背外側(cè)被蓋核GABA能神經(jīng)元在七氟醚致意識(shí)改變中的作用機(jī)制

鄭丹旭,汪 瑩,徐 茂,蔡 霜,王 袁,喻 田,羅天元,余守洋

(1.遵義醫(yī)科大學(xué) 貴州省麻醉與器官保護(hù)基礎(chǔ)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,貴州 遵義 563099;2.貴州省普通高等學(xué)校腦科學(xué)特色重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,貴州 遵義 563009;3.遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 麻醉科,貴州 遵義 563000)

全身麻醉藥因能產(chǎn)生可逆性意識(shí)消失、痛覺(jué)消失、反射抑制和肌肉松弛等作用而被廣泛運(yùn)用于臨床手術(shù),乙醚等全身麻醉藥物成功地應(yīng)用于臨床手術(shù)是近代麻醉學(xué)的開(kāi)端。然而一百多年來(lái),全身麻醉藥物誘導(dǎo)可逆性意識(shí)消失的機(jī)制仍然是未解之謎。全身麻醉與睡眠具有相似性且相互影響,麻醉與睡眠均表現(xiàn)為覺(jué)醒水平降低以及對(duì)外界環(huán)境刺激反應(yīng)的抑制。近年來(lái)有研究表明,全身麻醉狀態(tài)與自然睡眠具有相似的腦電圖以及局部的腦功能變化[1]。腦血流影像學(xué)實(shí)驗(yàn)也表明麻醉藥物誘導(dǎo)意識(shí)消失和非快動(dòng)眼睡眠狀態(tài)相似,腦血流量都呈下降趨勢(shì),丘腦、前腦基底、額葉、頂葉皮質(zhì)等區(qū)域呈現(xiàn)活動(dòng)抑制,并且高級(jí)信息整合區(qū)域的抑制更加明顯[2-4]。

背外側(cè)被蓋核(laterodorsal tegmentum,LDT)是位于中腦導(dǎo)水管周?chē)屹|(zhì)的一個(gè)核團(tuán),其不僅是上行中腦膽堿能系統(tǒng)(ascending mesolimbic cholinergic system ,AMCS)的起源,同時(shí)也是上行網(wǎng)狀激活系統(tǒng)(ascending reticular activating system,ARAS)與皮層之間相互聯(lián)系的重要中繼站[5]。LDT已被發(fā)現(xiàn)在各種行為中發(fā)揮關(guān)鍵作用,包括喚醒、獎(jiǎng)勵(lì)和先天防御[6-9]。LDT中的神經(jīng)元排列成高度異質(zhì)性的結(jié)構(gòu),包括膽堿能、谷氨酸能和γ-氨基丁酸能神經(jīng)元[10]。LDT接收的神經(jīng)輸入大部分來(lái)自中腦、后腦、皮層和下丘腦,也有相當(dāng)一部分來(lái)自邊緣系統(tǒng),包括下丘腦外側(cè)(lateral hypothalamus,LH)、中腦腹側(cè)被蓋區(qū)(ventral tegmental area,VTA)和中央杏仁核(central amygdaloid nucleus ,CeA)。LDT的輸出大部分到達(dá)中腦、丘腦和皮層,包括伏隔核(nucleus accumben,NAc)、下丘腦前區(qū)(anterior hypothalamus,AH)、小腦、mPFC、海馬(hippocampus,HI)、嗅球(olfactory bulb,OB)、視前區(qū)(preoptic region,PO)、VTA[9]。其中NAc[11]、內(nèi)側(cè)前額葉皮層(medial prefrontal cortex,mPFC )[12]、VTA等[13]多個(gè)核團(tuán)均有報(bào)道與麻醉-覺(jué)醒相關(guān),表明LDT可能是作為調(diào)節(jié)麻醉的節(jié)點(diǎn)之一。

本實(shí)驗(yàn)擬采用光纖鈣信號(hào)記錄七氟烷麻醉過(guò)程中LDT腦區(qū)GABAergic神經(jīng)元的活性變化,并通過(guò)化學(xué)遺傳方法特異性調(diào)控小鼠LDT腦區(qū)GABA能神經(jīng)元,從而研究LDT腦區(qū)GABA能神經(jīng)元在七氟醚麻醉致意識(shí)改變中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)小鼠為健康雄性Vgat-IRES-Cre(在GABA神經(jīng)元中表達(dá)Cre酶的轉(zhuǎn)基因小鼠,簡(jiǎn)稱(chēng)Vgat小鼠)和tdTomato轉(zhuǎn)基因小鼠(與Cre小鼠交配后,再由Cre的細(xì)胞中表達(dá)紅色熒光蛋白,簡(jiǎn)稱(chēng)Ai14小鼠)分別來(lái)自北京生命科學(xué)研究所羅敏敏實(shí)驗(yàn)室和上?？萍即髮W(xué)沈偉實(shí)驗(yàn)室。飼養(yǎng)于遵義醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)動(dòng)物房,小鼠被單獨(dú)飼養(yǎng)在能自由獲取食物和水的通風(fēng)隔離室中,并伴隨12 h/12 h的明暗循環(huán)(8∶00關(guān)燈,20∶00開(kāi)燈),環(huán)境溫度維持在23～26 ℃,相對(duì)濕度維持在50%～60%。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 腦立體定位儀(小鼠)、微量注射泵(WZS-50F6)、微量注射針、小鼠麻醉誘導(dǎo)箱、七氟醚麻醉氣體揮發(fā)罐購(gòu)自于RWD科技有限公司;冰凍切片機(jī)CM1950購(gòu)自Leica;BX51W1-IR7顯微鏡(手術(shù))、熒光顯微鏡購(gòu)自于日本Olympus公司;腦電記錄系統(tǒng)購(gòu)自于Bio-Signal公司;P-97微量電極拉制儀購(gòu)自美國(guó)Sutter公司。多通道光纖記錄系統(tǒng)購(gòu)自于杭州熒科生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 利多卡因注射液購(gòu)自西南藥業(yè)股份有限公司;多聚甲醛(粉劑)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;rAAV2/9-EF1α-DIO-hM3D(Gq)-EGFP、rAAV2/9-EF1α-DIO-hM4D(Gi)-EGFP、rAAV2/9-EF1α-DIO-EGFP、AAV-hSyn-DIO-GCaMP6s購(gòu)自于布林凱斯生物技術(shù)有限公司;異氟烷購(gòu)自RWD 生命科技有限公司;過(guò)氧化氫消毒液購(gòu)自貴州鑫源生物科技有限公司;磷酸鹽緩沖溶液(PBS)購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;0.9%氯化鈉注射液購(gòu)自于貴州科倫藥業(yè)有限公司;包埋劑購(gòu)自于美國(guó)Sakura Finerek公司;碘伏消毒液購(gòu)自于江西百醫(yī)衛(wèi)仕醫(yī)療科技有限公司;封閉用正常驢血清購(gòu)自于索萊寶科技有限公司;牛血清白蛋白購(gòu)自于Servicebio公司;75%乙醇消毒液購(gòu)自于山東安捷高科消毒科技有限公司;蔗糖(粉劑)購(gòu)自于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。義齒自凝型基托樹(shù)脂購(gòu)自于貴州愛(ài)瑞達(dá)生物科技有限公司;cozapine-N-oxide購(gòu)自于美國(guó)Med Chem Express LLC。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 光纖鈣信號(hào)小鼠模型的建立 選取健康成年雄性Vgat:Ai14小鼠8只,體重20～24 g,將實(shí)驗(yàn)小鼠放入濃度1.2%異氟醚麻醉誘導(dǎo)箱中,待小鼠翻正反射消失,用動(dòng)物剃毛機(jī),剃除小鼠頭部手術(shù)部位毛發(fā),將小鼠置于小鼠腦立體定位儀上,并持續(xù)吸入0.8%的異氟醚,手術(shù)部位用碘伏消毒,然后注射局部麻醉藥利多卡因。剪開(kāi)頭皮,暴露手術(shù)部位,并用棉簽蘸取濃度10%過(guò)氧化氫消毒液擦拭顱骨表面,以此輔助顱骨縫能清晰暴露于顯微鏡下。隨后進(jìn)行調(diào)平,首先確定Bregma點(diǎn)和Lambda點(diǎn)位置,以B點(diǎn)為原點(diǎn),左右2.1 mm及B點(diǎn)和L點(diǎn),前后高度差小于0.03 mm,即為調(diào)平。根據(jù)第3版小鼠腦圖譜(watson and paxinos)定位LDT:以Bregma點(diǎn)為參照原點(diǎn),前后:-4.96 mm,內(nèi)外:±0.45 mm ,腹背:-3.2 mm,用墨水做標(biāo)記,然后用顱骨鉆鉆出小洞。微玻璃電極100 nL/min抽取100 nL病毒AAV-hSyn-DIO-GCaMP6s并以速度10 nL/min單側(cè)注射到小鼠LDT區(qū),并將光纖陶瓷插芯(直徑:200 μm)放置在高于病毒處0.02 mm處。用1454膠將顱骨與光纖陶瓷插芯固定,待膠水干燥后,用自凝型義齒基托樹(shù)脂將光纖固定于顱骨表面,將小鼠取下放在恒溫環(huán)境待到其蘇醒。待病毒轉(zhuǎn)染表達(dá)3周后,進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)記錄。

1.2.2 神經(jīng)元鈣信號(hào)記錄 本實(shí)驗(yàn)利用多通道光纖記錄系統(tǒng)記錄小鼠特異性神經(jīng)元鈣信號(hào)(圖1)。將小鼠放置于麻醉誘導(dǎo)盒中,在麻醉開(kāi)始前5 min記錄,隨后給與濃度為2.3%七氟醚進(jìn)行麻醉(打上標(biāo)記),待小鼠翻正反射消失后持續(xù)麻醉20 min,麻醉結(jié)束后(打上標(biāo)記),待翻正反射恢復(fù)以后,繼續(xù)記錄5 min。將記錄的結(jié)果應(yīng)用Inper分析軟件 InperDataProcess進(jìn)行數(shù)據(jù)預(yù)處理和數(shù)據(jù)再分析,計(jì)算ΔF/F,ΔF/F = (F - Fbaseline) / Fbaseline,Fbaseline為麻醉前或麻醉維持過(guò)程中的平均值。

圖1 神經(jīng)元鈣信號(hào)記錄流程

1.2.3 病毒注射位置驗(yàn)證及免疫熒光染色 小鼠吸入濃度1.4%異氟醚,待其無(wú)疼痛反應(yīng)后,手術(shù)暴露胸腔并經(jīng)心臟主動(dòng)脈先后灌注4 ℃預(yù)冷的PBS緩沖液及甲醛。灌注完成后,取腦并浸泡于4 % 甲醛溶液4 ℃過(guò)夜進(jìn)行后固定,然后入30%蔗糖溶液進(jìn)行脫水。待腦組織沉糖后用包埋劑包埋進(jìn)行冷凍切片,切片厚度為30 μm,將切片浸泡于PBS緩沖液中,將切下的腦片貼于載玻片上于熒光顯微鏡下觀察。

1.2.4 化學(xué)遺傳學(xué)小鼠模型建立 選取健康雄性Vgat:Ai14 小鼠24只,隨機(jī)分為化學(xué)遺傳激活組、抑制組和對(duì)照組。參照1.2.1的方法建立化學(xué)遺傳學(xué)模型。在小鼠雙側(cè)LDT分別注入100 nL不同的病毒:化學(xué)遺傳激活組(n=8),rAAV2/9-EF1α-DIO-hM3D(Gq)-EGFP;抑制組(n=8),AAV2/9-EF1α-DIO-hM4D-(Gi)-EGFP;對(duì)照組(n=8),rAAV2/9-EF1α-DIO-EGFP。隨后,在小鼠顱骨表面(AP:+1,ML:±1.5;AP:-3.5,ML:±1)4個(gè)點(diǎn)鉆入4顆顱骨釘,將腦電電極的4根銀絲分別纏繞在對(duì)應(yīng)的顱骨釘上,用1454膠水固定,待膠水干燥后,用自凝型義齒基托樹(shù)脂將腦電電極及光纖固定于顱骨表面,將小鼠取下放在恒溫環(huán)境待到其蘇醒。病毒轉(zhuǎn)染表達(dá)3周后,進(jìn)行后續(xù)化學(xué)遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)記錄。

1.2.5 化學(xué)遺傳學(xué)激活/抑制LDTVgat神經(jīng)元活性記錄的行為學(xué)及腦電記錄 化學(xué)遺傳學(xué)行為及腦電記錄均在9∶00～17∶00時(shí)間進(jìn)行,室溫控制在23 ℃左右,實(shí)驗(yàn)前1 h分別給實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠腹腔注射1 mg/kg的氯氮平氧化物(clozapine-N-oxide,CNO)及生理鹽水(normal saline,NS),待CNO起效后開(kāi)始進(jìn)行實(shí)驗(yàn)(圖2)。首先記錄5 min清醒狀態(tài)下小鼠的腦電波形,之后將小鼠置于濃度為2.3%七氟醚的麻醉誘導(dǎo)盒中,記錄小鼠翻正反射消失(loss of righting reflex,LORR)時(shí)間,并打上標(biāo)記,在小鼠出現(xiàn)翻正反射恢復(fù)(recovery of righting reflex,RORR)后,持續(xù)麻醉20 min,然后關(guān)閉七氟醚揮發(fā)罐,并用氣體回收器抽出殘留七氟醚,并記錄小鼠RORR,待RORR出現(xiàn)后,繼續(xù)記錄5 min。將實(shí)驗(yàn)記錄的腦電數(shù)據(jù)錄入Spike 2腦電分析軟件得到相應(yīng)數(shù)據(jù),再用SPSS進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,然后利用Graphpad Prism 6做出相關(guān)統(tǒng)計(jì)圖。行為學(xué)數(shù)據(jù)直接用SPSS進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,用Graphpad Prism 6做出統(tǒng)計(jì)圖。

圖2 化學(xué)遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)流程

1.2.6 免疫熒光染色 化學(xué)遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)完畢后,對(duì)小鼠進(jìn)行灌注取腦。將切下來(lái)的腦片置于載玻片上,在室溫下封閉液孵育2 h(封閉液:0.3% Triton X-100,1%牛血清白蛋白以及 10%山羊血清的 PBS緩沖液),之后將腦片置于一抗稀釋液(稀釋比例1∶200)4 ℃過(guò)夜,第二天復(fù)溫30 min后,用PBS緩沖液洗滌3次(10 min/次),然后置于二抗稀釋液(稀釋比例:1∶1 000)中室溫孵育2 h,再用PBS緩沖劑洗滌3次(10 min/次)。洗滌完畢后將玻片晾干,用DAPI封閉并蓋上蓋玻片。在熒光顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 在七氟醚麻醉過(guò)程中LDTVgat的活性變化情況 七氟醚麻醉鈣信號(hào)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中(圖3),選擇分為6個(gè)時(shí)間段對(duì)LDTVgat鈣信號(hào)活性變化進(jìn)行分析,分別是清醒期(LORR前100～50 s)、麻醉誘導(dǎo)期(LORR前50 s)、麻醉早期(LORR后100 s)、麻醉末期(RORR前100～50 s)、麻醉恢復(fù)期(RORR前50 s)以及蘇醒期(RORR后100 s)。結(jié)果顯示,吸入濃度2.3%七氟醚后麻醉誘導(dǎo)期鈣信號(hào)活性較清醒期明顯下降(P<0.01),且在麻醉早期,鈣信號(hào)活性進(jìn)一步下降(P<0.01)。而在麻醉蘇醒階段,麻醉恢復(fù)期鈣信號(hào)較麻醉末期明顯增強(qiáng)(P<0.01),且在蘇醒期鈣信號(hào)活性也較麻醉恢復(fù)期進(jìn)一步增強(qiáng)(P<0.01)。上述結(jié)果表明在七氟醚全身麻醉藥發(fā)揮作用過(guò)程中LDTVgat活性受到抑制。提示LDTVgat參與了七氟醚致意識(shí)改變過(guò)程。

A:第3版小鼠腦圖譜中,LDT層面冠狀切面,黑色方框選中位置為L(zhǎng)DT;B:小鼠插入陶瓷光纖示意;C:小鼠腦切片病毒位置驗(yàn)證圖(200 μm);D:E相關(guān)熱量圖;E:小鼠給與七氟醚后發(fā)生LORR的前后100 s事件相關(guān)線圖,深紅色線代表均值粉色陰影區(qū)域代表標(biāo)準(zhǔn)差(s),綠色虛線代表給藥時(shí)刻;F:D圖均值的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果;G:H相關(guān)熱量圖;H:為小鼠給與七氟醚后發(fā)生RORR的前后100 s事件相關(guān)線圖,深紅色線代表均值粉色陰影區(qū)域代表標(biāo)準(zhǔn)差(s),綠色虛線代表RORR出現(xiàn)時(shí)刻; I:G圖均值的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果;**:P<0.01;n=6。圖3 在七氟醚麻醉過(guò)程中LDTVgat的變化情況

2.2 化學(xué)遺傳學(xué)特異性調(diào)控LDTVgat對(duì)七氟醚麻醉的影響

2.2.1 化學(xué)遺傳學(xué)激活LDTVgat在七氟醚麻醉下免疫熒光驗(yàn)證 將rAAV2/9-EF1α-DIO-hM3D(Gq)-EGFP注射到Vgat-IRES-Cre小鼠LDT腦區(qū),免疫熒光染色結(jié)果顯示,病毒特異的標(biāo)記了Vagt神經(jīng)元,結(jié)果如圖4。

A:hM3D(Gq)病毒(100 μm);B:Vgat神經(jīng)元(100 μm);C:神經(jīng)元免疫熒光染色與病毒重合結(jié)果(100 μm);D:C圖的局部放大圖。圖4 化學(xué)遺傳學(xué)激活 LDTVgat神經(jīng)元病毒注射位點(diǎn)驗(yàn)證

2.2.2 化學(xué)遺傳學(xué)激活LDTVgat對(duì)七氟醚麻醉下小鼠行為學(xué)及皮層腦電的影響 利用化學(xué)遺傳學(xué)手段激活LDTVgat后小鼠在七氟醚麻醉下行為學(xué)及皮層腦電分析結(jié)果(圖5):在LORR過(guò)程中:hM3DqNS組LORR時(shí)間為(90.89±7.6)s,而hM3DqCNO組LORR時(shí)間為(69.7±4.3)s,皮層腦電結(jié)果為在麻醉誘導(dǎo)期hM3DqNS組δ波為0.37±0.1,γ波為0.17±0.04,而hM3DqCNO組δ波為0.56±0.16,γ波為0.08±0.06,對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,認(rèn)為化學(xué)遺傳學(xué)激活LDTVgat神經(jīng)元縮短了七氟醚麻醉下小鼠LORR時(shí)間。而在RORR過(guò)程中:在七氟醚麻醉組hM3DqNS組RORR時(shí)間為(161.3±18.7)s,而hM3DqCNO組RORR時(shí)間為(337.0±180)s,皮層腦電的結(jié)果為在麻醉恢復(fù)期hM3DqNS組γ波為0.10±0.02,而hM3DqCNO組γ波為0.06±0.02,在麻醉過(guò)程中爆發(fā)性抑制率(burst suppression ratio,BSR) 為(1.260±1.154)%,hM3DqCNO組為(27.66±22.70)%,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,認(rèn)為化學(xué)遺傳學(xué)激活LDTVgat可以促進(jìn)七氟醚麻醉效應(yīng)。

A:化學(xué)遺傳學(xué)激活Vgat神經(jīng)元縮短七氟醚麻醉誘導(dǎo)時(shí)間;B:激活Vgat神經(jīng)元對(duì)麻醉誘導(dǎo)期皮層腦電的影響;C:激活Vgat神經(jīng)元會(huì)延長(zhǎng)七氟醚麻醉蘇醒時(shí)間;D:激活Vgat神經(jīng)元對(duì)麻醉蘇醒期皮層腦電的影響;E:化學(xué)遺傳學(xué)激活Vgat神經(jīng)元在七氟醚麻醉中BSR增加;F:整個(gè)麻醉過(guò)程中BSR變化。腦電數(shù)據(jù)采用配對(duì)t檢驗(yàn)進(jìn)行分析;行為學(xué)各組數(shù)據(jù)間采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行分析;*:P<0.05。圖5 化學(xué)遺傳學(xué)激活LDTVgat神經(jīng)元促進(jìn)七氟醚的麻醉效應(yīng)

2.2.3 化學(xué)遺傳學(xué)抑制LDTVgat在七氟醚麻醉下免疫熒光驗(yàn)證 將 rAAV2/9-EF1α-DIO-hM4D(Gi)-EGFP注射到Vgat-IRES-Cre小鼠LDT腦區(qū),免疫熒光染色結(jié)果顯示,病毒特異的標(biāo)記了Vgat神經(jīng)元,結(jié)果如圖6。

A:hM4D(Di)病毒(100 μm);B:Vgat神經(jīng)元(100 μm);C:神經(jīng)元免疫熒光染色與病毒重合結(jié)果(100 μm);D:C圖的局部放大圖。圖6 化學(xué)遺傳學(xué)抑制 LDTVgat神經(jīng)元病毒注射位點(diǎn)驗(yàn)證

2.2.4 化學(xué)遺傳學(xué)抑制LDTVgat對(duì)七氟醚麻醉下小鼠行為學(xué)及皮層腦電的影響 利用化學(xué)遺傳學(xué)手段抑制LDTVgat神經(jīng)元后小鼠在七氟醚麻醉下行為學(xué)及皮層腦電分析結(jié)果(圖7):在LORR過(guò)程中:hM4DiNS組LORR時(shí)間為(89.67±11.62)s,而hM4DiCNO組LORR時(shí)間為(112.0±18.9)s;皮層腦電結(jié)果:在麻醉誘導(dǎo)期hM4DiNS組δ波為0.60±0.13,而hM4DiCNO組δ波為0.33±0.15,對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,認(rèn)為化學(xué)遺傳學(xué)抑制LDTVgat神經(jīng)元延長(zhǎng)了七氟醚麻醉下小鼠的麻醉誘導(dǎo)時(shí)間。而在RORR過(guò)程中,在七氟醚麻醉下hM4DiNS組RORR時(shí)間為(149.3±58.60)s,而hM4DiCNO組RORR時(shí)間為(101.7±28.4)s;皮層腦電的結(jié)果:在麻醉恢復(fù)期hM4DiNS組δ波(1～4 Hz)為0.50±0.10,而hM4DiCNO組δ波為0.30±0.10,γ波為0.05±0.03,在麻醉過(guò)程中,hM4DiNS組BSR為(23.07±20.94)%,hM4DiCNO組為(22.57±22.27)%,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,認(rèn)為化學(xué)遺傳學(xué)抑制LDTVgat神經(jīng)元可以縮短小鼠七氟醚麻醉蘇醒時(shí)間。

A:化學(xué)遺傳學(xué)抑制Vgat神經(jīng)元延長(zhǎng)七氟醚麻醉誘導(dǎo)時(shí)間;B:抑制Vgat神經(jīng)元對(duì)麻醉誘導(dǎo)期皮層腦電的影響;C:抑制Vgat神經(jīng)元會(huì)縮短七氟醚麻醉蘇醒時(shí)間;D:抑制Vgat神經(jīng)元對(duì)麻醉蘇醒期皮層腦電的影響;E:化學(xué)遺傳學(xué)抑制Vgat神經(jīng)元在七氟醚麻醉中BSR無(wú)明顯變化;F:整個(gè)麻醉過(guò)程中BSR變化。腦電數(shù)據(jù)采用配對(duì)t檢驗(yàn)進(jìn)行分析;行為學(xué)各組數(shù)據(jù)間采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行分析;*:P<0.05。圖7 化學(xué)遺傳學(xué)抑制LDTVgat神經(jīng)元促進(jìn)七氟醚的麻醉蘇醒效應(yīng)

3 討論

GABA能系統(tǒng)在控制清醒和睡眠過(guò)程中起著重要作用,許多麻醉藥和鎮(zhèn)靜藥物通過(guò)增強(qiáng)GABAA受體的導(dǎo)電性而起作用[14]。有實(shí)驗(yàn)表明異氟烷和丙泊酚不會(huì)改變GABA和谷氨酸的攝取、結(jié)合或者轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程[15],然而異氟烷和丙泊酚已被證明能抑制皮層谷氨酸和GABA神經(jīng)遞質(zhì)的釋放[16]。光纖鈣信號(hào)記錄是將鈣離子濃度敏感蛋白(genetically encoded fluorescent calciμm indicator GCaMP)表達(dá)至特定神經(jīng)元中,通過(guò)光纖信號(hào)激發(fā)GCaMP的熒光可實(shí)時(shí)記錄熒光信號(hào)強(qiáng)度的方法[17]。該方法記錄的是被標(biāo)記的神經(jīng)元群體信號(hào),在本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),Vgat神經(jīng)元群體的活性在麻醉過(guò)程中呈現(xiàn)下降趨勢(shì),而在麻醉停止后意識(shí)恢復(fù)過(guò)程中,出現(xiàn)上升趨勢(shì)。Luo等[18]研究發(fā)現(xiàn),使用光纖鈣信號(hào)記錄腹外側(cè)視前核(ventrolateral preoptic nucleus,VLPO)腦區(qū)的Vgat能神經(jīng)元在丙泊酚、異氟烷、氯胺酮等麻醉后,神經(jīng)元的Ca2+活性被強(qiáng)烈抑制,這與我們的結(jié)果是一致的。進(jìn)一步使用內(nèi)窺鏡成像技術(shù)發(fā)現(xiàn),在麻醉過(guò)程中大部分Vgat神經(jīng)元活性被抑制,部分神經(jīng)元活性沒(méi)有變化,但仍有少部分Vgat能神經(jīng)元在麻醉過(guò)程中被激活,而這部分被激活的Vgat神經(jīng)元可能發(fā)揮著重要作用。猜測(cè)在LDT腦區(qū)的Vgat神經(jīng)元可能和VLPO腦區(qū)結(jié)果相似。在七氟醚致全身麻醉過(guò)程中,大部分LDTVgat活性受到抑制,由于實(shí)驗(yàn)技術(shù)的局限性,我們未能對(duì)不同狀態(tài)的LDTVgat活性進(jìn)行細(xì)致的觀察。

在脊椎動(dòng)物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中,GABA是分布最廣泛的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)[19],而在LDT腦區(qū),LDT所占比例最大為58%。GABAA和GABAC亞型與氯離子通道耦合,而GABAB亞型為G蛋白偶聯(lián)受體[20]。GABA受體激動(dòng)劑被證明會(huì)破壞發(fā)育階段大鼠的皮層突觸功能,導(dǎo)致出現(xiàn)記憶障礙[21]。而注射GABAA受體激動(dòng)劑可減少大鼠引起翻正反射所用的麻醉劑量[22]。有數(shù)據(jù)表明,丙泊酚通過(guò)增強(qiáng)GABAA受體介導(dǎo)的緊張性抑制來(lái)抑制海馬CA1神經(jīng)元的興奮性[23]。氯胺酮、水合氯醛、氟烷麻醉和非快速眼動(dòng)睡眠均能降低VTA清醒激活Vgat神經(jīng)元的放電率[24]。本研究發(fā)現(xiàn),激活LDTVgat可以縮短七氟醚麻醉誘導(dǎo)時(shí)間,并延長(zhǎng)麻醉恢復(fù)時(shí)間。而抑制LDTVgat則出現(xiàn)與之相反的結(jié)果。δ震蕩是NREM期間的典型震蕩[25],并且有研究表明,在麻醉誘導(dǎo)期或維持階段,可以觀察到δ震蕩[26]。而皮層γ頻率節(jié)律被認(rèn)為是安靜睡眠時(shí)期EEG的特征波[27]。本研究發(fā)現(xiàn),激活LDTVgat神經(jīng)元γ波增加,皮層活動(dòng)增加;而抑制LDTVgat神經(jīng)元δ波增加,皮層活動(dòng)減少。

本實(shí)驗(yàn)仍存在一些局限性:在LDT腦區(qū)除了GABA能神經(jīng)元以外,還存在膽堿能神經(jīng)元以及谷氨酸能神經(jīng)元[10],它們?cè)诼樽碇乱庾R(shí)改變過(guò)程中的作用及其之間的局部環(huán)路仍不清楚。另一方面,LDT腦區(qū)分為多個(gè)亞區(qū),本實(shí)驗(yàn)并未區(qū)分各個(gè)亞區(qū),各亞區(qū)在麻醉中的作用仍待進(jìn)一步研究。