAACGCTTCAC ACATTA TT-3′)。

1.2.3 MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖:將轉(zhuǎn)染細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液,然后將細(xì)胞(每個(gè)孔1×104個(gè)細(xì)胞)鋪在96孔板中,在37 ℃和5% CO2下培養(yǎng)24～72 h。加5% MTT溶液(20 μL/孔)孵育4 h。之后,在黑暗中加DMSO(100 μL/孔),以溶解結(jié)晶。隨后,用酶標(biāo)儀,在490 nm的波長(zhǎng)下測(cè)試吸光度(A)。以時(shí)間為X軸,吸光度(A)為Y軸,繪制細(xì)胞的增殖曲線。

1.2.4 集落形成實(shí)驗(yàn):處理細(xì)胞后,分別接種在6孔板(500個(gè)細(xì)胞/孔)中,孵育2周。當(dāng)用肉眼觀察到克隆斑點(diǎn)時(shí),終止培養(yǎng)。甲醇固定細(xì)胞,并用結(jié)晶紫染色。在光學(xué)顯微鏡下觀察超過(guò)50個(gè)細(xì)胞形成的集落數(shù)。

1.2.5 流式細(xì)胞測(cè)量術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡:用結(jié)合緩沖液將SiHa細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液。隨后,將細(xì)胞與annexin V-FITC一起孵育,然后在黑暗條件下與PI進(jìn)一步孵育5 min。采用流式細(xì)胞儀測(cè)量細(xì)胞凋亡率(%)。

1.2.6 Western blot檢測(cè)蛋白質(zhì):細(xì)胞經(jīng)過(guò)相關(guān)處理或轉(zhuǎn)染后,以400 μL RIPA裂解緩沖液在冰上裂解細(xì)胞30 min,分離總蛋白質(zhì)。使用BCA蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)的濃度。Western blot用Bio-Rad Bis-Tris凝膠系統(tǒng)。蛋白質(zhì)經(jīng)酰胺凝膠電泳分離,然后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜膜上,與抗Bax和抗Bcl-2抗體(1∶1 000)一起孵育后,再與山羊抗兔IgG-辣根過(guò)氧化物酶(HRP)在室溫下孵育1 h,然后轉(zhuǎn)移至Bio-Rad ChemiDocTMXRS系統(tǒng),在膜表面上補(bǔ)充化學(xué)發(fā)光底物,以GAPDH為對(duì)照,使用Image Lab軟件對(duì)條帶的強(qiáng)度進(jìn)行定量。

1.2.7 劃痕試驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞遷移:將細(xì)胞接種在6孔板中,與10%胎牛血清一起孵育過(guò)夜。當(dāng)細(xì)胞匯合達(dá)到90%～100%時(shí),用微量移液器吸頭在板底部進(jìn)行垂直線性刮擦。之后,將細(xì)胞再次與無(wú)血清培養(yǎng)基一起孵育。在刮擦后第0 h和24 h在倒置顯微鏡下觀察遷移距離并拍照,ImageJ軟件分析遷移距離(μm)。

1.2.8 Transwell小室法測(cè)定細(xì)胞侵襲:Transwell頂室涂有用RPMI-1640稀釋至50 μg/mL的Matrigel,以覆蓋聚碳酸酯膜。通過(guò)無(wú)血清培養(yǎng)基將不同處理的細(xì)胞(1×104個(gè)細(xì)胞/mL)制備成單細(xì)胞懸液,并接種到頂室中。繼而,將含有20%胎牛血清的RPMI-1640(600 μL)添加到Transwell底室。孵育48 h后,使用棉簽小心地擦除頂室中未穿透膜的細(xì)胞,立即用甲醇固定-結(jié)晶紫染色,并在顯微鏡下,對(duì)3個(gè)隨機(jī)選擇的區(qū)域中底室穿透膜的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.2.9 熒光素酶活性檢測(cè)VPS9D1-AS1和miR-377-3p的結(jié)合位點(diǎn):將含miR-377-3p結(jié)合位點(diǎn)的野生型(wt)和突變型(mut)-VPS9D1-AS1片段插入pmirGLO質(zhì)粒中,以合成報(bào)告基因質(zhì)粒wt-VPS9D1-AS1和mut-VPS9D1-AS1。將細(xì)胞接種到6孔板中,用lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染wt-VPS9D1-AS1、mut-VPS9D1-AS1和miR-NC、miR-377-3p模擬物。48 h后在Dual-Luciferase Reporter Assay系統(tǒng)中確定熒光素酶相對(duì)活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 山萘酚對(duì)SiHa增殖、凋亡及Bax/Bcl-2蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組相比,山萘酚低劑量、中劑量和高劑量組SiHa細(xì)胞中VPS9D1-AS1表達(dá)水平逐漸降低,miR-377-3p表達(dá)水平逐漸升高;集落形成數(shù)依次減少,凋亡率和Bax蛋白表達(dá)水平逐漸升高,Bcl-2蛋白表達(dá)水平以及48 h和72 h的細(xì)胞活性逐漸降低;變化均呈濃度依賴性(P<0.05)(表1,圖1)。

表1 山萘酚抑制SiHa集落形成誘導(dǎo)凋亡

*P<0.05 compared with the control group; #P<0.05 compared with the 5 μmol/L of kaempferol; △P<0.05 compared with the 10 μmol/L of kaempferol.

2.2 山萘酚對(duì)SiHa遷移和侵襲的影響

與對(duì)照組相比,山萘酚低劑量、中劑量和高劑量組SiHa細(xì)胞的遷移距離和侵襲細(xì)胞數(shù)依次降低,均呈濃度依賴性(P<0.05)(圖2,表2)。

表2 山萘酚抑制SiHa遷移侵襲

圖2 山萘酚對(duì)SiHa細(xì)胞遷移(A)和侵襲(B)的影響

2.3 沉默VPS9D1-AS1對(duì)SiHa增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響

Si-VPS9D1-AS1組VPS9D1-AS1表達(dá)水平低于si-NC組,miR-377-3p表達(dá)水平高于si-NC組,集落形成數(shù)少于si-NC組,凋亡率和Bax蛋白表達(dá)水平高于si-NC組,Bcl-2蛋白表達(dá)水平、48和72 h細(xì)胞活性、遷移距離和侵襲細(xì)胞數(shù)均低于si-NC組(P<0.05)(圖3,表3)。

表3 沉默VPS9D1-AS1誘導(dǎo)SiHa細(xì)胞凋亡而抑制細(xì)胞集落形成、遷移和侵襲

*P<0.05 compared with si-NC.

2.4 VPS9D1-AS1靶向miR-377-3p

軟件starbase預(yù)測(cè)的VPS9D1-AS1和miR-377-3p的互補(bǔ)序列如圖4A所示。miR-377-3p與wt-VPS9D1-AS1共轉(zhuǎn)染的熒光素酶活性比miR-NC與wt-VPS9D1-AS1共轉(zhuǎn)染低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖4B)。

A.complementary sequences of VPS9D1-AS1and miR-377-3p predicted by soft ware star base; B.detection of luciferase activity; *P<0.05 compared with miR-NC.

2.5 過(guò)表達(dá)VPS9D1-AS1或抑制miR-377-3p對(duì)山萘酚處理的SiHa細(xì)胞增殖和凋亡的影響

與山萘酚組相比,山萘酚+pcDNA-VPS9D1-AS1組SiHa細(xì)胞的VPS9D1-AS1表達(dá)水平升高,山萘酚+pcDNA-VPS9D1-AS1組或山萘酚+anti-miR-377-3p組miR-377-3p表達(dá)水平降低,集落形成數(shù)增加,凋亡率、Bax蛋白表達(dá)水平減少,Bcl-2蛋白表達(dá)水平、48 h的細(xì)胞活性和72 h的細(xì)胞活性增加(P<0.05)(圖5,表4)。

表4 過(guò)表達(dá)VPS9D1-AS1或抑制miR-377-3p逆轉(zhuǎn)山萘酚對(duì)SiHa增殖和凋亡的影響

*P<0.05 compared with the control; #P<0.05 compared with kaempferol.

2.6 過(guò)表達(dá)VPS9D1-AS1或抑制miR-377-3p對(duì)山萘酚處理的SiHa細(xì)胞遷移和侵襲的影響

山萘酚組與對(duì)照組相比的結(jié)果同2.2。與山萘酚組相比,山萘酚+pcDNA-VPS9D1-AS1組或山萘酚+anti-miR-377-3p組SiHa細(xì)胞遷移距離和侵襲細(xì)胞數(shù)增加(P<0.05)(圖6,表5)。

表5 過(guò)表達(dá)VPS9D1-AS1或抑制miR-377-3p逆轉(zhuǎn)山萘酚對(duì)SiHa細(xì)胞遷移和侵襲的作用

圖6 過(guò)表達(dá)VPS9D1-AS1或抑制miR-377-3p逆轉(zhuǎn)山萘酚對(duì)SiHa細(xì)胞遷移(A)和侵襲(B)的影響

3 討論

抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移以及誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡是最有效的癌治療方法[13],山萘酚對(duì)不同類型的癌均具有治療作用,并且人們正在考慮將其作為可能的治療癌方法。本研究結(jié)果顯示,在山萘酚治療癌細(xì)胞中發(fā)揮促凋亡作用的Bax表達(dá)增加,發(fā)揮抗凋亡作用的Bcl-2表達(dá)減少,5、10和20 μmol/L山萘酚以濃度依賴方式抑制宮頸癌SiHa細(xì)胞的活性,集落形成,遷移和侵襲。同時(shí),山萘酚以濃度依賴方式促進(jìn)SiHa細(xì)胞的凋亡。進(jìn)一步證實(shí),山萘酚對(duì)宮頸癌的有效抗腫瘤作用,與先前的研究[7]一致。

VPS9D1-AS1是許多癌的重要調(diào)控因子,該因子的缺失可抑制癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲,促進(jìn)細(xì)胞凋亡,而VPS9D1-AS1過(guò)表達(dá)導(dǎo)致相反的結(jié)果,但VPS9D1-AS1對(duì)于宮頸癌的作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究。本研究顯示,沉默VPS9D1-AS1可促進(jìn)SiHa細(xì)胞凋亡,抑制細(xì)胞活性、集落形成、遷移和侵襲,在宮頸癌中同樣具有促癌作用,可望成為宮頸癌診斷和治療的新靶標(biāo)。由于miRNA在控制轉(zhuǎn)移和細(xì)胞凋亡中的作用,miRNA既可作為抑癌劑又可作為癌基因來(lái)調(diào)節(jié)宮頸癌進(jìn)程。為了進(jìn)一步揭示VPS9D1-AS1的促癌機(jī)制,本研究使用starbase鑒別可能與VPS9D1-AS1相互作用的miRNA miR-377-3p。熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)顯示,miR-377-3p可以直接與宮頸癌細(xì)胞中的VPS9D1-AS1結(jié)合。此外,在宮頸癌SiHa細(xì)胞中,沉默VPS9D1-AS1可負(fù)調(diào)控miR-377-3p水平。一些藥物可以通過(guò)調(diào)節(jié)癌細(xì)胞中的lncRNA的表達(dá)來(lái)抑制癌細(xì)胞的生物行為[13]。先前的研究表明,山萘酚通過(guò)上調(diào)人肺癌細(xì)胞中的miR-340抑制增殖但增加凋亡和自噬[14]。但山萘酚是否通過(guò)VPS9D1-AS1/miR-377-3p影響宮頸癌的細(xì)胞行為尚未明確。本研究發(fā)現(xiàn),5、10或20 μmol/L山萘酚可下調(diào)SiHa細(xì)胞中VPS9D1-AS1的表達(dá),上調(diào)miR-377-3p的表達(dá),并呈現(xiàn)濃度依賴性。此外,過(guò)表達(dá)VPS9D1-AS1或抑制miR-377-3p明顯逆轉(zhuǎn)了山萘酚對(duì)SiHa細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響。綜合這些結(jié)果表明,VPS9D1-AS1和miR-377-3p參與了山萘酚對(duì)宮頸癌細(xì)胞的作用,并提示山萘酚通過(guò)下調(diào)VPS9D1-AS1靶向miR-377-3p而對(duì)宮頸癌發(fā)揮抗腫瘤作用。

綜上所述,山萘酚可通過(guò)調(diào)控VPS9D1-AS1/miR-377-3p誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞凋亡,并抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。本研究有助于了解山萘酚對(duì)宮頸癌的抗癌作用,為深入探索山萘酚對(duì)宮頸癌的治療提供理論依據(jù)。