5種金邊瑞香基因組DNA提取方法比較研究

羅素梅 郭崇炎 劉小平 黃冬華 周勇輝 范方喜 賴金莉 張遠福

摘要 ?［目的］研究不同提取方法對金邊瑞香基因組DNA提取質(zhì)量的影響，篩選最佳提取方法。［方法］以金邊瑞香葉片為試材，以SDS法、改良CTAB法、SDS-CTAB法、高鹽低pH法和尿素法5種方法提取基因組DNA，并從DNA純度、濃度、酶切電泳結(jié)果和ISSR-PCR擴增產(chǎn)物電泳等方面進行比較分析。［結(jié)果］高鹽低pH法和尿素法提取的金邊瑞香基因組DNA富含蛋白質(zhì)和多糖等雜質(zhì)，DNA純度低；SDS法提取的基因組DNA含有一些酚類物質(zhì)和鹽等雜質(zhì)，DNA純度較低；改良CTAB法提取的基因組DNA純度較高，但濃度和產(chǎn)率低。SDS-CTAB法提取的基因組DNA純度、濃度和產(chǎn)率最高，酶切和ISSR-PCR產(chǎn)物電泳檢測效果最好。［結(jié)論］SDS-CTAB法提取的金邊瑞香基因組DNA質(zhì)量與產(chǎn)量最佳，可以滿足后續(xù)分子生物學(xué)研究的需求。

關(guān)鍵詞 ?金邊瑞香；基因組DNA；提取方法

中圖分類號 ?S 685.99 ??文獻標識碼 ?A ??文章編號 ?0517-6611（2023）05-0074-04

doi： 10.3969/j.issn.0517-6611.2023.05.019

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標識碼（OSID）：

Comparative Study on Five Genomic DNA Extraction Methods of Daphne odora

LUO Su-mei1，2，GUO Chong-yan1，LIU Xiao-ping1，2 et al

（1.Vegetable and Flower Research Institute of Ganzhou，Ganzhou，Jiangxi 341404;2.Ganzhou Key Laboratory for Development and Utilization of Vegetable and Flower Germplasm Resources，Ganzhou，Jiangxi 341404）

Abstract ?［Objective］In order to study the effect of different methods on the quality of genomic DNA extraction from Daphne odore，the most suitable extraction method was selected.［Method］Using leaves of Daphne odore as materials，the genomic DNA was extracted by SDS method，modified CTAB method，SDS-CTAB method，high salt low pH method and urea method，which compared and analyzed on the DNA purity，concentration，enzyme digestion electrophoresis results and ISSR-PCR amplification product electrophoresis.［Result］The results showed that the genomic DNA extracted by high salt，low pH method and urea method was rich in impurities such as protein and polysaccharide，that the purity of DNA was low.The genomic DNA extracted by SDS method contains some impurities such as phenols and salts，which the purity of DNA was low.The genomic DNA extracted by modified CTAB method has high purity，but low concentration and yield.The purity，concentration and yield of genomic DNA extracted by SDS-CTAB method were the highest，further more，the effect of enzyme digestion and ISSR-PCR product electrophoresis detection also was the best.［Conclusion］The genomic DNA extracted by SDS-CTAB method has the best quality and yield of Daphne odore，which can meet the needs of subsequent molecular biology research.

Key words ?Daphne odore;Genomic DNA;Extraction methods

金邊瑞香（Daphne odore var.marginnata）是瑞香科瑞香屬瑞香的一個變種，為多年生常綠灌木花卉，是我國傳統(tǒng)名花之一，其葉片邊緣金黃，花色淡紫，花香濃烈獨特，深受廣大人民喜愛［1-2］。金邊瑞香富含黃酮類、香豆素類和黏多糖等生理活性物質(zhì)，具有抑菌、鎮(zhèn)痛、抗氧化和調(diào)節(jié)免疫等功效，是一味珍貴的中藥材［3-4］。金邊瑞香是我國特有的種質(zhì)資源，為江西省贛州市的地方特色花卉，在贛南大部分區(qū)縣均有栽培，暢銷國內(nèi)外市場且已形成產(chǎn)業(yè)化規(guī)模［1，5-6］。

目前，國內(nèi)外對金邊瑞香的研究主要集中于栽培管理、組培繁育、生物化學(xué)性質(zhì)和醫(yī)藥應(yīng)用等方面［7-10］，而關(guān)于其分子生物學(xué)方面的研究較少［11］。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的高速發(fā)展，植物分子遺傳分析等技術(shù)也必將運用到金邊瑞香的種質(zhì)資源保護、功能基因挖掘和品種改良等方面，而獲得高質(zhì)量的基因組DNA 是開展金邊瑞香分子生物學(xué)研究的基本前提。對于一種植物采用不同的基因組DNA提取方法，其純度和產(chǎn)量可能會產(chǎn)生很大差異［12］，而所提取的植物基因組DNA質(zhì)量是影響后續(xù)PCR、酶切等分子試驗的重要限制因素之一［13］，因此針對不同種類植物建立相應(yīng)的DNA分離純化方法以獲取高質(zhì)量的基因組DNA顯得至關(guān)重要。筆者采用SDS法、改良CTAB法、SDS-CTAB法、高鹽低pH法和尿素法5種方法對金邊瑞香基因組DNA提取效果進行比較研究，以摸索出適宜該植物的DNA提取純化方法，為金邊瑞香后續(xù)相關(guān)分子生物學(xué)研究提供有益參考和指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 ???金邊瑞香植株取樣于江西省贛州市大余縣，種植于贛州市蔬菜花卉研究所試驗大棚。

1.2 試驗儀器與試劑 ???移液器（賽默飛世爾）、恒溫水浴鍋（力辰科技）、離心機（賽默飛世爾）、超微量紫外分光光度計（上海嘉鵬）、凝膠成像儀（德國耶拿）、PCR儀（賽默飛世爾）、水平電泳儀（伯樂）。

試驗所用試劑中限制性內(nèi)切酶、DNA Marker和Taq酶均為北京全式金生物技術(shù)股份有限公司產(chǎn)品，其余均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.3 DNA提取方法

1.3.1 ???改良CTAB法。參考余志雄等［14］的方法，并加以改進。取金邊瑞香葉片0.1 g，加入0.05 g PVP-40，用液氮研磨成細粉后轉(zhuǎn)入2 mL無菌EP管中。立即加入1 mL 65 ℃預(yù)熱的提取緩沖液（100 ?mmol/L Tris-HCl、20 ?mmol/L EDTA ·Na2、1.4 mol/L NaCl、2% CTAB、5 ?mmol/L二乙基二硫代氨基甲酸）并加入40 μL β-巰基乙醇，漩渦混勻30 s，65 ℃水浴30 min。加入400 μL 5 mol/L 乙酸鉀溶液（pH 4.8），混勻，冰水浴10 min。12 000 r/min離心10 min，吸取上清液。向上清液中加入等體積氯仿 ∶異戊醇（體積比24 ∶1），漩渦混勻。12 000 r/min離心10 min，吸取上清液。向上清液中加入等體積-20 ℃預(yù)冷異丙醇，輕柔顛倒混勻5次后-20 ℃靜置10 min。12 000 r/min離心10 min，棄上清液，保留DNA沉淀。用75%乙醇重復(fù)洗滌、沉淀DNA 2次。吹干DNA沉淀，加入100 μL TE溶液溶解，置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 ???SDS法。參考楊春霞等［15］的方法，并加以改進。取0.1 g 金邊瑞香葉片加入液氮研磨成粉末后裝入2 mL離心管中，加入1 mL提取緩沖液（2% SDS、100 ?mmol/L Tris-HCl、50 ?mmol/L EDTA·Na2、1.5 mol/L NaCl、6% PVP-40）和40 μL β-巰基乙醇，混勻，65 ℃水浴30 min。 再加入400 μL 4 mol/L乙酸鉀溶液（pH 4.8），混勻，冰水浴10 min。12 000 r/min離心10 min，取上清液。向上清液中加入等體積氯仿 ∶異戊醇（體積比24 ∶1），混勻。12 000 r/min離心10 min，取上清液。向上清液中加入等體積-20 ℃預(yù)冷異丙醇，輕柔混勻，-20 ℃靜置10 min。12 000 r/min離心10 min，棄上清液，保留DNA沉淀。加入700 μL 75%乙醇，混勻漂洗DNA沉淀。12 000 r/min離心5 min，棄上清液，保留DNA沉淀。用75%乙醇重復(fù)洗滌、沉淀DNA 2次。吹干DNA沉淀，加入100 μL TE溶液溶解，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 ???SDS-CTAB法。參考孫鑫等［16］的方法， 并加以改進。取金邊瑞香葉片0.1 g加入液氮研磨成粉末后立即加入0.05 g ?PVP-40粉末，裝入2 mL離心管中，立即加入1 mL提取緩沖液（100 ?mmol/L Tris-HCl、50 ?mmol/L EDTA·Na2、1mol/L NaCl、2% SDS，pH 8.0）和60 μL β-巰基乙醇，混勻，65 ℃水浴30 ?min。加入1/3體積5 mol/L 乙酸鉀溶液（pH 4.8），混勻，冰水浴10 min。12 000 r/min離心10 min，取上清液，加入1/4體積CTAB buffer（100 ?mmol/L Tris-HCl、50 ?mmol/L EDTA·Na2、1 mol/L NaCl、10% CTAB，pH 8.0），混勻，65 ℃水浴15 min。加入等體積氯仿 ∶異戊醇（體積比24 ∶1），混勻。12 000 r/min離心10 min，取上清液。加入等體積-20 ℃預(yù)冷異丙醇，混勻，-20 ℃靜置10 min。12 000 r/min離心10 min，棄上清液，保留DNA沉淀。用75%乙醇重復(fù)洗滌，沉淀DNA 2次。吹干DNA沉淀，加入100 μL TE溶液溶解，放-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 ???高鹽低pH法。參考邵亞林等［17］的方法，并加以改進。取0.1 g金邊瑞香葉片，用液氮研磨成細粉后加入2 mL離心管中。立即加入1 mL 65 ℃預(yù)熱的提取緩沖液 （100 mmol/L乙酸鈉溶液、50 mmol/L EDTA·Na2、500 mmol/L ?NaCl、2% PVP-40，pH 5.5）和40 μL β-巰基乙醇，漩渦混勻30 s，65 ℃水浴30 min。12 000 r/min離心10 min，取上清液。向上清液中加入400 μL 2.5 mol/L 乙酸鉀溶液（pH 4.8），混勻，冰水浴10 min。12 000 r/min離心10 ?min，取上清液。向上清液中加入等體積氯仿 ∶異戊醇（體積比24 ∶1），混勻。12 000 r/min離心10 ?min，取上清液。向上清液中加入等體積的-20 ℃預(yù)冷異丙醇，輕柔顛倒混勻5次后-20 ℃靜置10 ?min。12 000 r/min離心10 ?min，棄上清液，保留DNA沉淀。加入700 μL 75%乙醇，混勻漂洗DNA沉淀。12 000 r/min離心5 ?min，棄上清液，保留DNA沉淀。用75%乙醇重復(fù)洗滌、沉淀DNA 2次。吹干DNA沉淀，加入100 μL TE溶液溶解，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.5 ???尿素法。參考白雪嵩等［18］的方法，加以改進。取金邊瑞香葉片0.1 g加入液氮研磨成粉末，裝入2 mL離心管中，立即加入1 mL提取緩沖液（8 mol/L 尿素、500 mmol/L NaCl、50 mmol/L Tris-HCl、20 mmol/L EDTA·Na2、2% PVP-40，pH 8.0）和40 μL β-巰基乙醇，混勻，65 ℃水浴30 ?min。加入400 μL 5mol/L 乙酸鉀溶液（pH 4.8），混勻，冰水浴10 ?min。異戊醇（體積比24 ∶1），混勻。12 000 r/min離心10 ?min，取上清液。加入等體積-20 ℃預(yù)冷異丙醇，輕柔混勻多次，-20 ℃靜置10 ?min。12 000 r/min離心10 ?min，棄上清液，保留DNA沉淀。加入700 μL 75%乙醇，混勻漂洗DNA沉淀；12 000 r/min離心5 ??min，棄上清液，保留DNA沉淀。用75%乙醇重復(fù)洗滌、沉淀DNA 2次。吹干DNA沉淀，加入100 μL TE溶液溶解，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 DNA質(zhì)量檢測

1.4.1 ???DNA濃度測定。

超微量紫外分光光度計檢測5種方法所提取基因組DNA的OD260/280值、OD260/230值和DNA濃度。采用Statistix 8.0軟件分析各處理間顯著性（標記字母法，LSD0.05）。

1.4.2 ???瓊脂糖凝膠電泳。

分別吸取不同方法提取的DNA樣品6 μL與6×Loading Buffer 4 μL混勻，在1%瓊脂糖凝膠上點樣，在1×TAE緩沖液中120 V恒壓電泳16 ??min后，在凝膠成像系統(tǒng)上觀察、拍照。

1.4.3 ???酶切驗證。對5種不同方法提取的DNA分別采用Sma I、Xba I雙酶切，酶切反應(yīng)體系為：10×T Buffer（+BSA） 2 μL、Sma I 1 μL、Xba I 1 μL、ddH2O 6 μL、DNA 10 μL。反應(yīng)物輕柔混勻，37 ℃水浴反應(yīng)3 h。1%瓊脂糖凝膠點樣，電泳檢測，凝膠成像儀拍照記錄。

1.4.4 ???ISSR-PCR檢測。

采用ISSR UBC-842引物（引物序列：GAGAGAGAGAGAGAGAYG）對5種方法提取DNA進行PCR擴增，反應(yīng)體系按照TransFast Taq DNA Polymerase（AP101）說明書配制。PCR反應(yīng)程序為：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性5 s；56 ℃復(fù)性15 s；72 ℃延伸15 s；循環(huán)34次，72 ℃延伸6 min；16 ℃保存。在1%瓊脂糖凝膠上點樣、電泳檢測，凝膠成像儀上拍照記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA濃度檢測 ???由表1可知，SDS法、改良CTAB法和SDS-CTAB法提取的金邊瑞香基因組DNA OD260/280值分別為2.00、2.00和1.98，都在1.90～2.00，且三者無顯著性差異，表明這3種方法對RNA和蛋白質(zhì)等大分子雜質(zhì)去除比較干凈，DNA純度較高；高鹽低pH法和尿素法提取的DNA OD260/280值分別為1.59和1.87，都小于1.90，表明蛋白質(zhì)、RNA等大分子沒有去除干凈，降低了DNA純度。SDS法、改良CTAB法和SDS-CTAB法提取的DNA OD260/230值大于2.00，且SDS-CTAB法的DNA OD260/230值最高，而高鹽低pH法和尿素法提取的DNA OD260/230均小于1.85，說明SDS法、改良CTAB法和SDS-CTAB法去除小分子、酚類物質(zhì)和鹽等雜質(zhì)的能力比高鹽低pH法和尿素法更強。根據(jù)DNA濃度和產(chǎn)率結(jié)果可知，SDS-CTAB法所提DNA濃度與產(chǎn)率最高，SDS法次之，然后為尿素法，改良CTAB法和高鹽低pH法所得到的數(shù)值相近且很低。

2.2 瓊脂糖凝膠電泳檢測 ???對5種方法提取的金邊瑞香基因組DNA進行瓊脂糖凝膠電泳檢測（圖1），結(jié)果發(fā)現(xiàn)，改良CTAB法和SDS-CTAB法提取的DNA點樣孔內(nèi)無顯著熒光出現(xiàn)，表明這2種方法已經(jīng)將大多數(shù)蛋白質(zhì)、糖類和RNA等雜質(zhì)去除，獲得了較純的DNA；但改良CTAB法提取的DNA樣本亮度低，這說明該方法提取的基因組DNA濃度低。SDS法、高鹽低pH法和尿素法提取的DNA點樣孔中有較顯著的熒光，而SDS法和尿素法存在拖尾現(xiàn)象，說明這3種方法去除蛋白質(zhì)、糖類和RNA等雜質(zhì)能力較差。這與表1中的結(jié)果一致。

2.3 酶切結(jié)果分析 ???對這5種方法提取的金邊瑞香基因組DNA分別進行酶切驗證（圖2），結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SDS-CTAB法提取的金邊瑞香基因組DNA酶切電泳后呈彌散狀，條帶形成清晰完整的連續(xù)拖帶，條帶最寬，且點樣孔中無熒光，表明該方法提取的DNA雜質(zhì)含量少，DNA濃度高，質(zhì)量最好。SDS法提取的DNA經(jīng)雙酶切電泳后，條帶呈彌散狀，有完整的連續(xù)拖帶，點樣空內(nèi)無明顯熒光，但條帶寬度小于SDS-CTAB法所提，說明SDS法提取的金邊瑞香DNA質(zhì)量次之。尿素法提取的DNA酶切電泳后呈彌散狀，有完整的連續(xù)拖帶，點樣空內(nèi)少量熒光，但條帶寬度較小，表明尿素法提取的DNA純度不高。改良CTAB法提取的DNA酶切電泳后呈彌散狀，有完整的連續(xù)拖帶，但條帶亮度暗，表明所提取的DNA濃度低。高鹽低pH法提取的DNA酶切電泳后沒有完整的連續(xù)拖帶，條帶窄且亮度暗，表明該方法提取的DNA質(zhì)量最差。

2.4 ISSR-PCR檢測 ???以5種不同方法提取的金邊瑞香基因組DNA為模板，采用UBC-842引物進行ISSR-PCR擴增后電泳檢測（圖3）。結(jié)果表明，5種方法提取的DNA經(jīng)ISSR-PCR擴增、電泳后分別在1 500、1 200和740 bp處產(chǎn)生1個條帶，但不同方法所提取DNA的PCR產(chǎn)物電泳后條帶亮度存在一定差異。SDS-CTAB法相對另外4種方法的3個條帶均為最亮，SDS法次之，改良CTAB法和尿素法條帶亮度均較淡且相近，高鹽低pH法條帶亮度最暗。

3 結(jié)論與討論

該試驗采用的5種方法均能提取出金邊瑞香基因組DNA，但不同方法的提取質(zhì)量存在差別。5種方法中SDS法、改良CTAB法和SDS-CTAB法的OD260/280值均在1.98～2.00，尿素法和高鹽低pH法OD260/280值都小于1.80，表明前3種方法對蛋白質(zhì)和RNA等大分子去除較干凈，DNA純度較高，后2種方法所提DNA則仍含有大分子雜質(zhì)。5種方法中SDS法、改良CTAB法和SDS-CTAB法的OD260/230值都大于2.00，表明這3種方法去除小分子、酚類物質(zhì)和鹽等雜質(zhì)的效果更好。DNA濃度和產(chǎn)率結(jié)果表明，SDS-CTAB法所達到的水平最高，高鹽低pH法最低。對不同方法所提DNA進一步進行瓊脂糖凝膠電泳檢測后也得出了一致的結(jié)果。5種方法提取的金邊瑞香基因組DNA經(jīng)過雙酶切后均能產(chǎn)生酶切條帶、ISSR-PCR檢測也都能擴增出條帶，但不同方法的酶切和ISSR-PCR電泳檢測條帶存在差異，其中，以SDS-CTAB法酶切效果及ISSR-PCR電泳結(jié)果最佳，這表明5種方法提取的DNA雖然都可以進行分子生物學(xué)相關(guān)試驗，但提取質(zhì)量存在差異。綜上分析表明，不同方法提取金邊瑞香基因組DNA質(zhì)量表現(xiàn)為SDS-CTAB法>SDS法>尿素法>改良CTAB法>高鹽低pH法。

獲得高純度、高濃度的基因組DNA是進行觀賞植物功能基因研究、分子標記輔助育種和遺傳多樣性分析等分子生物學(xué)研究的基礎(chǔ)保障［19-20］。影響植物DNA高效提取的因素有很多，主要包括多糖、色素、酚類物質(zhì)和蛋白質(zhì)等雜質(zhì)［21-22］，尤其是金邊瑞香的根、莖、葉等組織中都富含多糖、酚類和黃酮類等次生代謝產(chǎn)物［3，8，23］，因此提取純化植物基因組DNA的關(guān)鍵在于高效地除去這些物質(zhì)。該試驗中SDS-CTAB法提取的金邊瑞香基因組DNA濃度最高、純度最好，完全可用于后續(xù)相關(guān)分子生物學(xué)研究。與孫鑫等［16］的方法相比，該研究采用SDS-CTAB法直接將PVP-40與植物樣本粉末快速混勻，使PVP立即充分地絡(luò)合干擾DNA純度的多酚類物質(zhì)，防止DNA氧化褐變。在提取緩沖液中適當提高β-巰基乙醇用量，以防止DNA斷裂并更有效地破壞蛋白質(zhì)的肽鏈［24］，從而降解植物蛋白質(zhì)及抑制細胞中多種酶活性。提取緩沖液中高濃度的NaCl有利于多糖去除，而提取液中依次加入高濃度乙酸鉀溶液、CTAB buffer可以更有效地除去多糖［25］。多次去除多糖，有助于高質(zhì)量DNA的獲得［26］。氯仿/異戊醇抽提可以進一步去除樣本中的脂類、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，從而提高DNA純度與產(chǎn)率。

該試驗對金邊瑞香基因組DNA的提取方法進行了比較研究，發(fā)現(xiàn)SDS法、改良CTAB法、SDS-CTAB法、高鹽低pH法和尿素法對金邊瑞香樣本中多糖、酚類和蛋白質(zhì)等雜質(zhì)均可以不同程度地去除而分離獲得DNA，但SDS-CTAB法提取的DNA質(zhì)量與產(chǎn)率最佳，各項指標都優(yōu)于其他4種方法。金邊瑞香基因組DNA高質(zhì)量提取方法的構(gòu)建將為后續(xù)相關(guān)分子生物學(xué)的研究提供參考與借鑒。

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