失血性休克患者外周血自噬標(biāo)志基因表達(dá)水平與合并臟器損傷的相關(guān)性

林雪容,王 佳,張志斌,朱麗娟

(河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院急診科,河北 張家口 075000)

失血性休克是快速大量失血后發(fā)生的全身性缺血缺氧性病理?yè)p害,是創(chuàng)傷后出現(xiàn)的嚴(yán)重并發(fā)癥之一、也是創(chuàng)傷導(dǎo)致死亡的主要原因之一。失血性休克的特征是有效循環(huán)血量迅速減少后出現(xiàn)全身微循環(huán)障礙、臟器血流灌注不足,嚴(yán)重者會(huì)導(dǎo)致多個(gè)臟器功能損害、增加病死率［1-2］。因此,深入認(rèn)識(shí)失血性休克發(fā)生發(fā)展過(guò)程中臟器損傷的特點(diǎn)及相關(guān)分子生物學(xué)機(jī)制,有助于發(fā)現(xiàn)保護(hù)臟器功能、提高失血性休克及救治成功率的分子靶點(diǎn)。細(xì)胞自噬是機(jī)體在缺血、缺氧、應(yīng)激、炎癥等病理刺激下維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的重要生物學(xué)機(jī)制,在進(jìn)化上高度保守,其特征是細(xì)胞通過(guò)降解自身細(xì)胞器及大分子來(lái)對(duì)抗各種病理?yè)p傷條件、維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定［3-4］。在膿毒癥誘導(dǎo)臟器損傷的模型中自噬顯著激活、多種自噬標(biāo)志基因表達(dá)增加,激活自噬顯著減輕膿毒癥模型中臟器損傷的程度［5-6］。本研究將在失血性休克患者中觀察自噬的變化情況,具體分析失血性休克患者外周血自噬標(biāo)志基因表達(dá)水平與合并臟器損傷的相關(guān)性。報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2020年6月—2022年8月我院收治的失血性休克患者128例作為失血性休克組,納入標(biāo)準(zhǔn):①符合《創(chuàng)傷失血性休克診治中國(guó)急診專(zhuān)家共識(shí)》［7］中相關(guān)的診斷標(biāo)準(zhǔn);②入院后留取外周血標(biāo)本用于自噬標(biāo)志基因表達(dá)水平的檢測(cè);③研究所需的臨床資料完整;④取得患者或家屬的知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn):①合并原發(fā)性心臟、肝臟、腎臟疾病;②失血性休克的原發(fā)病因合并有肝臟損傷、腎臟損傷。選擇同期收治的創(chuàng)傷出血且未合并休克的患者54例作為創(chuàng)傷出血對(duì)照組,體檢的健康志愿者150例作為健康對(duì)照組。失血性休克組中男性71例、女性57例,年齡 27～72歲,平均(47.69±9.23)歲,體重指數(shù)22.83±5.42 ,接受手術(shù)治療95例,合并高血壓22例、糖尿病13例、高脂血癥18例;創(chuàng)傷出血對(duì)照組中男性28例、女性26例,年齡29～68歲,平均(45.69±6.54)歲,體重指數(shù)22.62±5.51,合并高血壓9例、糖尿病4例、高脂血癥8例;健康對(duì)照組中男性84例、女性66例,年齡 28～68歲,平均(46.81±8.59)歲,體重指數(shù)23.12±6.23,合并高血壓17例、糖尿病11例、高脂血癥14例。3組一般資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。

本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過(guò)。

1.2外周血自噬標(biāo)志基因表達(dá)水平的檢測(cè) 所有受試者抽取外周靜脈血5 mL,采用淋巴細(xì)胞分離液(上海碧云天公司)分離外周靜脈血中的淋巴細(xì)胞,加入裂解液(上海碧云天公司)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行超聲破碎,提取細(xì)胞中的蛋白,采用BCA試劑盒(上海碧云天公司)檢測(cè)蛋白濃度后將含有30 μg蛋白的樣本加入SDS-聚丙烯酰胺凝膠,在凝膠中電泳分離蛋白,將蛋白從凝膠電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。將膜放入5%脫脂牛奶中、室溫孵育1 h,洗膜3次后將膜放入1∶1 000稀釋的Beclin-1、自噬相關(guān)蛋白5(Autophagy protein 5,Atg5)一抗(Abcam公司)或1∶2 500稀釋的β-actin一抗(Sigma公司)中、4 ℃孵育過(guò)夜。次日,洗膜3次后將膜放入1∶2 000稀釋的二抗中室溫孵育1h,最后在凝膠成像儀(Bio-rad公司)中顯影得到蛋白條帶,根據(jù)條帶灰度值、以β-actin為內(nèi)參計(jì)算Beclin-1、Atg5的表達(dá)水平。

1.3失血性休克病情嚴(yán)重程度的評(píng)估 參照指南［8］,根據(jù)入院時(shí)的傷情評(píng)價(jià)損傷嚴(yán)重度評(píng)分(injury severity score,ISS);根據(jù)失血性休克患者入院后24 h內(nèi)各項(xiàng)指標(biāo)的最差值計(jì)算急性生理和慢性健康評(píng)分Ⅱ(acute physiologyand chronic health evaluation Ⅱ,APACHEⅡ)評(píng)分以及序貫器官衰竭(sequentital organ failure assessment,SOFA)評(píng)分。APACHE Ⅱ及SOFA得分越高,失血性休克病情越嚴(yán)重。

1.4失血性休克患者臟器損傷的評(píng)估 入院后24 h內(nèi)進(jìn)行臟器損傷的評(píng)估。根據(jù)《中國(guó)急性心力衰竭急診臨床實(shí)踐指南(2017)》［9］評(píng)價(jià)失血性休克入院后是否發(fā)生急性心力衰竭,標(biāo)準(zhǔn)如下:肺部濕啰音或哮鳴音,頸靜脈充盈或肝頸靜脈反流、下肢水腫,N末端B型利鈉肽原(N-terminal pro B type natriuretic peptide,NT-proBNP)升高,胸片及超聲心動(dòng)圖可見(jiàn)心臟擴(kuò)大、胸腔積液;根據(jù)KDIGO標(biāo)準(zhǔn)［10］評(píng)價(jià)失血性休克入院后是否發(fā)生急性腎損傷,標(biāo)準(zhǔn)如下:入院后48 h內(nèi)血肌酐(serum creatine,SCr)升高≥26.5 μmol/L或SCr較基礎(chǔ)值升高1.5倍以上。根據(jù)《肝衰竭診治指南(2018年版)》［11］評(píng)價(jià)失血性休克入院后是否發(fā)生急性肝損傷,標(biāo)準(zhǔn)如下:血清總膽紅素≥34.2 μmol/L,血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alanineaminotransferase,ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase,AST)與正常值比較高出超過(guò)2倍。

1.5臟器損害相關(guān)輔助檢查 入院后抽取失血性休克組患者的外周靜脈血,采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)NT-proBNP、TBIL、ALT、AST、SCr、血尿素氮(blood urea nitrogen,BUN),進(jìn)行心臟彩色多普勒超聲檢查,測(cè)定左心室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction,LVEF)。

1.6觀察指標(biāo) ①比較3組外周血Beclin-1、自噬相關(guān)蛋白5(autophagy protein 5,Atg5)蛋白表達(dá)水平。②比較是否發(fā)生急性心力衰竭、急性肝損傷、急性腎損傷的失血性休克患者Beclin-1、Atg5蛋白表達(dá)水平。③分析失血性休克患者Beclin-1、Atg5蛋白與損傷嚴(yán)重度評(píng)分、急性生理和慢性健康評(píng)分Ⅱ、序貫器官衰竭評(píng)分的相關(guān)性。④分析Beclin-1、Atg5蛋白與NNT-proBNP、TBIL、ALT、AST、SCr、BUN、LVEF的相關(guān)性。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件和Prism 6.0軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)、單因素方差分析和SNK-q檢驗(yàn),相關(guān)性分析采用Pearson檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.13組外周血自噬標(biāo)志基因表達(dá)比較 失血性休克組患者入院時(shí)外周血中自噬標(biāo)志基因Beclin-1、Atg5蛋白表達(dá)水平高于創(chuàng)傷出血對(duì)照組和健康對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);創(chuàng)傷出血對(duì)照組和健康對(duì)照組外周血中自噬標(biāo)志基因Beclin-1、Atg5蛋白表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖1、見(jiàn)表1。

表1 3組外周血自噬標(biāo)志基因Beclin-1、Atg5表達(dá)比較Table 1 Comparison of the expression of autophagy marker genes Beclin-1 and Atg5 in peripheral blood in three groups

表1 3組外周血自噬標(biāo)志基因Beclin-1、Atg5表達(dá)比較Table 1 Comparison of the expression of autophagy marker genes Beclin-1 and Atg5 in peripheral blood in three groups

組別例數(shù)Beclin-1/β-actinAtg5/β-actin失血性休克組1280.83±0.140.89±0.16創(chuàng)傷出血對(duì)照組540.53±0.07*0.36±0.06*健康對(duì)照組1500.49±0.08*0.32±0.06* F值36.29955.437 P值<0.001<0.001

*P值<0.05與失血性休克組比較(SNK-q檢驗(yàn))

圖1 3組外周血自噬標(biāo)志基因Beclin-1、Atg5的蛋白條帶

2.2是否發(fā)生臟器損害失血性休克組患者外周血自噬標(biāo)志基因表達(dá)比較 發(fā)生心力衰竭、腎損傷、肝損傷的失血性休克患者入院時(shí)外周血中自噬標(biāo)志基因Beclin-1、Atg5的蛋白表達(dá)水平低于未發(fā)生心力衰竭、腎損傷、肝損傷的患者,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 失血性休克組患者外周血自噬標(biāo)志基因表達(dá)與發(fā)生臟器損害的關(guān)系Table 2 Relationship between autophagy marker gene expression in peripheral blood and organ injury in hemorrhagic shock group

表2 失血性休克組患者外周血自噬標(biāo)志基因表達(dá)與發(fā)生臟器損害的關(guān)系Table 2 Relationship between autophagy marker gene expression in peripheral blood and organ injury in hemorrhagic shock group

臟器損害類(lèi)型例數(shù)Beclin-1Atg5心力衰竭 是830.74±0.150.79±0.17 否450.99±0.171.08±0.21 t值8.5878.479 P值<0.001<0.001腎損傷 是780.71±0.150.80±0.16 否501.02±0.191.03±0.20 t值10.0757.099 P值<0.001<0.001肝損傷 是850.76±0.140.84±0.17 否430.96±0.180.98±0.19 t值6.9184.267 P值<0.001<0.001

2.3失血性休克組患者外周血自噬標(biāo)志基因表達(dá)與病情嚴(yán)重程度的相關(guān)性 失血性休克組患者入院時(shí)外周血中自噬標(biāo)志基因Beclin-1、Atg5的蛋白表達(dá)水平與ISS評(píng)分、APACHE Ⅱ評(píng)分、SOFA評(píng)分呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 失血性休克組患者外周血自噬標(biāo)志基因表達(dá)與病情嚴(yán)重程度的關(guān)系Table 3 Relationship between autophagy marker gene expression in peripheral blood and severity of disease in hemorrhagic shock patients

2.4失血性休克組患者外周血自噬標(biāo)志基因表達(dá)與臟器損害相關(guān)輔助檢查指標(biāo)的相關(guān)性 失血性休克組患者入院時(shí)外周血中自噬標(biāo)志基因Beclin-1、Atg5的蛋白表達(dá)水平與NT-proBNP、SCr、BUN、TBIL、ALT、AST呈負(fù)相關(guān),與LVEF呈正相關(guān)(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 失血性休克組患者外周血自噬標(biāo)志基因表達(dá)與臟器損害相關(guān)輔助檢查指標(biāo)的關(guān)系Table 4 Relationship between autophagy marker gene expression in peripheral blood and auxiliary examination indexes related to organ injury in hemorrhagic shock group

3 討 論

創(chuàng)傷是全球范圍內(nèi)僅次于心血管疾病和惡性腫瘤的第三位死亡因素,創(chuàng)傷導(dǎo)致的失血性休克是導(dǎo)致死亡的首要原因。創(chuàng)傷患者發(fā)生失血性休克后會(huì)出現(xiàn)臟器灌注不足及缺血缺氧、導(dǎo)致臟器功能損傷,嚴(yán)重者會(huì)發(fā)展為多器官功能障礙、顯著增加疾病的救治難度及患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)。因此,深入認(rèn)識(shí)缺血性休克病情進(jìn)展過(guò)程中臟器功能損傷的特點(diǎn)及相關(guān)的分子生物學(xué)機(jī)制對(duì)指導(dǎo)臨床治療具有重要的意義。

細(xì)胞自噬是一種高度保守的細(xì)胞分解代謝過(guò)程,受損或過(guò)剩的細(xì)胞成分、蛋白質(zhì)和細(xì)胞器被隔離在雙膜自噬體中,而后轉(zhuǎn)移到溶酶體中形成自噬溶酶體并在各種生理和病理過(guò)程中進(jìn)行降解和再循環(huán)。在缺血缺氧、炎癥打擊、應(yīng)激刺激等病理?xiàng)l件下,自噬激活有利于維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、增強(qiáng)想對(duì)抗各種病理?xiàng)l件的能力。多項(xiàng)基礎(chǔ)研究證實(shí),失血性休克動(dòng)物模型中細(xì)胞自噬被激活,多種改善失血性休克的干預(yù)手段通過(guò)激活自噬發(fā)揮作用［12-13］?；谏鲜龌A(chǔ)研究的結(jié)果,本研究觀察了失血性休克患者體內(nèi)自噬標(biāo)志基因表示水平的變化。外周血Beclin-1、Atg5表達(dá)水平是目前國(guó)內(nèi)外臨床研究評(píng)價(jià)患者自噬的常用標(biāo)志基因［14-15］。本研究結(jié)果顯示,失血性休克患者外周血中Beclin-1、Atg5的表達(dá)水平高于創(chuàng)傷出血對(duì)照組和健康對(duì)照組,與失血性休克動(dòng)物模型中自噬被激活的結(jié)果吻合;進(jìn)一步分析自噬水平與失血性休克的病情可知:外周血Beclin-1、Atg5的表達(dá)水平與APACHE Ⅱ評(píng)分、SOFA評(píng)分呈負(fù)相關(guān),表明失血性休克患者自噬激活越明顯、休克病情越輕,與基礎(chǔ)研究中自噬激活改善失血性休克病情的結(jié)果吻合。

失血性休克導(dǎo)致的臟器損傷主要累積心臟、肝臟和腎臟,表現(xiàn)為急性心力衰竭、急性肝損傷、急性腎損傷［16-17］。近些年關(guān)于自噬相關(guān)的研究證實(shí),自噬在急性心力衰竭、急性肝損傷、急性腎損傷中發(fā)揮保護(hù)作用,激活自噬能夠促進(jìn)炎癥因子、活性氧等損傷介質(zhì)的清除,進(jìn)而減輕臟器損傷［18］。本研究對(duì)失血性休克發(fā)病過(guò)程中自噬激活與臟器損傷的關(guān)系進(jìn)行分析,入院時(shí),失血性休克患者外周血中Beclin-1、Atg5的表達(dá)水平與心功能、肝功能、腎功能損傷呈負(fù)相關(guān);入院后治療過(guò)程中發(fā)生心力衰竭、肝損傷、腎損傷的失血性休克患者外周血中Beclin-1、Atg5的表達(dá)水平低于未發(fā)生心力衰竭、肝損傷、腎損傷的失血性休克患者。表明失血性休克發(fā)病過(guò)程中自噬激活對(duì)心臟、肝臟和腎臟具有保護(hù)作用,自噬激活越顯著,發(fā)病時(shí)及發(fā)病后的治療過(guò)程中心力衰竭、肝損傷、腎損傷的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)越低。

綜上所述,失血性休克患者外周血中自噬標(biāo)志基因表達(dá)增加能夠起到代償性的保護(hù)作用,與病情加重、臟器損傷程度均呈負(fù)相關(guān)。表明細(xì)胞自噬在失血性休克發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起到臟器保護(hù)作用,減輕心臟、肝臟、腎臟損傷,降低心力衰竭、肝損傷、腎損傷的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn),這為今后發(fā)現(xiàn)失血性休克救治過(guò)程中保護(hù)臟器功能、降低病死率的分子靶點(diǎn)提供了依據(jù)。