大黃素調(diào)控miR-16-5p/STAT3對(duì)心肌梗死大鼠模型保護(hù)作用機(jī)制研究

謝小芳 趙展慶 符妹垂

心肌梗死后心肌組織出現(xiàn)大面積變性壞死,造成嚴(yán)重的心力衰竭及心率失常,隨時(shí)危及患者生命[1,2]。持續(xù)性缺血缺氧觸發(fā)的心肌組織強(qiáng)烈炎性級(jí)聯(lián)反應(yīng)是造成心肌梗死后心功能損傷的主要病理基礎(chǔ),抗炎干預(yù)可有效減輕心肌梗死后心肌細(xì)胞凋亡和心肌組織損傷,改善心功能[3,4]。研究顯示miR-16-5p在缺血性心肌損傷中起著重要的調(diào)節(jié)作用,下調(diào)miR-16-5p表達(dá)可有效保護(hù)心肌細(xì)胞免受缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的損傷[5],抑制Janu激酶2(Janus Kinase 2,JAK2)/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)信號(hào)激活可抑制缺血缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡,有效保護(hù)心肌梗死大鼠心臟[6];另有研究證明,miR-16-5p可調(diào)控STAT3表達(dá),進(jìn)而介導(dǎo)神經(jīng)系統(tǒng)疾病和糖尿病的發(fā)生發(fā)展[7],因此下調(diào)miR-16-5p/STAT3信號(hào)可能是防治心肌梗死后心損傷的有效策略。大黃素具有顯著抗炎、抗心肌缺血、抗凋亡特性,能用于心血管疾病的防治[8],可發(fā)揮抗氧化應(yīng)激以及抗凋亡功效而促使缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞存活[9],還可抑制JAK2/STAT3信號(hào)激活并緩解小鼠動(dòng)脈粥樣硬化病變[10],因而推測(cè)大黃素可能通過miR-16-5p抑制STAT3而對(duì)心肌梗死大鼠發(fā)揮保護(hù)作用,本文以不同劑量大黃素處理心肌梗死模型大鼠,對(duì)此推測(cè)做驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 Wistar大鼠,體重205～220 g,雄性,7周齡左右,SPF級(jí),購(gòu)自杭州啟真實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司,合格證號(hào):SCXK(浙)2022-0005。大鼠在屏障環(huán)境的動(dòng)物房?jī)?nèi)飼養(yǎng),飼養(yǎng)條件:照明為晝夜12 h/12 h交替,溫度22.5～25.5℃、相對(duì)濕度55%～65%。

1.2 主要材料及試劑 miR-16-5p agomir、miR-16-5p agomir陰性對(duì)照、miR-16-5p及U6引物由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司提供;大黃素(純度≥98%,貨號(hào)E8390)、一步法熒光定量PCR試劑盒(貨號(hào)T2210)、2,3,5氯化三苯基四氮唑(2,3,5-Triphenyl-2H-Tetrazolium Chloride,TTC)染色液(2%,貨號(hào)G3005),北京索萊寶科技有限公司;Trizol試劑(貨號(hào):AHF1813A),美國(guó)Invitrogen公司;大鼠腫瘤壞死因子-α(TNF-α)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒(貨號(hào)ab236712)、HE染色試劑盒(貨號(hào)ab245880)、大鼠白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)ELISA試劑盒(貨號(hào)ab255730)、TUNEL染色試劑盒(貨號(hào)ab206386)、兔抗大鼠Anti-β-actin一抗(貨號(hào)ab8227)、兔源抗大鼠Anti-p-STAT3抗體(貨號(hào)ab76315)、兔源抗大鼠Anti-Caspase-3抗體(貨號(hào)ab184787)、兔源抗大鼠Anti-STAT3抗體(貨號(hào)ab68153)、辣根過氧化物酶標(biāo)記小鼠抗兔二抗(貨號(hào)ab99697)、兔源抗大鼠Anti-Bax抗體(貨號(hào)ab32503),美國(guó)Abcam公司等。

1.3 主要儀器 小動(dòng)物呼吸機(jī)(型號(hào)R407),購(gòu)自深圳瑞沃德生命科技有限公司;超高分辨率小動(dòng)物超聲成像系統(tǒng)(型號(hào)Vevo3100),購(gòu)自加拿大Visualsonics Inc公司;石蠟切片機(jī)(型號(hào)ARM-2216),購(gòu)自湖北安立信醫(yī)療實(shí)業(yè)有限公司;實(shí)驗(yàn)室雙目生物顯微鏡(型號(hào)CM1000),購(gòu)自深圳市星明光學(xué)儀器有限公司;酶標(biāo)儀(型號(hào)HBS-1096C),購(gòu)自南京德鐵實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;標(biāo)準(zhǔn)型垂直電泳系統(tǒng)(型號(hào)SE400)、全濕電轉(zhuǎn)印系統(tǒng)(型號(hào)TE62),購(gòu)自美國(guó)Amersham公司等。

1.4 方法

1.4.1 分組及處理:將大黃素、miR-16-5p agomir、miR-16-5p agomir陰性對(duì)照溶于0.9%氯化鈉溶液,制為6、12 ml/kg大黃素藥液、20 nmol/ml miR-16-5p agomir藥液和20 nmol/ml miR-16-5p agomir陰性對(duì)照藥液備用。大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、大黃素低劑量組、大黃素高劑量組、miR-16-5p agomir組、miR-16-5p agomir陰性對(duì)照組、大黃素高劑量+miR-16-5p agomir組,每組12只。大黃素低劑量組、大黃素高劑量組大鼠灌胃30、60 mg/kg大黃素(6、12 ml/kg的大黃素藥液均5 ml/kg,1次/d)[11],同時(shí)尾靜脈注射5 ml/kg的0.9%氯化鈉溶液(2次/周);miR-16-5p agomir組、miR-16-5p agomir陰性對(duì)照組大鼠灌胃5 ml/kg的0.9%氯化鈉溶液(1次/d),同時(shí)尾靜脈注射miR-16-5p agomir及miR-16-5p agomir陰性對(duì)照各100 nmol/kg(20 nmol/ml miR-16-5p agomir藥液和20 nmol/ml miR-16-5p agomir陰性對(duì)照藥液均5 ml/kg,2次/周)[12];大黃素高劑量+miR-16-5p agomir組灌胃60 mg/kg大黃素(12 ml/kg的大黃素藥液5 ml/kg,1次/d),另尾靜脈注射miR-16-5p agomir 100 nmol/kg(20 nmol/ml miR-16-5p agomir藥液5 ml/kg,2次/周);假手術(shù)組和模型組大鼠灌胃5 ml/kg的0.9%氯化鈉溶液(1次/d),同時(shí)尾靜脈注射5 ml/kg的0.9%氯化鈉溶液(2次/周),7組均干預(yù)處理1周。

1.4.2 超聲檢測(cè)心功能:藥物處理后24 h,參照文獻(xiàn)[13]建立心肌梗死模型:以3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉(劑量為1.6 ml/kg),氣管插管后連接小動(dòng)物呼吸機(jī)輔助呼吸,胸部脫毛備皮后于左側(cè)胸骨第3、4肋間開胸,暴露心臟后找到,冠狀動(dòng)脈左前降支,對(duì)其進(jìn)行結(jié)扎,直至左心室前壁由紅變蒼白及心電圖ST段抬高即表示造模成功,假手術(shù)組大鼠開胸后僅穿線不結(jié)扎,30 min后放開結(jié)扎線縫合,恢復(fù)心臟血流2 h后采用小動(dòng)物超聲成像系統(tǒng)檢測(cè)大鼠心功能指標(biāo):左心室收縮末期內(nèi)徑(LVDS)、左心室射血分?jǐn)?shù)(EF)、左心室舒張末期內(nèi)徑(LVDD),測(cè)3個(gè)心動(dòng)周期取平均值。

1.4.3 采集標(biāo)本:心功能檢測(cè)結(jié)束后,每組取6只大鼠采集其頸動(dòng)脈血,離心得到血清標(biāo)本,-80℃冰箱備用;開胸取出心臟,取梗死區(qū)附近的心肌組織約0.6 g加入RAPI緩沖液研碎勻漿,離心得到蛋白樣品液,以BCA法測(cè)出總蛋白濃度后存在-80℃冰箱備用;再次取梗死區(qū)附近的心肌組織約0.4 g于液氮中備用;剩余心肌組織蒸餾水清洗、10%甲醛固定、梯度(80%、90%、95%、100%)乙醇脫水、熱石蠟包埋、切片備用。

1.4.4 TTC染色檢測(cè)7組大鼠心肌梗死面積:每組剩余的6只大鼠開胸取出心臟,沿冠狀面切為厚片,分別浸沒入2%的TTC染色液中避光孵育20 min染色,然后以10%甲醛固定后拍照,計(jì)算心肌梗死面積,公式為:心肌梗死面積=梗死面積/切片總面積×100%。

1.4.5 HE和TUNEL染色分別檢測(cè)7組大鼠心肌組織病理變化、心肌細(xì)胞凋亡:取出1.4.3中的心肌組織石蠟切片,二甲苯脫蠟、梯度(100%、95%、80%、75%)乙醇水化,分別進(jìn)行HE和TUNEL染色(各染3張),洗片后采用實(shí)驗(yàn)室雙目生物顯微鏡攝取HE和TUNEL染色后的切片,并采用Image J軟件分析TUNEL染色后的切片圖像并定量其視野中凋亡細(xì)胞數(shù)及總心肌細(xì)胞數(shù),計(jì)算心肌細(xì)胞凋亡率,公式為:心肌細(xì)胞凋亡率=凋亡細(xì)胞數(shù)/總心肌細(xì)胞數(shù)×100%。

1.4.6 ELISA法測(cè)定7組大鼠血清及心肌組織炎性因子IL-1β、TNF-α水平:取出1.4.3中存在-80℃的血清和心肌組織樣品液并解凍,每組取0.24 ml,采用ELISA試劑盒測(cè)定血清及心肌組織中IL-1β、TNF-α水平,參照各自試劑盒說明書中步驟進(jìn)行。

1.4.7 實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)7組大鼠心肌組織miR-16-5p水平:取1.4.3中存在液氮的心肌組織,加入Trizol試劑研磨后提取并測(cè)出總RNA濃度,每組取適量總RNA采用一步法熒光定量PCR試劑盒檢測(cè)出每組大鼠miR-16-5p、 U6基因Ct值,以U6做內(nèi)參對(duì)照并以2-ΔΔCt法量化miR-16-5p的相對(duì)表達(dá)。見表1。

表1 引物序列

1.4.8 免疫印跡法檢測(cè)7組大鼠心肌組織凋亡蛋白(Bax、Caspase-3)及STAT3 表達(dá):取1.4.6中剩余的心肌組織樣品液,100℃煮沸變性蛋白,每組取適量蛋白電泳(120 V恒壓,85 min)分離,電轉(zhuǎn)(40 mA穩(wěn)流,85 min)移到硝酸纖維膜,5%牛血清白蛋白封閉膜上蛋白非特異抗原后將STAT3、p-STAT3、β-actin、Bax、Caspase-3蛋白條帶剪下,分別孵育兔源抗大鼠Anti-STAT3、p-STAT3、β-actin、Bax、Caspase-3抗體,洗膜后孵育辣根過氧化物酶標(biāo)記小鼠抗兔二抗,化學(xué)發(fā)光顯色7組蛋白條帶后攝取其圖像,采用Image-J軟件定量7組蛋白條帶灰度值后分析得出相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 大黃素對(duì)7組大鼠心功能的影響 與假手術(shù)組比較,模型組大鼠LVDS、LVDD明顯升高(P<0.05),EF明顯降低(P<0.05)。與模型組比較,大黃素低、高劑量組大鼠LVDS、LVDD均降低(P<0.05),EF均升高(P<0.05);大黃素高劑量組大鼠LVDS、LVDD相比大黃素低劑量組進(jìn)一步降低(P<0.05),EF進(jìn)一步升高(P<0.05);miR-16-5p agomir組大鼠LVDS、LVDD升高(P<0.05),EF降低(P<0.05);miR-16-5p agomir陰性對(duì)照組大鼠LVDS、LVDD、EF無明顯變化(P>0.05)。與大黃素高劑量組比較,大黃素高劑量+miR-16-5p agomir組大鼠LVDS、LVDD升高(P<0.05),EF降低(P<0.05)。見表2。

表2 7組大鼠心功能指標(biāo)LVDS、LVDD、EF

2.2 大黃素對(duì)7組大鼠心肌梗死的影響 與假手術(shù)組比較,模型組大鼠心肌梗死面積明顯升高(P<0.05);與模型組比較,大黃素低、高劑量組大鼠心肌梗死面積均降低(P<0.05),大黃素高劑量組大鼠心肌梗死面積比大黃素低劑量組進(jìn)一步降低(P<0.05),miR-16-5p agomir組大鼠心肌梗死面積升高(P<0.05),miR-16-5p agomir陰性對(duì)照組大鼠心肌梗死面積無明顯變化(P>0.05);與大黃素高劑量組比較,大黃素高劑量+miR-16-5p agomir組大鼠心肌梗死面積升高(P<0.05)。見表3,圖1。

表3 7組大鼠心肌梗死面積

2.3 大黃素對(duì)7組大鼠心肌組織病理形態(tài)的影響 假手術(shù)組大鼠心肌組織形態(tài)正常無病理變化;模型組大鼠心肌細(xì)胞排列紊亂,部分心肌纖維變性出現(xiàn)灶性壞死,組織內(nèi)有炎性細(xì)胞浸潤(rùn);與模型組比較,大黃素低、高劑量組大鼠心肌組織病理?yè)p傷均減輕,大黃素高劑量組大鼠心肌組織病理?yè)p傷進(jìn)一步減輕,miR-16-5p agomir組大鼠心肌組織病理?yè)p傷加重,miR-16-5p agomir陰性對(duì)照組大鼠心肌病理?yè)p傷無明顯變化;與大黃素高劑量組比較,大黃素高劑量+miR-16-5p agomir組大鼠心肌組織病理?yè)p傷加重。見圖2。

圖2 7組大鼠心肌組織病理變化(HE染色×200)

2.4 大黃素對(duì)7組大鼠心肌纖維化的影響 與假手術(shù)組比較,模型組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.05);與模型組比較,大黃素低、高劑量組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率均降低(P<0.05),大黃素高劑量組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率相比大黃素低劑量組進(jìn)一步降低(P<0.05),miR-16-5p agomir組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率升高(P<0.05),miR-16-5p agomir陰性對(duì)照組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率無明顯變化(P>0.05);與大黃素高劑量組相比,大黃素高劑量+miR-16-5p agomir組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率升高(P<0.05)。見圖3,表4。

圖1 TTC染色檢測(cè)7組大鼠心肌梗死面積

圖3 7組大鼠心肌纖維化(TUNEL染色×200)

表4 7組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率

2.5 大黃素對(duì)7組大鼠心肌組織凋亡蛋白(Bax、Caspase-3)、miR-16-5p/STAT3信號(hào)因子表達(dá)的影響 與假手術(shù)組比較,模型組大鼠心肌組織Bax及Caspase-3蛋白表達(dá)、miR-16-5p表達(dá)、p-STAT3/STAT3明顯升高(P<0.05);與模型組比較,大黃素低、高劑量組大鼠心肌組織Bax及Caspase-3蛋白表達(dá)、miR-16-5p表達(dá)、p-STAT3/STAT3均降低(P<0.05),大黃素高劑量組大鼠比大黃素低劑量組進(jìn)一步降低(P<0.05),miR-16-5p agomir組大鼠心肌組織升高(P<0.05),miR-16-5p agomir陰性對(duì)照組大鼠心肌組織無明顯變化(P>0.05);與大黃素高劑量組比較,大黃素高劑量+miR-16-5p agomir組大鼠心肌組織Bax及Caspase-3蛋白表達(dá)、miR-16-5p表達(dá)、p-STAT3/STAT3升高(P<0.05)。見表5,圖4。

圖4 免疫印跡檢測(cè)7組大鼠心肌組織凋亡蛋白及STAT3蛋白表達(dá);A 假手術(shù)組;B 模型組;C 大黃素低劑量組;D 大黃素高劑量組;E miR-16-5p agomir組;F miR-16-5p agomir陰性對(duì)照組;G 大黃素高劑量+miR-16-5p agomir組

表5 7組大鼠心肌組織凋亡蛋白、miR-16-5p/STAT3信號(hào)因子相對(duì)表達(dá)水平

2.6 大黃素對(duì)7組大鼠血清及心肌組織炎性因子的影響 與假手術(shù)組比較,模型組大鼠血清及心肌組織IL-1β、TNF-α水平明顯升高(P<0.05);與模型組比較,大黃素低、高劑量組大鼠血清及心肌組織IL-1β、TNF-α水平均降低(P<0.05),大黃素高劑量組相比大黃素低劑量組進(jìn)一步降低(P<0.05),miR-16-5p agomir組升高(P<0.05),miR-16-5p agomir陰性對(duì)照組無明顯變化(P>0.05);與大黃素高劑量組比較,大黃素高劑量+miR-16-5p agomir組大鼠血清及心肌組織IL-1β、TNF-α水平升高(P<0.05)。見表6。

表6 7組大鼠血清及心肌組織IL-1β、TNF-α水平

3 討論

口服硝酸酯類藥物、介入手術(shù)等是心肌梗死常用臨床治療手段,但患者心臟功能恢復(fù)及預(yù)后不甚理想,因此探尋療效更好的治療方式有重要價(jià)值[14,15]。本文通過冠狀動(dòng)脈左前降支結(jié)扎法建立心肌梗死模型,結(jié)果顯示造模大鼠血清及心肌組織炎性因子水平明顯升高,促使大鼠心肌細(xì)胞凋亡,心肌細(xì)胞排列紊亂,部分心肌纖維變性出現(xiàn)灶性壞死,組織內(nèi)有炎性細(xì)胞浸潤(rùn),嚴(yán)重?fù)p害心功能,揭示心肌梗死模型建立成功。

通過抑制炎癥水平和心肌細(xì)胞凋亡可明顯減輕心肌梗死大鼠心功能損傷[16,17]。大黃素可發(fā)揮抗氧化、抗心肌缺血、抗炎、抗凋亡的功效,在心血管疾病的治療中具有很好的應(yīng)用前景[9],通過降低氧化應(yīng)激及抑制凋亡等途徑減輕硫酸吲哚酚誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷[18],并通過增強(qiáng)抗氧化功能而緩解大鼠心肌缺血再灌注損傷,保護(hù)其心功能[11]。本文以不同劑量大黃素處理心肌梗死大鼠,均可降低其LVDS、LVDD、心肌梗死面積、心肌細(xì)胞凋亡率、血清及心肌組織IL-1β、TNF-α水平、心肌組織Bax、Caspase-3蛋白表達(dá),升高EF,減輕大鼠心肌組織病理?yè)p傷,表明大黃素可降低炎性因子表達(dá),抑制炎癥,減輕心肌細(xì)胞凋亡及組織損傷,改善心功能,最終起到心保護(hù)作用,且劑量越高作用越強(qiáng),進(jìn)一步證實(shí)了大黃素對(duì)心肌損傷的防治作用。

miR-16-5p和STAT3是調(diào)控細(xì)胞凋亡、炎癥、纖維化的重要因子,在各種心臟疾病發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著重要調(diào)控作用,miR-16-5p在缺血性擴(kuò)張型心肌病患者血漿中表達(dá)升高,可在體外促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡,通過抑制細(xì)胞凋亡和炎癥可有效緩解心臟損傷;降低STAT3磷酸化可顯著抑制膠原蛋白表達(dá),通過對(duì)抗心肌纖維化改善心肌梗死引起的心衰,保護(hù)心功能[19]。本文結(jié)果顯示以miR-16-5p agomir上調(diào)心肌梗死大鼠miR-16-5p表達(dá),可升高炎性因子及STAT3磷酸化水平,增強(qiáng)大鼠炎癥和心肌細(xì)胞凋亡,加重其心肌組織及心功能損傷,而大黃素可降低心肌梗死大鼠miR-16-5p表達(dá)及STAT3磷酸化,表明miR-16-5p/STAT3信號(hào)參與介導(dǎo)心肌梗死的發(fā)生及大黃素對(duì)心肌梗死大鼠的治療過程;以大黃素處理心肌梗死大鼠同時(shí)采用miR-16-5p agomir上調(diào)miR-16-5p表達(dá),相比大黃素單獨(dú)處理,可降低大鼠EF,升高其LVDS、LVDD、心肌梗死面積、心肌膠原纖維占比、血清及心肌組織IL-1β、TNF-α水平、心肌組織Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)、miR-16-5p表達(dá)及p-STAT3/STAT3,加重大鼠心肌組織病理?yè)p傷,表明上調(diào)miR-16-5p表達(dá)可減弱大黃素的抗炎功能,消除其對(duì)心肌梗死大鼠心肌組織損傷和心肌細(xì)胞凋亡的減輕作用,最終逆轉(zhuǎn)大黃素對(duì)心功能的保護(hù)作用,揭示大黃素對(duì)心肌梗死大鼠發(fā)揮保護(hù)作用是通過下調(diào)miR-16-5p實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述,大黃素可通過下調(diào)miR-16-5p而減弱STAT3磷酸化,從而降低炎性因子表達(dá),抑制炎癥,減輕心肌梗死大鼠心肌組織損傷和心肌細(xì)胞凋亡,最終修復(fù)大鼠心功能,發(fā)揮心保護(hù)作用,阻斷miR-16-5p/STAT3信號(hào)傳導(dǎo)可能是其藥理機(jī)制之一,本文為大黃素用于心肌梗死的臨床治療提供了新的理論依據(jù)及科學(xué)資料,有利于大黃素的開發(fā)應(yīng)用。