丹皮酚抑制Notch1/Jagged1信號通路對妊娠糖尿病大鼠糖代謝紊亂的改善作用

陳蓓 連李斌

妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus,GDM)主要是由于在懷孕期間糖代謝調(diào)節(jié)紊亂引起的,對母親和孩子的健康具有嚴(yán)重的影響,如早產(chǎn)、剖宮產(chǎn)、胎兒發(fā)育過度、新生兒高胰島素血癥、高血糖和高膽紅素血癥等,GDM主要是因為對胰島素的抵抗和對葡萄糖的耐受,GDM女性的胰島素抵抗和雌激素濃度增加可導(dǎo)致典型的妊娠相關(guān)脂質(zhì)代謝波動超過生理穩(wěn)態(tài)[1]。研究發(fā)現(xiàn),GDM患者中,糖代謝紊亂狀態(tài)能夠在短期內(nèi)快速恢復(fù),但部分患者糖代謝紊亂持續(xù),甚至發(fā)展為2型糖尿病[2]。丹皮酚(paeonol,PAE)是牡丹根皮的有效提取物,因其消炎、鎮(zhèn)痛、抗氧化等藥學(xué)作用被廣泛應(yīng)用于生活中[3]。研究顯示,Notch信號通路在組織細(xì)胞中具有信號識別,調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、凋亡等作用,Notch通路由Notch配體Notch1和Notch受體Jagged1組成,當(dāng)Notch1和Jagged1結(jié)合后,便引發(fā)γ-分泌酶介導(dǎo)的蛋白水解機(jī)制,釋放Notch到胞內(nèi)域與DNA結(jié)合蛋白相互作用,進(jìn)而被轉(zhuǎn)化為能夠激活誘導(dǎo)靶基因轉(zhuǎn)錄的復(fù)合物,從而激活下游靶基因表達(dá),介導(dǎo)Notch信號通路傳導(dǎo)[4,5]。因此,本研究通過探討PAE抑制Notch1/Jagged1信號通路對GDM大鼠糖代謝紊亂的改善作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 體重220～240 g的SPF級別健康雌性SD大鼠72只和雄性SD大鼠36只,購自廣東維通利華實驗動物技術(shù)有限公司,生產(chǎn)許可證號:SCXK(粵)2022-0063。整個實驗進(jìn)程嚴(yán)格遵循動物實驗規(guī)定,保證動物權(quán)利,得到院校許可。

1.2 主要試劑 丹皮酚(貨號:D-002)購自成都瑞芬思生物科技有限公司;鏈脲佐菌素(Streptozocin,STZ)(貨號:S8050)購自北京索萊寶科技有限公司;腫瘤壞死因子-α(TNF-α)(貨號:SP12250)、白介素-6(IL-6)ELISA試劑盒(貨號:SP12279)均購自武漢賽培生物科技有限公司;瘦素(Leptin)(貨號:ml024238)、脂聯(lián)素(Adiponectin,APN)(貨號:ml028375)檢測試劑盒均購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司;谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)(貨號:D751008-0096)、超氧化物歧化酶(SOD)(貨號:A003540-0010)、丙二醛(MDA)(貨號:D799762-0100)、過氧化氫酶(CAT)(貨號:D799598-0100)檢測試劑盒均購自生工生物工程(上海)股份有限公司;Notch1抗體(貨號:bs-11976R)、Jagged1抗體(貨號:bs-23033R)、Hes1抗體(貨號:bs-2972R)均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.3 GDM大鼠模型的構(gòu)建及分組 將72只SPF級大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后造模[6]。給予大鼠高脂飼料喂養(yǎng)8周,禁食12 h后,大鼠按照雌雄2∶1的比例合籠,陰道涂片鏡檢檢測大鼠是否妊娠。妊娠大鼠腹腔注射STZ 60 mg/kg,注射72 h后,檢測FBG>12 mmol/L,且出現(xiàn)飲食、飲水以及尿量均增多判斷為GDM造模成功。將造模成功的GDM大鼠分為模型組(GDM組)、低劑量PAE組(L-PAE組)、中劑量PAE組(M-PAE組)、高劑量PAE組(H-PAE組),高劑量PAE組+Notch1信號激活劑Jagged1/FC嵌合蛋白組(H-PAE+JFC組),每組12只。另取12只正常妊娠母鼠作為正常對照組(NC組),L-PAE組、M-PAE組、H-PAE組每天分別給予100 mg/kg、200 mg/kg、400 mg/kg劑量[7]PAE灌胃,H-PAE+JFC組每天給予400 mg/kg劑量PAE外還需加500 μg/kg Jagged1/FC嵌合蛋白,NC組和GDM組給予等體積的0.9%氯化鈉溶液灌胃。大鼠在14周時禁食12 h后,于下腔靜脈采血,3 000 r/min離心15 min分離血清,同時取出肝臟, -80℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 測定6組大鼠血糖、胰島素水平 在造模0、7、14 d時,大鼠空腹?fàn)顟B(tài)下尾靜脈采血,各采0.5 ml。血糖儀測定大鼠空腹血糖(FBG),胰島素放射免疫分析試劑盒檢測大鼠空腹血清胰島素(FINS)。

1.5 測定6組大鼠血脂指標(biāo)含量 生化分析儀檢測6組大鼠血清脂質(zhì)指標(biāo)-總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)含量。

1.6 酶聯(lián)免疫吸附(ELLSA)法檢測大鼠血清中TNF-α、IL-6、Leptin、APN水平 取大鼠血液,3 000 r/min離心10 min,取上清液。根據(jù)ELISA試劑盒要求,制定標(biāo)準(zhǔn)曲線,按照試劑盒說明書測定TNF-α、IL-6、Leptin、APN水平,在酶標(biāo)儀中讀取其OD值。

1.7 檢測大鼠血清中氧化應(yīng)激指標(biāo)水平 微量法按其試劑盒說明檢測GSH-PX、MDA、SOD以及CAT指標(biāo)。

1.8 Western blot法檢測大鼠肝臟組織中Notch1/Jagged1信號通路相關(guān)蛋白水平 根據(jù)總蛋白提取試劑盒說明,提取肝臟組織總蛋白后,BCA法進(jìn)行蛋白定量。按照試劑盒操作步驟在96孔板中分別加入5 μl蛋白原液、PBS溶液以及工作液混勻,37℃孵育30 min,測定OD值。進(jìn)行BCA定量,經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉,然后將硝酸纖維素膜有蛋白一面置于一抗稀釋液中孵育,進(jìn)行洗脫,再將膜放入含有二抗體稀釋液的空槽中孵育1 h,再次洗脫。最后將膜放入EPI托盤中,滴加ECT顯影液檢測蛋白質(zhì)印跡,分析目標(biāo)蛋白灰度值,以內(nèi)參GAPDH比較,得出靶蛋白Notch1、Jagged1、Hes1相對含量。

2 結(jié)果

2.1 6組大鼠血清中TNF-α、IL-6、Leptin、APN水平比較 與NC組比較,GDM組大鼠血清中TNF-α、IL-6、Leptin升高,APN降低(P<0.05);與GDM組比較,L-PAE組、M-PAE組、H-PAE組大鼠血清中TNF-α、IL-6、Leptin降低,APN升高(P<0.05);與L-PAE組比較,M-PAE組、H-PAE組大鼠血清中TNF-α、IL-6、Leptin降低,APN升高(P<0.05);與M-PAE組比較,H-PAE組大鼠血清中TNF-α、IL-6、Leptin降低,APN升高(P<0.05);與H-PAE組比較,H-PAE+JFC組大鼠血清中TNF-α、IL-6、Leptin升高,APN降低(P<0.05)。見表1。

表1 6組大鼠血清中TNF-α、IL-6、Leptin、APN水平比較 n=12,

2.2 6組大鼠血清中血脂指標(biāo)比較 與NC組比較,GDM組大鼠血清中TC、TG、LDL-C升高,HDL-C降低(P<0.05);與GDM組比較,L-PAE組、M-PAE組、H-PAE組大鼠血清中TC、TG、LDL-C降低,HDL-C升高(P<0.05);與L-PAE組比較,M-PAE組、H-PAE組大鼠血清中TC、TG、LDL-C降低,HDL-C升高(P<0.05);與M-PAE組比較,H-PAE組大鼠血清中TC、TG、LDL-C降低,HDL-C升高(P<0.05);與H-PAE組比較,H-PAE+JFC組大鼠血清中TC、TG、LDL-C升高,HDL-C降低(P<0.05)。見表2。

表2 6組大鼠血清中血脂指標(biāo)比較 n=12,mmol/L,

2.3 6組大鼠FBG、FINS比較 與NC組比較,GDM組大鼠FBG(0 d、7 d、14 d)升高,FINS(0 d、7 d、14 d)降低(P<0.05);與GDM組比較,L-PAE組、M-PAE組、H-PAE組大鼠FBG(7 d、14 d)降低,FINS(7 d、14 d)升高(P<0.05);與L-PAE組比較,M-PAE組、H-PAE組大鼠FBG(7 d、14 d)降低,FINS(7 d、14 d)升高(P<0.05);與M-PAE組比較,H-PAE組大鼠FBG(7 d、14 d)降低,FINS(7 d、14 d)升高(P<0.05);與H-PAE組比較,H-PAE+JFC組大鼠FBG(7 d、14 d)升高,FINS(7 d、14 d)降低(P<0.05)。見表3。

表3 6組大鼠FBG、FINS水平比較

2.4 4組大鼠血清氧化應(yīng)激指標(biāo)比較 與NC組比較,GDM組大鼠血清中GSH-PX、SOD、CAT降低,MDA升高(P<0.05);與GDM組比較,L-PAE組、M-PAE組、H-PAE組大鼠血清中GSH-PX、SOD、CAT升高,MDA降低(P<0.05);與L-PAE組比較,M-PAE組、H-PAE組大鼠血清中GSH-PX、SOD、CAT升高,MDA降低(P<0.05);與M-PAE組比較,H-PAE組大鼠血清中GSH-PX、SOD、CAT升高,MDA降低(P<0.05);與H-PAE組比較,H-PAE+JFC組大鼠血清中GSH-PX、SOD、CAT降低,MDA升高(P<0.05)。見表4。

表4 6組大鼠血清中GSH-PX、MDA、SOD、CAT水平比較 n=12,

2.5 6組大鼠肝臟組織Notch1/Jagged1通路相關(guān)蛋白比較 與NC組比較,GDM組大鼠血清中Notch1、Jagged1、Hes1升高(P<0.05);與GDM組比較,L-PAE組、M-PAE組、H-PAE組大鼠血清中Notch1、Jagged1、Hes1降低(P<0.05);與L-PAE組比較,M-PAE組、H-PAE組大鼠血清中Notch1、Jagged1、Hes1降低(P<0.05);與M-PAE組比較,H-PAE組大鼠血清中Notch1、Jagged1、Hes1降低(P<0.05);與H-PAE組比較,H-PAE+JFC組大鼠血清中Notch1、Jagged1、Hes1升高(P<0.05)。見圖1,表5。

圖1 Western blot檢測大鼠肝臟組織Notch1、Jagged1、Hes1蛋白表達(dá);A NC組;B GDM組;C L-PAE組;D M-PAE組;E H-PAE組;F H-PAE+JFC組

表5 6組大鼠肝臟組織中Notch1、Jagged1、Hes1蛋白表達(dá)比較 n=12,

3 討論

GDM是發(fā)生在懷孕期間的一種嚴(yán)重影響健康的妊娠并發(fā)癥之一,一般出現(xiàn)在妊娠中期或者是妊娠晚期。在懷孕期間,母體代謝狀態(tài)會發(fā)生巨大的變化,從而影響機(jī)體對糖代謝的敏感性以及作用,對胰島素產(chǎn)生抵抗反應(yīng),隨之造成高血糖。因此,GDM是妊娠期間由胰島素抵抗和胰腺B細(xì)胞功能障礙引起的一種暫時性葡萄糖不耐受病癥[8,9]。研究表明在患GDM的女性中,其TG水平明顯高于未患GDM病癥的女性[10]。Li等[11]研究發(fā)現(xiàn)患有GDM的女性對胰島素敏感性較低,胰島素抵抗性較高,對胰島素抵抗會降低胰島素敏感性,因此在懷孕期間會引起進(jìn)餐后的高血糖,除此之外代謝應(yīng)激也可加速B細(xì)胞耗竭進(jìn)而導(dǎo)致懷孕期間胰島素的短缺和血糖的升高。本研究發(fā)現(xiàn),與NC組比較,GDM組大鼠FBG(0 d、7 d、14 d)、TC、TG、LDL-C、TNF-α、IL-6、Leptin、MDA、Notch1、Jagged1、Hes1升高,FINS(0 d、7 d、14 d)、HDL-C、APN、GSH-PX、SOD、CAT降低。由此可知,GDM大鼠除血糖升高,胰島素水平降低外,還會引起機(jī)體炎性因子水平升高,抗氧化能力降低,Notch1/Jagged1通路相關(guān)蛋白表達(dá)升高。

Liu等[12]在研究PAE對糖尿病大鼠腦病作用時發(fā)現(xiàn),PAE能夠降低糖尿病中晚期大鼠海馬區(qū)及大腦皮層神經(jīng)元糖基化終產(chǎn)物受體和核因子kappa B的表達(dá),顯著提升海馬組織中GSH-PX的含量,進(jìn)而降低糖尿病大鼠血糖并提高抗氧化能力。Liu等[13]研究發(fā)現(xiàn)PAE能夠促進(jìn)解偶聯(lián)蛋白1介導(dǎo)的線粒體融合,抑制線粒體氧化應(yīng)激,并在體內(nèi)和體外保持糖尿病性心肌病中的線粒體呼吸能力和心臟功能。研究表明PAE的抗炎作用主要表現(xiàn)在皮膚炎癥、關(guān)節(jié)炎、結(jié)腸炎、器官損害等,能夠通過抑制IL-6、MMP-1和TNF-α的釋放減輕炎性反應(yīng)[14]。機(jī)體通過調(diào)控胰島B細(xì)胞分泌胰島素降低血糖水平,但對GDM患者來說胰島素敏感性低,相比正常孕婦對胰島素的抵抗?fàn)顟B(tài)較為嚴(yán)重,因而導(dǎo)致高胰島素血癥,糖代謝紊亂[15]。本研究發(fā)現(xiàn),與GDM組比較,L-PAE組、M-PAE組、H-PAE組大鼠FBG(7 d、14 d)、TC、TG、LDL-C、TNF-α、IL-6、Leptin、MDA降低,FINS(7 d、14 d)、HDL-C、APN、GSH-PX、SOD、CAT升高。表明PAE對GDM大鼠具有降血糖升高胰島素水平的作用,降低炎性因子以及氧化應(yīng)激,進(jìn)而改善GDM大鼠糖代謝紊亂,且GDM大鼠對PAE劑量具有依賴性,其劑量越高,糖代謝紊亂改善效果越明顯。

Hes1作為Notch通路下游靶基因過表達(dá)能夠激活信號轉(zhuǎn)導(dǎo),提高轉(zhuǎn)錄激活因子與相應(yīng)位點結(jié)合活性[16]。朱慧志等[17]研究表明,抑制Notch1/Hes1通路能夠促進(jìn)骨髓源性間干細(xì)胞歸巢肺組織,調(diào)控輔助性T細(xì)胞(Th)相應(yīng)特異性轉(zhuǎn)錄因子水平,糾正Th1/Th2失衡,從而改善哮喘氣道炎癥。Hao等[18]研究發(fā)現(xiàn)PAE能夠降低lncRNA HOX轉(zhuǎn)錄物反義基因間RNA(HOTAIR)和Notch1表達(dá),HOTAIR可以通過下調(diào)miR-124激活Notch1/Jagged1信號通路,而PAE逆轉(zhuǎn)HOTAIR對Notch1/Jagged1信號通路激活的影響。本研究表明,與GDM組比較,L-PAE組、M-PAE組、H-PAE組大鼠Notch1、Jagged1、Hes1降低;與H-PAE組比較,H-PAE+JFC組大鼠FBG(7 d、14 d)、TC、TG、LDL-C、TNF-α、IL-6、Leptin、MDA、Notch1、Jagged1、Hes1升高,FINS(7 d、14 d)、HDL-C、APN降低。因此,PAE可能抑制Notch1/Jagged1通路相關(guān)蛋白的表達(dá)。

綜上所述,PAE可能抑制Notch1/Jagged1信號通路,提高胰島素水平,降低血糖,進(jìn)而改善GDM大鼠糖代謝紊亂。