小檗堿激活SIRT1/AMPK信號(hào)通路改善高糖誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞異常增殖和自噬功能

楊 琳,王蓉蓉,郭小雨,唐麗琴,2,魏 偉

糖尿病腎病(diabetic nephropathy, DN)是糖尿病常見(jiàn)的慢性并發(fā)癥之一,由于腎小球及血管病變而導(dǎo)致的蛋白尿排泄增多以及腎功能異常[1],病因復(fù)雜,病情反復(fù)。DN在病理上主要表現(xiàn)為腎小球結(jié)構(gòu)肥大、細(xì)胞外基質(zhì)積聚、足細(xì)胞損傷和系膜細(xì)胞(mesangial cells, MCs)異常增殖等[2]。沉默信息調(diào)節(jié)因子1(silencing regulatory factor 1,SIRT1)/腺苷酸活化蛋白激酶(adenylate activated protein kinase,AMPK)信號(hào)通路存在相互調(diào)控的關(guān)系,SIRT1是一種依賴性脫乙酰酶,可以使AMPK蛋白脫乙?；?參與炎性反應(yīng)的調(diào)節(jié),減緩DN發(fā)生及發(fā)展[3]。已有研究[4]表明,DN的發(fā)病機(jī)制可能與系膜細(xì)胞自噬水平失調(diào)有關(guān)。小檗堿(berberine,BBR)是一種季銨類生物堿,見(jiàn)于許多植物中,藥理作用主要有抗炎抗腫瘤、促進(jìn)胰島素分泌和保護(hù)腎臟[5]的作用等。課題組前期研究[6]表明,BBR可以通過(guò)多種途徑改善DN。該課題研究了BBR能夠改善高糖誘導(dǎo)的MCs的異常增殖、降低ECM沉積并提高自噬水平等保護(hù)作用,其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)SIRT1/AMPK信號(hào)通路有關(guān),以期為探尋DN治療靶點(diǎn)提供新思路。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞腎小球系膜細(xì)胞(CL-0470)購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.2 藥物BBR(BWC9020-2016):分子量371.81,購(gòu)自北京北方偉業(yè)計(jì)量技術(shù)研究院,通過(guò)HPLC法測(cè)定純度≥98%。

1.3 試劑DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司(貨號(hào):SH30021.01);AMPK抑制劑購(gòu)自美國(guó)默克公司(CC,貨號(hào):171260);細(xì)胞爬片、一抗稀釋液、胰酶購(gòu)自美國(guó)Biosharp公司;胎牛血清購(gòu)自加拿大Wisent公司;兔抗 Col-IV 抗體、鼠抗Sirt1抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司(貨號(hào):ab6586、ab110304);兔抗LC3B抗體、兔抗AMPK抗體、兔抗 p-AMPK 抗體、兔抗p65 抗體、兔抗p-p65抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司(貨號(hào):3868S、5831、2535T、8242S、3033);兔抗Beclin1抗體、兔抗p62抗體、羊抗兔熒光二抗、羊抗小鼠熒光二抗(貨號(hào):R1509-1、HA721171、HA1121、HA1125)購(gòu)自杭州華安生物技術(shù)有限公司;鼠抗 FN抗體購(gòu)自武漢Proteintech公司(貨號(hào):66042-1-Ig)。

1.4 儀器化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(型號(hào):ImageQuant,美國(guó)GE公司);酶標(biāo)儀(型號(hào):Infinite M1000 PRO,瑞士TECAN公司);高內(nèi)涵細(xì)胞成像(型號(hào):Image Xpress Micro 4,美國(guó)Molecular Devcies 公司);正置熒光顯微鏡(型號(hào):DM2500,德國(guó)萊卡公司)。

1.5 方法

1.5.1細(xì)胞培養(yǎng) 凍存細(xì)胞用37 ℃水浴并混勻1～2 min至完全融化,離心去上清液,加入含有10%血清、1%雙抗的低糖培養(yǎng)液,反復(fù)吹打后放置于在37 ℃含5% CO2和95%濕空氣中孵育。

1.5.2細(xì)胞增殖 將消化下來(lái)的細(xì)胞接種在96孔板中(1 000個(gè)/孔),細(xì)胞貼壁后隨機(jī)分為5組,即正常組(Control組,葡萄糖濃度 11.1 mmol/L)、模型組(HG組,葡萄糖濃度 30 mmol/L)和不同濃度 BBR 給藥組(30、60、90 μmol/L)。24 h后吸出廢液,預(yù)冷的4%多聚甲醛固定30 min, 5% BSA封閉30 min,用錫紙包住96孔板,接著加入DAPI 20 μl染核5 min,最后用高內(nèi)涵成像儀拍攝細(xì)胞,計(jì)算各組系膜細(xì)胞數(shù)量并分析。

1.5.3免疫熒光法檢測(cè)ECM沉積蛋白的表達(dá) 24孔板內(nèi)加入無(wú)菌蓋玻片,再以1×104個(gè)/孔密度的細(xì)胞懸液加入到孔板中,分別加刺激和給藥。24 h后洗去上層死細(xì)胞,依次加入預(yù)冷的4%多聚甲醛固定30 min,0.1% Triton X-100通透細(xì)胞5 min,5% BSA封閉30 min,加入比例為1 ∶100的抗體,次日用錫紙包住24孔板,隨后加入相對(duì)應(yīng)的熒光二抗(1 ∶100)37 ℃ 暗處孵育 2 h,DAPI染液100 μl染核10 min;最后滴加熒光淬滅劑,于488 nm 激發(fā)光觀察并拍照。

1.5.4Western blot檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá) 將消化下來(lái)的細(xì)胞接種在6孔板中(1×108個(gè)/孔),分別加刺激和給藥同1.5.2項(xiàng),培養(yǎng)24 h后吸去廢液,預(yù)冷RIPA加PMSF后,放于冰上1 h使之完全裂解,將裂解后的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至EP管并離心,定量后將蛋白進(jìn)行SDS-PAGE 電泳,再分別孵育蛋白對(duì)應(yīng)抗體,過(guò)夜后加入二抗(1 ∶1 000)搖床孵育2 h,最后洗膜并用顯影儀上檢測(cè)后保存結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 BBR對(duì)MCs增殖的影響高內(nèi)涵實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與對(duì)照組(Control組)(2 032.88±34.80)比較,高糖組(HG組)(7 126.33±24.29)MCs增殖能力增加(F=303,P<0.01);與高糖組比較,BBR治療組(30、60、90 μmol/L)能明顯抑制MCs異常增殖 (5 652.39±36.86,4 402.34±31.40,2 317.05±11.19)。見(jiàn)圖1。

圖1 BBR對(duì)MCs增殖的影響 ×200

2.2 BBR對(duì)ECM沉積蛋白表達(dá)的影響免疫熒光結(jié)果顯示(圖2A),與對(duì)照組比較(1.661±0.305,1.674±0.151),高糖組(5.232±0.765,3.904±0.693)MCs中FN和Col-IV的熒光強(qiáng)度增加(F=188.4、55.88,P<0.01);與高糖組比較,BBR 治療組(2.001±0.235,1.872±0.09)MCs中FN和Col-IV的熒光強(qiáng)度降低。Western blot結(jié)果顯示(圖2B),與對(duì)照組比較,高糖組MCs中FN和Col-IV蛋白表達(dá)量增加(F=16.63、2.63,P<0.01);與高糖組比較,BBR治療組(90 μmol/L)MCs中FN和Col-IV的蛋白表達(dá)量降低。

2.3 BBR對(duì)MCs上SIRT1、p-AMPK、p-p65蛋白表達(dá)的影響Western blot結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,高糖組MCs上SIRT1、p-AMPK蛋白表達(dá)量下降(F=24.73、26.50,P<0.01),p-p65蛋白表達(dá)量上升(F=7.448,P<0.01);與高糖組比較,BBR治療組(30、60、90 μmol/L)MCs上SIRT1、p-AMPK蛋白的表達(dá)量上升,p-p65蛋白表達(dá)量下降。見(jiàn)圖3。

圖 2 BBR對(duì)ECM沉積蛋白表達(dá)的影響

圖3 BBR對(duì)SIRT1、p-AMPK、p-p65蛋白表達(dá)的影響

2.4 BBR對(duì)MCs上LC3B、Beclin-1、p62蛋白表達(dá)的影響Western blot結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,高糖組MCs上LC3B、Beclin-1蛋白表達(dá)量下降(F=9.572、3.194,P<0.01), p62蛋白表達(dá)上升(F=3.154,P<0.01);與高糖組比較,BBR 治療組(30、60、90 μmol/L)MCs上LC3B、Beclin-1蛋白表達(dá)量上升,p62蛋白表達(dá)量下降。見(jiàn)圖4。

圖4 BBR對(duì)LC3B、Beclin-1、p62蛋白表達(dá)的影響

2.5 BBR聯(lián)合CC后對(duì)MCs增殖和自噬的影響Western blot結(jié)果顯示(圖5A),高糖組MCs上SIRT1、p-AMPK蛋白表達(dá)量下降(F=14.46、65.72,P<0.01);與高糖組比較,BBR治療組(90 μmol/L)MCs上SIRT1、p-AMPK蛋白的表達(dá)量上升,與BBR治療組(90 μmol/L)比較,BBR(90 μmol/L)+CC組MCs上SIRT1、p-AMPK蛋白的表達(dá)量下降。高內(nèi)涵(圖5B)和免疫熒光(圖5C)結(jié)果顯示,BBR治療組(90 μmol/L)能抑制高糖誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞增殖,促進(jìn)系膜細(xì)胞自噬(0.922±0.055),而加入AMPK抑制劑后(0.613±0.068),這種作用被部分抵消。

圖5 BBR聯(lián)合CC后對(duì)MCs增殖和自噬的影響

3 討論

數(shù)據(jù)顯示,中國(guó)糖尿病患者約1.409億,占全球第一,30%～40%的糖尿病患者有進(jìn)展為DN的高風(fēng)險(xiǎn)[7]。DN的發(fā)生受多種因素調(diào)控,如遺傳因素、多元醇積聚、腎臟纖維化、炎性反應(yīng)機(jī)制等[8]。腎小球系膜區(qū)包括MCs和系膜基質(zhì),MCs內(nèi)有較強(qiáng)的收縮系統(tǒng),刺激細(xì)胞內(nèi)可收縮的纖維絲收縮,從而調(diào)節(jié)毛細(xì)血管表面積[9]。MCs的異常增殖及大量ECM的產(chǎn)生是導(dǎo)致腎小球纖維化主要始動(dòng)因素,MCs增殖會(huì)導(dǎo)致鄰近的毛細(xì)血管血流循環(huán)障礙,血管壓力增大,濾過(guò)率下降,而細(xì)胞外基質(zhì)沉積進(jìn)一步壓迫毛細(xì)血管,加重了腎損傷,已有研究[6,10]表明,高糖能促進(jìn)細(xì)胞的增殖和細(xì)胞外基質(zhì)沉積。近年來(lái),自噬是腎臟疾病的研究熱點(diǎn),參與了多種腎臟疾病的過(guò)程。高糖刺激MCs會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)受損蛋白和細(xì)胞器堆積,自噬體能把受損物質(zhì)包裹起來(lái)并與溶酶體融合,細(xì)胞內(nèi)蛋白和細(xì)胞器被溶酶體消化代謝,自噬體減少,加重了腎纖維化[11]。本次研究結(jié)果顯示,使用30 mmol/L葡萄糖刺激MCs 24 h后,檢測(cè)顯示MCs細(xì)胞數(shù)增多,細(xì)胞增殖明顯,細(xì)胞外基質(zhì)FN和Col-IV的表達(dá)水平升高,MCs上LC3B、Beclin-1自噬蛋白水平降低,p62蛋白水平升高。

SIRT1與AMPK存在相互調(diào)節(jié)的關(guān)系,SIRT1屬于sirtuins蛋白質(zhì)家族,它是與機(jī)體能量代謝密切相關(guān)的蛋白。AMPK是一個(gè)復(fù)雜的異源三聚體,是由α,β和γ亞基及其各自的結(jié)構(gòu)域組成,α亞基包含關(guān)鍵的殘基THr 172,它可以被上游激酶磷酸化,有研究[12]顯示,小檗堿可以通過(guò)激活A(yù)MPK磷酸化位點(diǎn)THr172改善衰老有關(guān)疾病。SIRT1可以激活A(yù)MPK上游分子LKB1,使AMPK磷酸化,AMPK同樣可以使細(xì)胞內(nèi)NAD+增多反過(guò)來(lái)激活SIRT1,而SIRT1可與p65蛋白的亞基相互作用,使p65去乙酰化,p65蛋白表達(dá)降低,減少腎損傷的發(fā)生。此外,AMPK的激活可以調(diào)節(jié)代謝水平,減少ATP消耗,增加ATP的產(chǎn)生。研究[13]表明,人參皂苷Rb2通過(guò)激活 Sirt1和AMPK恢復(fù)自噬來(lái)緩解肝脂堆積。BBR可促進(jìn)AMPK激活,增強(qiáng)自噬作用,抑制高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷[14]。在DN模型中,CC作為AMPK抑制劑,可以阻斷AMPK通路后導(dǎo)致MCs異常增殖和ECM沉積。以上研究表明通過(guò)激活SIRT1/AMPK信號(hào)通路,加強(qiáng)了自噬作用,改善了細(xì)胞異常增殖,發(fā)揮保護(hù)腎臟的作用。

BBR是生活中治療胃腸道疾病的常用藥物,其藥理作用十分廣泛,研究表明,BBR在抗氧化、抗菌、神經(jīng)保護(hù)、糖尿病以及心血管疾病等同樣具有比較好的生物效應(yīng)[15]。該實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè) SIRT1/AMPK信號(hào)通路的相關(guān)蛋白表明,HG 刺激MCs后,MCs發(fā)生異常增殖和細(xì)胞外基質(zhì)沉積、細(xì)胞自噬水平降低及細(xì)胞SIRT1/AMPK信號(hào)通路失活,BBR 給藥后MCs發(fā)生異常增殖和細(xì)胞外基質(zhì)堆積現(xiàn)象隨之減輕,細(xì)胞自噬水平增加并激活了SIRT1/AMPK信號(hào)通路,而BBR聯(lián)合AMPK抑制劑CC后,細(xì)胞內(nèi)SIRT1/AMPK通路蛋白減少,MCs發(fā)生異常增殖并抑制了自噬的形成。