3種柳樹花粉最適貯藏溫度及離體培養(yǎng)基研究

郭嬌嬌 王春榮 王志彬

摘要 ?為了解不同柳樹品種花粉貯藏的適宜條件及最適離體培養(yǎng)基，以粉枝柳、黃花柳、旱柳3種柳樹花粉為試驗材料，采集新鮮花粉進行離體培養(yǎng)，以篩選適宜培養(yǎng)基，并將花粉分別置于室溫20～25、4、-5、-20 ℃條件下干燥貯藏后，通過測定花粉萌發(fā)率，篩選適宜的貯藏條件。結果顯示：粉枝柳和旱柳花粉在100 g/L蔗糖+100 mg/L硼酸的培養(yǎng)基中萌發(fā)情況較好，黃花柳則在50 g/L蔗糖+100 mg/L硼酸中萌發(fā)率較高。隨著貯藏時間的延長，貯藏溫度越低，3種柳樹花粉貯藏效果越好。在-20 ℃干燥情況下，3種柳樹花粉貯藏60 d后仍可保持較高的萌發(fā)率，萌發(fā)率分別為粉枝柳42.6%，旱柳39.5%，黃花柳29.5%；而室溫條件下貯藏12～15 d基本喪失活力。

關鍵詞 ?柳樹；花粉；萌發(fā)率；離體培養(yǎng)

中圖分類號 ?S 722.3 ??文獻標識碼 ?A ??文章編號 ?0517-6611（2023）05-0123-03

doi： 10.3969/j.issn.0517-6611.2023.05.028

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Study on Suitable Storage Temperature and Culture Medium of Three Species of Willow Pollen

GUO Jiao-jiao1，WANG Chun-rong1，WANG Zhi-bin2

（1.Hebei Academy of Forestry and Grasslands Science，Shijiazhuang， Hebei 050061；2.Zhangjiakou Jinshatan Forest Farm，Huai’an， Hebei 076150）

Abstract ?The fresh pollens were collected to filter the suitable in vitro culture condition from three kinds of willows which were used as the experiment material. Fresh pollens were collected for in vitro culture to screen the appropriate medium， and the pollens were dried at room temperature 20-25， 4， -5， -20 ℃ respectively， and then the appropriate storage conditions were selected by measuring the pollen germination rate.The results showed that pollen of Salix rorida and Salix matsudana germinated better in the medium of 100 g/L sucrose+100 mg/L boric acid， while that of Salix citrosa germinated higher in the medium of 50 g/L sucrose+100 mg/L boric acid. With the prolongation of storage time， the lower the storage temperature of the three willow species， the better the pollen storage effect. Under the dry condition of -20 ℃， the pollen of the three willow species could still maintain a high germination rate after 60 days of storage. The germination rates were 42.6% for Salix rorida， 39.5% for Salix matsudana， and 29.5% for Salix caprea; However， after 12-15 days storage at room temperature， the vitality of the cells almost completely lost.

Key words ?Willow;Pollen;Germination rate;In vitro culture

柳樹是楊柳科柳屬（Salix）植物，是水土保持、防風固沙、四旁綠化的優(yōu)良樹種，同時也是進行木本植物遺傳學與基因組學研究的模式樹種［1-2］。柳樹為雌雄異株植物，不同品種柳樹的花期不同，且有些花期相對較短，因此花期不遇成為柳樹優(yōu)良品種雜交選育工作中面臨的難題之一。花粉收集貯藏是解決這一難題的有效手段，它可以有效破除雜交親本所受的花期與地域限制，擴大雜交親本的選擇范圍，從而大大提高獲得優(yōu)良新品種的機會［3-7］。因此，如何使長期貯藏后的花粉仍然保持較高活力成為研究的關鍵。目前關于柳樹花粉貯藏的研究報道相對較少，且多集中于不同花粉活力測定方法的比較研究。王偉偉等［1，8-11］對藍墨水、TTC、I2-KI、醋酸洋紅等染色法及離體培養(yǎng)法等幾種常見花粉活力檢測方法進行了對比研究，發(fā)現(xiàn)染色法更適用于花粉活力的快速測定，但是由于染色法均是依靠花粉中的淀粉、脫氫輔酶等不同物質染色，花粉失活后這些物質或酶的活性仍然存在，而且很多染色法的染色界限并不明顯，這將導致染色法的測定結果會出現(xiàn)一定程度的偏差，而離體培養(yǎng)法測定的數(shù)據(jù)更為準確。筆者選取3個柳樹品種進行花粉離體培養(yǎng)，研究3種柳樹花粉在不同貯藏溫度下花粉萌發(fā)率隨貯藏時間的變化規(guī)律，研究3種柳樹花粉的適宜貯藏溫度，以期為解 決柳樹雜交育種工作中花期不遇問題提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為2021年4月初采集的粉枝柳、黃花柳和旱柳的未開放花枝，其中粉枝柳和黃花柳花枝采集于張家口赤城黑龍山，旱柳花枝采集于河北農(nóng)業(yè)大學校園內(nèi)。

1.2 試驗方法

1.2.1 ???花粉采集與貯藏。

挑選生長健壯的柳樹植株，采集花芽飽滿的未開放花枝帶回，裝于玻璃瓶中進行水培。為避免花序盛開后花粉混合，對3個品種枝條分別進行隔離。待雄花盛開后，用鑷子取下花序并在硫酸紙上輕輕磕碰、晃動使花粉墜落，并用花粉篩篩取花粉、去除雜質。將收集的花粉分裝在盛有變色硅膠的離心管中密封，標記好品種名稱及采集時間。將密封的離心管分別置于室溫20～25、4、-5、-20 ℃的貯藏條件中干燥封存，待后期試驗使用。

1.2.2 ???花粉萌發(fā)適宜培養(yǎng)基的篩選。

選取蔗糖和硼酸作為影響因子，分別設定4個濃度水平，進行2因素4水平完全試驗（表1）。在不同配比的培養(yǎng)基上分別進行花粉離體培養(yǎng)試驗，根據(jù)各培養(yǎng)基中花粉萌發(fā)結果確定3種柳樹較為適宜的培養(yǎng)基配比。通過前期預試驗已確定當培養(yǎng)基中瓊脂的質量濃度為8 g/L時，培養(yǎng)基不會出現(xiàn)低溫凝固現(xiàn)象，便于在培養(yǎng)基上鋪灑花粉及培養(yǎng)觀察。

1.2.3 ???花粉萌發(fā)率的測定。

采用離體培養(yǎng)法進行花粉萌發(fā)率的測定。用一次性塑料滴管吸取培養(yǎng)基溶液，立即滴1滴于雙凹載玻片的2個凹槽中央，使其完全鋪滿凹槽，凹槽弧面需盡量薄， 否則會降低透光性，影響觀察。取少量花粉在硫酸紙上，用筆頭松軟的小毛筆垂直輕蘸花粉，在距離載玻片一定高度的位置輕彈毛筆，使花粉均勻分布到培養(yǎng)基上。在載玻片上用記號筆標記好花粉種類及貯藏溫度。每個花粉處理設置3個重復。將載玻片放入鋪有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，置于25 ℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，取出載玻片用顯微鏡觀察并統(tǒng)計花粉萌發(fā)狀況，每個凹槽選取8～10個視野?；ǚ酃艿拈L度等于或大于花粉粒直徑即視為萌發(fā)［12-14］。

2 結果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基對3種柳樹花粉萌發(fā)率的影響

將3種柳樹的新鮮花粉分別在不同配比的培養(yǎng)基上進行離體培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h后各培養(yǎng)基的花粉萌發(fā)情況見圖1。從圖1可見，粉枝柳、旱柳和黃花柳3種柳樹花粉在A4B3和A4B4 2種配比中均未萌發(fā)，在其余培養(yǎng)基中的萌發(fā)率波動較大，但規(guī)律不同。粉枝柳和旱柳在A2B1中花粉萌發(fā)率相對更高，黃花柳則在A1B1中萌發(fā)率較高。

根據(jù)極差分析（表2）可知，粉枝柳和黃花柳RA>RB，旱柳RA<RB，說明粉枝柳和黃花柳花粉萌發(fā)受蔗糖濃度的影響大于受硼酸濃度影響，而旱柳則受硼酸濃度影響較大。比較蔗糖不同水平的效果，黃花柳表現(xiàn)為水平1>水平2>水平3>水平4，說明蔗糖濃度越高，黃花柳的花粉萌發(fā)率越低；粉枝柳和旱柳的花粉萌發(fā)率變化趨勢不一致，但均以水平2最高。比較硼酸不同濃度水平下柳樹花粉萌發(fā)效果，發(fā)現(xiàn)3個柳樹花粉萌發(fā)率總體隨硼酸濃度的增高而降低。綜合分析可知，粉枝柳和旱柳的最適宜培養(yǎng)基為A2B1，而黃花柳則在A1B1培養(yǎng)基中花粉萌發(fā)率最高。

2.2 貯藏溫度對3種柳樹花粉萌發(fā)率的影響

2.2.1 ???貯藏溫度對粉枝柳花粉萌發(fā)率的影響。

由圖2可知，粉枝柳在各溫度條件下，貯藏3 d內(nèi)花粉萌發(fā)率下降程度相近；室溫條件下3 d后萌發(fā)率降低速度開始加劇，貯藏7 d，花粉萌發(fā)率降低至52.1%，15 d萌發(fā)率降至10%以下。4 ℃條件下，貯藏3 d后萌發(fā)率開始快速下降，貯藏10 d萌發(fā)率顯著下降為65.5%。-5和-20 ℃條件下，花粉萌發(fā)率在前15 d相近，之后差異逐步增大；-5 ℃條件下，貯藏15 d后萌發(fā)率與初始萌發(fā)率出現(xiàn)差異，貯藏60 d萌發(fā)率仍可達27.3%。-20 ℃條件下，粉枝柳花粉萌發(fā)率下降最為緩慢，貯藏28 d后萌發(fā)率與-5 ℃條件下差異增大，貯藏60 d萌發(fā)率仍有42.6%。

2.2.2 ???貯藏溫度對旱柳花粉萌發(fā)率的影響。

由圖3可知，旱柳花粉在室溫條件下貯藏3 d萌發(fā)率出現(xiàn)差異，貯藏7 d萌發(fā)率降為51.0%。4 ℃條件下，旱柳花粉萌發(fā)率隨時間的延長緩慢下降，貯藏28 d后萌發(fā)率下降至48.3%。-5和-20 ℃條件下貯藏21 d時旱柳花粉萌發(fā)率與初始仍較為接近。-5 ℃條件下貯藏38 d花粉萌發(fā)率降至54.3%，而-20 ℃條件下貯藏50 d花粉萌發(fā)率降至51.7%。

2.2.3 ???貯藏溫度對黃花柳花粉萌發(fā)率的影響。

從圖4可見，隨著時間的推移，黃花柳在室溫條件下花粉萌發(fā)率下降較快，貯藏12 d即降至10%以下。-5和-20 ℃前15 d的萌發(fā)率變化不明顯，后期下降速率出現(xiàn)差異，-5 ℃條件下貯藏21 d萌發(fā)率下降至52.0%，貯藏56 d萌發(fā)率降至7.8%；-20 ℃條件下貯藏28 d時萌發(fā)率為55%，貯藏60 d萌發(fā)率仍可達29.5%。4 ℃條件下花粉萌發(fā)率較-5和-20 ℃條件下下降速度較快，貯藏21 d時萌發(fā)率顯著下降至47.4%，貯藏50 d萌發(fā)率降至10%以下。

3 結論與討論

蔗糖是植物生長的重要能源物質和滲透調(diào)節(jié)物質［1］，蔗糖濃度過高會導致花粉失水、質壁分離，抑制花粉的萌發(fā)，適宜的蔗糖濃度可以在一定程度上緩解花粉破裂，維持滲透平衡。在培養(yǎng)基中添加一定濃度的硼酸有利于花粉萌發(fā)和花粉管的生長［15-16］。該研究結果表明，粉枝柳、旱柳、黃花柳3種柳樹花粉萌發(fā)的適宜硼酸濃度為100 mg/L，而粉枝柳和旱柳花粉萌發(fā)適宜的蔗糖濃度為100 g/L，黃花柳的適宜蔗糖濃度為50 g/L。

不同植物花粉在不同貯藏條件下的萌發(fā)率均有所不同。杜克兵等［3，6］研究表明，楊樹花粉在-20 ℃條件貯藏效果最好，長期貯藏則應選擇干燥密封超低溫冷凍（-80 ℃）；樸永 浩等［17］對8個梨品種的花粉貯藏研究發(fā)現(xiàn)，在冰箱冷藏室中干燥密封貯藏1年的花粉仍具有較高的發(fā)芽率；劉贏男等［4］研究發(fā)現(xiàn)，3 ℃低溫冷藏是山梅花植物的最佳貯藏條件。而該研究中3種柳樹-20 ℃條件下干燥貯藏可保持最高萌發(fā)率，可見 不同植物間花粉所適宜的最佳貯藏條件存在顯著差異。

該研究結果表明，粉枝柳、旱柳和黃花柳花粉萌發(fā)率在不同貯藏溫度條件下隨貯藏時間的變化趨勢基本一致。隨著貯藏時間的延長，花粉的萌發(fā)率逐漸降低；在貯藏3 d后，溫度越高花粉萌發(fā)率下降速度越快。室溫條件下3種柳樹花粉萌發(fā)率迅速降低，12～15 d花粉萌發(fā)率降至10%以下；在低溫貯藏條件下，3種柳樹花粉的貯藏期明顯增長。-20 ℃條件下，貯藏初期花粉仍保持較高的萌發(fā)率，21 d后萌發(fā)率下降較快，貯藏60 d 3種柳樹花粉的萌發(fā)率在29.5%～42.6%，而室溫條件下貯藏12～15 d花粉基本喪失活力。這可能是由于低溫可使花粉代謝受到抑制，酶的活性減弱［18-20］，呼吸作用降低，因此可以使花粉維持較長時間的活力。

參考文獻

［1］ ?王偉偉，姚玲，何開躍，等.不同柳樹花粉離體培養(yǎng)及活力測定方法比較研究［J］.江蘇林業(yè)科技，2018，45（4）：1-7.

［2］ 王源秀，江聰，徐立安.柳樹花粉生活力分析［J］.林業(yè)科技開發(fā)，2007，21（1）：28-30.

［3］ 杜克兵，沈寶仙，許林，等.不同貯藏條件下楊樹花粉活力變化及隔年雜交授粉應用的可行性研究［J］.華中農(nóng)業(yè)大學學報，2007，26（3）：385-389.

［4］ 劉贏男，周丹，劉瑋，等.不同培養(yǎng)基及貯藏條件對山梅花屬植物花粉生活力的影響［J］.東北林業(yè)大學學報，2011，39（12）：47-48，79.

［5］ 彭向永，劉俊祥，李振堅，等.蒿柳花粉離體萌發(fā)及花粉管生長特性［J］.北京林業(yè)大學學報，2017，39（3）：81-86.

［6］ 孫超，臺秀國，楊振亞，等.不同貯藏溫度對4種楊樹花粉生活力的影響［J］.山東科學，2015，28（1）：109-113.

［7］ 李亞軍，黃河，牛雅靜，等.10個菊花品種花粉生活力測定和貯藏方法研究［J］.福建農(nóng)業(yè)學報，2020，35（3）：295-302.

［8］ 王欽麗，盧龍斗，吳小琴，等.花粉的保存及其生活力測定［J］.植物學通報，2002，19（3）：365-373.

［9］ 左丹丹，明軍，劉春，等.植物花粉生活力檢測技術進展［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學，2007，35（16）：4742-4745.

［10］ ?王玲，祝朋芳，毛洪玉.不同培養(yǎng)基及不同貯藏條件對金娃娃萱草花粉生命力的影響［J］.西北林學院學報，2009，24（3）：95-97，108.

［11］ 劉潔云，吳艷艷，牟海飛，等.黃百香果花粉離體培養(yǎng)基篩選及貯藏試驗［J］.西南農(nóng)業(yè)學報，2021，34（8）：1699-1704.

［12］ 姜雪婷，杜玉虎，張紹鈴，等.梨43個品種花粉生活力及4種測定方法的比較［J］.果樹學報，2006，23（2）：178-181.

［13］ 程廣有，唐曉杰，孟范例，等.不同貯藏溫度對銀中楊花粉壽命的影響［J］.北方園藝，2010（23）：105-107.

［14］ 陳永安，陳鑫，劉艷飛.采粉期及貯藏條件對獼猴桃花粉生活力的影響［J］.西北農(nóng)林科技大學學報（自然科學版），2012，40（8）：157-160.

［15］ 李桂榮，楊鵬鳴.硼酸與蔗糖對百合花粉生活力的影響［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學，2010，38（18）：9494-9495.

［16］ 高倩，黃榜，張安平，等.蜂糖李花粉離體萌發(fā)及活力保存研究［J］.西北農(nóng)林科技大學學報（自然科學版），2021，49（5）：123-129，137.

［17］ 樸永浩，曲柏宏，代志國，等.梨花粉貯藏特性與授粉能力的研究［J］.北方園藝，2002（5）：54-55.

［18］ 張保才，李曉丹，崔鴻文，等.不同貯藏方式對辣椒花粉生活力及授粉效果的影響［J］.西北農(nóng)業(yè)學報，2013，22（7）：132-137.

［19］ 苗衛(wèi)東，王萌，井朋偉，等.不同葡萄品種花粉生活力測定與貯藏條件［J］.北方園藝，2021（24）：23-31.

［20］ 肖玉菲，馬錦林，蔡婭，等.陸川油茶花粉貯藏和離體萌發(fā)條件研究［J］.熱帶作物學報，2021，42（7）：1971-1980.