東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)染色體結(jié)構(gòu)維持(SMC)蛋白的分子特性與系統(tǒng)進(jìn)化分析

錢(qián)加珺 ，張文德，張佳欣，趙 蕭，趙浩東，高旭澤，朱樂(lè)冉，陳大福，付中民，郭 睿

(福建農(nóng)林大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院(蜂學(xué)學(xué)院)/福建省蜂療研究所,福建 福州 350002)

東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)Nosemaceranae是一種專(zhuān)性侵染成年蜜蜂中腸上皮細(xì)胞的單細(xì)胞真菌病原，對(duì)蜂王、工蜂、雄蜂和幼蟲(chóng)均有感染性[1]。東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)侵染能引起蜜蜂中腸上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞、細(xì)胞凋亡和免疫應(yīng)答抑制，哺育力下降，壽命縮短，嚴(yán)重影響蜂群群勢(shì)和生產(chǎn)力[2]。目前，東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)的參考基因組[3]和全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組[4]均已公布，為深入開(kāi)展相關(guān)分子生物學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)。

染色體結(jié)構(gòu)維持(Structural maintenance of chromosome，SMC)蛋白在細(xì)菌、古生菌和真核生物中廣泛存在，可直接參與染色體的形成與結(jié)構(gòu)維持等動(dòng)態(tài)變化及DNA 的復(fù)制、重組和修復(fù)等過(guò)程，因而對(duì)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的組織、細(xì)胞分裂過(guò)程中遺傳物質(zhì)的準(zhǔn)確分離等均具有關(guān)鍵作用[5]。在水稻中，SMC1和SMC3-1基因被證實(shí)參與DNA 雙鏈斷裂損傷修復(fù)和有絲分裂等生物學(xué)過(guò)程[6]。作為SMC 復(fù)合體蛋白的成員之一，凝聚蛋白復(fù)合體Ⅰ通過(guò)分級(jí)折疊啟動(dòng)早期的染色質(zhì)凝聚，起到塑造、穩(wěn)定染色體的作用[7]。敲除凝聚蛋白復(fù)合體Ⅰ或Ⅱ的特異亞基均能引起中期染色體結(jié)構(gòu)的明顯異常[8]。然而對(duì)于東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)，SMC 相關(guān)研究至今依然缺失。

近期，筆者團(tuán)隊(duì)測(cè)定了nce-miR-15325 及其靶向的核凝聚復(fù)合體亞基(Nuclear condensin complex subunit，NCCS)基因在東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)侵染意大利蜜蜂工蜂過(guò)程中的表達(dá)譜，并發(fā)現(xiàn)nce-miR-15325 與NCCS具有相似的表達(dá)規(guī)律。本研究利用生物信息學(xué)方法解析東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)NCCS編碼的SMC 的分子特性，預(yù)測(cè)和分析東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)和其他物種SMC 的保守基序和結(jié)構(gòu)域，并進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，以期豐富東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)SMC的基礎(chǔ)信息，并為深入開(kāi)展相關(guān)功能研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 SMC 的分子特性分析

根據(jù)前期基于東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[9]預(yù)測(cè)出的NCCS序列，利用NCBI 網(wǎng)站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上的ORF 工具預(yù)測(cè)相應(yīng)的氨基酸序列。通過(guò)Expasy 網(wǎng)站(https://www.espasy.org/resources)上的Protparam、ProtScale 和SWISS-model 等軟件分析SMC 的理化性質(zhì)、親水性和三級(jí)結(jié)構(gòu)。使用SignalP 4.1 Server、NetPhos 3.1 Server、TMHMM 及SOPMA 等軟件[10]預(yù)測(cè)SMC 的信號(hào)肽、磷酸化位點(diǎn)、跨膜結(jié)構(gòu)域和二級(jí)結(jié)構(gòu)。采用PSORTⅡ軟件(https://www.genscript.com/psort.html)[11]進(jìn)行SMC 的亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)。

1.2 SMC 的保守基序和結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)

使用MEME 軟件(https://meme-suite.org/)[12]預(yù)測(cè)東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)、海倫腦炎微孢子蟲(chóng)

1.3 SMC 蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化分析

Encephalitozoon hellem、菲尼斯畢羅酵母Piromycescfinnis、發(fā)廯菌Trichophytontonsurans和黑曲霉Aspergillusmelleus等10 個(gè)物種SMC 的保守基序。通過(guò)Pfam 網(wǎng)站(http://pfam.xfam.org/search#tabview=tab1)查找東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)等10 個(gè)物種SMC 保守結(jié)構(gòu)域相關(guān)信息。采用TBtools 軟件預(yù)測(cè)上述10 個(gè)物種SMC 的結(jié)構(gòu)域，選擇默認(rèn)參數(shù)。

利用Blast 工具將東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)SMC 氨基酸序列比對(duì)到NCBI GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)，搜索序列相似性較高的其他物種的SMC。通過(guò)Mega 11.0 軟件[13]對(duì)東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)和其他物種的SMC 進(jìn)行氨基酸序列多重比對(duì)，采用鄰接法構(gòu)建基于SMC 的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，選擇軟件默認(rèn)參數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 SMC 的分子特性

東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)NCCS含有3 093 個(gè)核苷酸，編碼的SMC 含有1 102 個(gè)氨基酸。SMC 的分子式為C5 787H9 418N1 526O1 771S41，相對(duì)分子質(zhì)量約130 020，等電點(diǎn)為8.28；包含195 個(gè)負(fù)電荷氨基酸，其中天冬氨酸和谷氨酸分別有67 和128 個(gè)；包含202 個(gè)正電荷氨基酸，其中賴(lài)氨酸和精氨酸分別有169 和33 個(gè)；含量最高和最低的氨基酸分別為賴(lài)氨酸和色氨酸(表1)。

表1 東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)SMC 的氨基酸組成Table 1 Amino acid composition of SMC in Nosema ceranae

SMC 的脂溶系數(shù)為93.49，平均親水系數(shù)為-0.740，親水氨基酸數(shù)量比疏水氨基酸多(圖1A)，說(shuō)明該蛋白為親水性蛋白。SMC 中不存在典型的信號(hào)肽，說(shuō)明其為胞內(nèi)蛋白(圖1B)。另外，在SMC中預(yù)測(cè)到104 個(gè)磷酸化位點(diǎn)，包含50 個(gè)絲氨酸、26 個(gè)酪氨酸和28 個(gè)蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)(圖1C)。

二級(jí)結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示，SMC 含有787 個(gè)(71.42%)α-螺旋，106 條(9.62%)β-折疊，49 個(gè)(4.45%)β-轉(zhuǎn)角和160 個(gè)(14.52%) 無(wú)規(guī)則卷曲(圖2A)。三級(jí)結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示，SMC 的模板為6yvu.1.B，序列相似性為31.26%，其中61.00%的殘基自信度達(dá)80%以上(圖2B)。此外，SMC 同時(shí)定位于細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)和線(xiàn)粒體，占比分別為78.30%、8.70%和13.00%。

2.2 SMC 的保守基序與結(jié)構(gòu)域分析

在東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)SMC 中預(yù)測(cè)到9 個(gè)保守基序，分別為Motif 1、2、3、4、5、6、7、8、9；類(lèi)似地，在海倫腦炎微孢子蟲(chóng)、顆粒病微孢子蟲(chóng)Nosema granulosis、麥格水蚤漢氏孢蟲(chóng)Hamiltosporidium magnivora、康氏泰羅漢孢蟲(chóng)Thelohaniacontejeani、菲尼斯畢羅酵母、指間毛廯菌Trichophyton interdigitale、紫色毛廯菌Trichophytonviolaceum、發(fā)廯菌和黑曲霉的SMC 中同樣預(yù)測(cè)上述9 個(gè)Motif(圖3)，說(shuō)明SMC 在東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)和其他真菌物種中高度保守。

圖3 東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)和其他9 個(gè)物種SMC 包含的保守基序Fig.3 Conserved motifs included in SMC of Nosema ceranae and other nine species

在東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)SMC 中預(yù)測(cè)到4 個(gè)結(jié)構(gòu)域，包括1 個(gè)SMC_N、1 個(gè)SMC_hinge、1 個(gè)AAA_29 和1 個(gè)AAA_23；在海倫腦炎微孢子蟲(chóng)、指間毛廯菌和黑曲霉SMC 中同樣預(yù)測(cè)到1 個(gè)SMC_N、1 個(gè)SMC_hinge、1 個(gè)AAA_23 和1 個(gè)AAA_21；在顆粒病微孢子蟲(chóng)、麥格水蚤漢氏孢蟲(chóng)TBU02480.1 和康氏泰羅漢孢蟲(chóng)SMC 中預(yù)測(cè)到2 個(gè)相同的結(jié)構(gòu)域，包括1 個(gè)SMC_N 和1 個(gè)SMC_hinge；在麥格水蚤漢氏孢蟲(chóng)TBU02444.1 SMC 中預(yù)測(cè)到6 個(gè)結(jié)構(gòu)域，包括1 個(gè)SMC_N、1 個(gè)SMC_hinge、1 個(gè)AAA_29、1 個(gè)AAA_21、1 個(gè)AAA_23 和1 個(gè)AAA_15；在菲尼斯畢羅酵母SMC 中預(yù)測(cè)到5 個(gè)結(jié)構(gòu)域，包括1 個(gè)SMC_N、1 個(gè)SMC_hinge、1 個(gè)AAA_29、1 個(gè)AAA_21 和1 個(gè)AAA_23；在紫色毛廯菌SMC 中預(yù)測(cè)到3 個(gè)結(jié)構(gòu)域，包括1 個(gè)SMC_N、1 個(gè)SMC_hinge 和1 個(gè)AAA_15；在發(fā)廯菌SMC 中預(yù)測(cè)到3 個(gè)結(jié)構(gòu)域，包括1 個(gè)AAA_21、1 個(gè)SMC_N 和1 個(gè)SMC_hinge(圖4)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)和其他9 個(gè)物種的SMC 中均含有1 個(gè)SMC_N 和1 個(gè)SMC_hinge(圖4)。以上結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明SMC 在東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)和其他真菌物種中高度保守。

圖4 東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)和其他9 個(gè)物種SMC 的結(jié)構(gòu)域比較Fig.4 Comparison of structural domains within SMC in Nosema ceranae and other nine species

2.3 SMC 的系統(tǒng)進(jìn)化分析

如表2所示，東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)、海倫腦炎微孢子蟲(chóng)、顆粒病微孢子蟲(chóng)、康氏泰羅漢孢蟲(chóng)、菲尼斯畢羅酵母、指間毛廯菌、紫色毛廯菌、發(fā)廯菌和黑曲霉均僅含有1 個(gè)SMC，而麥格水蚤漢氏孢蟲(chóng)含有2 個(gè)SMC。

表2 東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)與其他9 個(gè)物種的SMC 蛋白概覽Table 2 Overview of SMC proteins in Nosema ceranae and other nine species

氨基酸序列多重比對(duì)結(jié)果顯示，東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)與菲尼斯畢羅酵母的SMC 序列相似性最高，達(dá)到61.96%，其次是與指間毛廯菌、發(fā)廯菌、紫色毛廯菌和黑曲霉，SMC 序列相似性均為60.98%，與康氏泰羅漢孢蟲(chóng)的SMC 序列相似性最低(34.73%)。

系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果顯示，東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)、顆粒病微孢子蟲(chóng)、麥格水蚤漢氏孢蟲(chóng)、康氏泰羅漢孢蟲(chóng)和海倫腦炎微孢子蟲(chóng)的SMC 聚為一個(gè)大支，而發(fā)廯菌、指間毛廯菌、紫色毛廯菌、黑曲霉和菲尼斯畢羅酵母的SMC 聚為一個(gè)大支；東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)與顆粒病微孢子蟲(chóng)的SMC 聚為一支，且置信度達(dá)到99%，說(shuō)明二者SMC 的進(jìn)化距離最近(圖5)。

圖5 鄰接法構(gòu)建基于SMC 的東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)與其他9 個(gè)物種的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.5 Phelogenetic tree of Nosema ceranae and other nine species based on SMC by neighbor-joining method

3 結(jié)論與討論

目前，由于缺乏成熟的轉(zhuǎn)基因操作技術(shù)體系，東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)絕大多數(shù)基因功能未明，相關(guān)信息匱乏。本研究通過(guò)生物信息學(xué)手段對(duì)東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)NCCS基因編碼的SMC 進(jìn)行分子特性解析，結(jié)果顯示，SMC 的分子式為C5 787H9 418N1 526O1 771S41，包含1 102 個(gè)氨基酸，相對(duì)分子質(zhì)量約130 020，等電點(diǎn)為8.28，脂溶系數(shù)為93.49，平均親水系數(shù)為-0.740，親水氨基酸數(shù)量多于疏水氨基酸，說(shuō)明SMC 可能是親水性蛋白；不含信號(hào)肽和跨膜螺旋區(qū)，說(shuō)明SMC 可能為胞內(nèi)蛋白和非跨膜蛋白。以上結(jié)果豐富了東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)NCCS基因的基本信息，為進(jìn)一步開(kāi)展相關(guān)功能研究提供了有價(jià)值的參考信息。另外，預(yù)測(cè)SMC 同時(shí)定位于細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)和線(xiàn)粒體，但主要定位于細(xì)胞核(占比78.30%)，鑒于染色體主要存在于細(xì)胞核，上述結(jié)果符合客觀實(shí)際；但預(yù)測(cè)到少量SMC 分布于細(xì)胞質(zhì)和線(xiàn)粒體，一方面需要通過(guò)分子生物學(xué)試驗(yàn)加以驗(yàn)證，另一方面暗示SMC 功能的潛在多樣性。

真核生物中存在6 種SMC，這6 種蛋白兩兩結(jié)合形成異二聚體，進(jìn)而結(jié)合其他組分形成復(fù)合體，分別為黏結(jié)蛋白復(fù)合體、凝聚蛋白復(fù)合體和SMC5-SMC6 復(fù)合體，這些復(fù)合體在DNA 修復(fù)、重組與復(fù)制等方面發(fā)揮重要作用[14]。SMC 在進(jìn)化上較為保守，從微生物到哺乳動(dòng)物的SMC 蛋白都具有相似的結(jié)構(gòu)[15]。本研究在東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)、海倫腦炎微孢子蟲(chóng)、麥格水蚤漢氏孢蟲(chóng)、顆粒病微孢子蟲(chóng)、康氏泰羅漢孢蟲(chóng)、菲尼斯畢羅酵母、指間毛廯菌、紫色毛廯菌、發(fā)廯菌和黑曲霉的SMC 中均預(yù)測(cè)到Motif 1～9 共9 個(gè)保守基序；此外，發(fā)現(xiàn)東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)和上述其他物種的SMC 均含有1 個(gè)SMC_N 和1 個(gè)SMC_hinge。以上結(jié)果表明SMC 在東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)和其他真菌中具有高度保守性，推測(cè)SMC 在東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)和上述其他真菌中發(fā)揮類(lèi)似功能。本研究發(fā)現(xiàn)，東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)、顆粒病微孢子蟲(chóng)、海倫腦炎微孢子蟲(chóng)、麥格水蚤漢氏孢蟲(chóng)和康氏泰羅漢孢蟲(chóng)的SMC 聚為一個(gè)大支，說(shuō)明這些物種的SMC 親緣關(guān)系較近；東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)與顆粒病微孢子蟲(chóng)的SMC 聚為一支，置信度為99 %，說(shuō)明二者的SMC 進(jìn)化距離最近。

前人研究發(fā)現(xiàn)SMC 的C 端和N 端相互結(jié)合形成ATP 酶功能域，因此SMC 蛋白也屬于ABC(ATP binding cassette)蛋白家族[16]，ABC 蛋白在東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)的生命活動(dòng)中起到重要作用[17]。因此，推測(cè)SMC 在東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)中發(fā)揮的功能類(lèi)似于ABC 蛋白。

通過(guò)建立東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)侵染成年蜜蜂的模式進(jìn)行東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)的基因功能研究已見(jiàn)諸報(bào)道[18-19]。我們下一步擬通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄合成NCCS的dsRNA，并通過(guò)飼喂法探究東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)侵染蜜蜂宿主過(guò)程中NCCS的功能。