人參皂苷Re通過(guò)TRPC介導(dǎo)的鈣信號(hào)通路改善自發(fā)性高血壓大鼠左心室肥厚

王 晶,李孟婷,鄧 江,楊丹莉,高 楊

(遵義醫(yī)科大學(xué) 1.藥學(xué)院;2.基礎(chǔ)藥理教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室暨特色民族藥教育部國(guó)際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室,貴州 遵義 563099)

高血壓是最常見(jiàn)的心血管疾病之一,全世界約有25%成年人患有高血壓,且患病率隨年齡的增加而增長(zhǎng)[1]。在中國(guó),約有2.45億成年人深受高血壓困擾[2]。高血壓是心臟相關(guān)疾病發(fā)病率的重要風(fēng)險(xiǎn)因素之一,左心室是高血壓的主要損害靶點(diǎn)[3]。高血壓使左心室壓力和室壁張力增加,后負(fù)荷增加,最初左心室為了適應(yīng)這種壓力超負(fù)荷狀態(tài),心肌細(xì)胞通過(guò)增加肌節(jié)生長(zhǎng)以維持心臟的正常功能,表現(xiàn)為心肌細(xì)胞體積的增加,但隨著時(shí)間的推移,長(zhǎng)期的刺激會(huì)導(dǎo)致這種適應(yīng)性生長(zhǎng)失代償,并導(dǎo)致細(xì)胞核內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄的改變,發(fā)展成為病理性左心室肥厚(left ventricular hypertrophy,LVH)[4]。LVH是心臟事件的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,也是左心室重構(gòu)及心臟損傷的主要表現(xiàn)之一[4],會(huì)增加心力衰竭的風(fēng)險(xiǎn)。及時(shí)減輕LVH能夠改善心室重構(gòu)及心臟損傷的發(fā)生,維持心臟功能,降低心力衰竭的發(fā)病率及死亡率,因此對(duì)LVH治療的研究具有重要意義。

Ca2+是心肌細(xì)胞興奮-收縮偶聯(lián)的基礎(chǔ),也是細(xì)胞內(nèi)多種鈣信號(hào)相關(guān)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)的核心調(diào)控因子,調(diào)控下游基因表達(dá),參與調(diào)節(jié)不同的細(xì)胞功能[5]。經(jīng)典瞬時(shí)受體電位通道(transient receptor potential canonical channel,TRPC)是一種非選擇性陽(yáng)離子通道,其過(guò)度表達(dá)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度(intracellular calcium ion concentration,[Ca2+]i)的上升[6],并且能通過(guò)激活鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(calcineurin,CaN)/活化T細(xì)胞核因子(nuclear factor of activating T cell,NFAT)[7]和(或)鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ(cam-dependent protein kinase Ⅱ,CaMKⅡ)/組蛋白脫乙酰酶(histone deacetylase,HDAC)2種鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與心功能的調(diào)節(jié)[8]。有大量的研究表明TRPC在多種體內(nèi)外模型中參與心肌肥厚的調(diào)節(jié),并被確定為心肌肥厚的重要調(diào)節(jié)因子。如Zou等[7]研究表明自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rats,SHR)LVH的發(fā)生發(fā)展與TRPC1/CaN/NFATc3信號(hào)通路的上調(diào)有關(guān)。還有研究表明TRPC3表達(dá)在主動(dòng)脈弓縮窄(transverse aortic constriction,TAC)誘導(dǎo)的大鼠左心室肥厚中上調(diào)[9]。此外,TRPC1/C4介導(dǎo)成年大鼠心肌細(xì)胞中的背景Ca2+進(jìn)入,作為神經(jīng)體液和壓力超負(fù)荷誘導(dǎo)的心肌肥厚的關(guān)鍵介導(dǎo)物[10]。

人參皂苷Re(Ginsenoside Re,GS-Re)屬于三醇類皂苷,是中藥人參的主要活性成分之一,具有多種藥理作用[11],常用于心臟相關(guān)疾病的治療中。此前曾有研究表明GS-Re能通過(guò)AMPK/TGF-β1/Smad2/3和FAK/PI3K p110a/Akt信號(hào)通路改善心肌梗死引起的心功能障礙及左心室重構(gòu)[12],也能通過(guò)抑制缺氧誘導(dǎo)因子1(hypoxia-inducing factor 1,HIF-1α)的泛素化避免心臟因缺氧/復(fù)氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)而導(dǎo)致的損傷[13]。Kim等[14]研究則表明GS-Re能夠通過(guò)抑制[Ca2+]i發(fā)揮抗缺血,保護(hù)心臟的作用。而GS-Re對(duì)左心室肥厚是否也有改善作用以及其對(duì)LVH的影響是否與TRPC介導(dǎo)的鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)仍需要探究。

1 材料與方法

1.1 主要藥品與試劑 人參皂苷Re(純度≥98%,南京澤朗生物科技有限公司);高效RIPA組織/細(xì)胞快速裂解液(R0010,北京索萊寶科技有限公司);BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(PC0020,北京索萊寶科技有限公司);改良Masson三色染色試劑盒(G1346,北京索萊寶科技有限公司);TRPC1抗體(A4016,Abclonal),TRPC3抗體(A7742,Abclonal),TRPC6抗體(18236-1-AP,Proteintech),CaN抗體(13422-1-AP,Proteintech),CaMKⅡδ抗體(20667-1-AP,Proteintech),GAPDH(10494-1-AP,Proteintech),Goat Anti-Rabbit IgG(SA00001-2,Proteintech)。

1.2 儀器 Kent Scientific CODA八通道無(wú)創(chuàng)血壓測(cè)量?jī)x(美國(guó)Kent公司);Vevo2100高分辨動(dòng)物超聲影像系統(tǒng)(加拿大VisualSonics公司);自動(dòng)染色機(jī)(LEICA AUTOSTAINER XL公司);Multiskan全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo公司);BX43正置顯微鏡(日本Olympus公司);Trans-Blot Turbo半干轉(zhuǎn)印槽(美國(guó)伯樂(lè)公司)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 收縮壓測(cè)量 測(cè)量前先預(yù)熱儀器,然后將大鼠放入固定盒中固定,將加壓圈套在鼠尾上,在避光、安靜的環(huán)境下測(cè)量,每周1次,周期為12周。

1.4.2 動(dòng)物超聲 使用2%戊巴比妥鈉麻醉,剔除大鼠前胸被毛,采用Vevo 2100高分辨動(dòng)物超聲影像系統(tǒng)檢測(cè)各組大鼠左心室結(jié)構(gòu)和功能相關(guān)參數(shù),包括校正左心室質(zhì)量(left ventricular mass corrected,LVMcor);舒張末期左心室前壁厚度(left ventricular anterior wall diastole,LVAWd);舒張末期左心室后壁厚度(left ventricular posterior wall diastole,LVPWd)。

1.4.3 心臟質(zhì)量指數(shù)和左心室肥厚指數(shù) 給藥12周后,稱量大鼠體重(body weight,BW),然后處死大鼠并迅速取出心臟,用預(yù)冷的PBS溶液清洗干凈,分離左心室,用濾紙吸干水分后,稱量心臟重量(heart weight,HW)、左心室重量(left ventricular weight,LVW),根據(jù)公式計(jì)算得出大鼠心臟質(zhì)量指數(shù)(heart mass index,HMI)和左室肥厚指數(shù)(left ventricular hypertrophy index,LVHI)。HMI=HW/BW,LVHI=LVW/BW。

1.4.4 組織染色 將各組大鼠左心室組織在10%甲醛中固定24 h后,脫水,將組織用石蠟包埋,制備組織切片。脫蠟后分別進(jìn)行蘇木素-伊紅(Hematoxylin-exsin,H&E)染色和Masson染色。然后在顯微鏡下觀察大鼠心肌橫切面、縱切面的組織形態(tài)及心肌組織間質(zhì)部位以及血管周圍膠原纖維的沉積情況,并用Image J軟件分析心肌細(xì)胞橫截面積和心肌膠原纖維沉積百分比。

1.4.5 Western blot 取左心室組織適量,加入適量裂解液(RIPA裂解液∶PMSF=100∶1),冰上研磨,超聲,確保充分裂解,在4 ℃,12 000 r/min離心10 min后取上清液,采用BCA法檢測(cè)蛋白濃度。用7.5%的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白,轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,用無(wú)蛋白快速封閉液室溫封閉20 min,然后在4 ℃孵育一抗過(guò)夜,包括TRPC1(1∶1 000)、TRPC3(1∶1 000)、TRPC6(1∶1 000)、CaN(1∶1 000)、CaMKⅡδ(1∶1 000)和GAPDH(1∶5 000)。TBST洗膜3次,并在室溫與稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔抗體(1∶10 000)孵育1 h,TBST洗膜3次,之后使用ECL超靈敏化學(xué)發(fā)光試劑盒顯色,最后用Image J軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 GS-Re對(duì)SHR收縮壓的影響 每周測(cè)量各組大鼠收縮壓,結(jié)果如圖1所示,與對(duì)照組相比,隨著周齡增加,26周齡模型組大鼠收縮壓逐漸升高,且顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。與模型組相比,給予GS-Re治療后,SHR收縮壓均有不同程度的下降,16周齡時(shí)各劑量組均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),其中以GS-Re 40組降壓作用最明顯,與卡托普利組降壓作用接近,二者無(wú)顯著性差異(P>0.05),但仍顯著高于26周齡對(duì)照組收縮壓(P<0.05)。上述結(jié)果表明GS-Re對(duì)SHR的收縮壓有一定的降壓作用。

條碼掃描儀：接收控制中心指令，同時(shí)掃描保護(hù)裝置機(jī)箱條碼并傳遞給控制中心。本系統(tǒng)采用左右兩個(gè)工裝臺(tái)進(jìn)行交替式測(cè)試，智能測(cè)試控制中心根據(jù)掃描儀的ID號(hào)進(jìn)行左右測(cè)試子系統(tǒng)的識(shí)別與控制。

*:與WKY 比較,P<0.05 ;#:與Model比較,P<0.05 ;n=8。圖1 GS-Re對(duì)SHR收縮壓的影響

2.2 GS-Re對(duì)SHR左心室結(jié)構(gòu)的影響 采用超聲心動(dòng)圖觀察各組大鼠左心室結(jié)構(gòu)。如圖2所示,與26周齡對(duì)照組相比,模型組LVMcor、LVAWd和LVPWd顯著增加(P<0.05)。26周齡時(shí),隨著給藥量的遞增,GS-Re 20組和GS-Re 40組能顯著降低SHR的LVMcor、LVAWd和LVPWd(P<0.05)。

A:超聲心動(dòng)圖代表圖;B:校正左心室質(zhì)量統(tǒng)計(jì)結(jié)果;C:舒張末期左心室前壁厚度統(tǒng)計(jì)結(jié)果;D: 舒張末期左心室后壁厚度統(tǒng)計(jì)結(jié)果;*:與WKY 比較,P<0.05; #:與Model 比較,P<0.05;n=6。圖2 GS-Re對(duì)SHR左心室結(jié)構(gòu)和功能的影響

上述結(jié)果表明GS-Re能夠有效改善SHR左心室結(jié)構(gòu)。

2.3 GS-Re對(duì)SHR心臟質(zhì)量指數(shù)和左心室肥厚指數(shù)的影響 高血壓引發(fā)的心肌肥厚首先表現(xiàn)為心臟總體重量的增加,主要受累部位為左心室,表現(xiàn)為左心室質(zhì)量增加,因此采用HMI和LVHI來(lái)評(píng)估肥厚的情況,結(jié)果如圖3所示,與26周齡對(duì)照組相比,模型組HMI和LVHI值均明顯增大(P<0.05)。給予GS-Re 12周后,與模型組比較,GS-Re 20組和GS-Re 40組HMI和LVHI顯著性減小(P<0.05)。該結(jié)果表明GS-Re能夠改善SHR的HMI和LVHI。

A:心臟質(zhì)量指數(shù);B:左心室肥厚指數(shù);*:與WKY 比較,P<0.05; #:與Model 比較,P<0.05;n=7。圖3 GS-Re對(duì)SHR左心室肥厚的影響

2.4 GS-Re對(duì)SHR心肌組織形態(tài)改變的影響

2.4.1 H&E染色 為了更進(jìn)一步觀察各組大鼠心肌組織形態(tài)的變化,運(yùn)用H&E染色觀察大鼠心肌細(xì)胞形態(tài)大小及心肌纖維排列情況。結(jié)果如圖4所示,顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn),26周齡時(shí)對(duì)照組大鼠心肌纖維排列整齊,心肌細(xì)胞形態(tài)大小正常,而模型組大鼠心肌纖維排列紊亂,心肌細(xì)胞束出現(xiàn)斷裂,心肌細(xì)胞橫截面積顯著增大(P<0.05)。GS-Re 20和GS-Re 40給藥后,較模型組心肌細(xì)胞橫截面積明顯縮小(P<0.05)。結(jié)果表明GS-Re能夠改善SHR的心肌組織形態(tài)。

A:WKY;B:Model;C:GS-Re 10;D:GS-Re 20;E:GS-Re 40;F:Captopril;G:心肌細(xì)胞橫截面積統(tǒng)計(jì)結(jié)果;標(biāo)尺=20 μm;*:與WKY比較, P<0.05; #:與Model比較, P<0.05;n=7。圖4 GS-Re對(duì)SHR左室心肌組織病理形態(tài)及心肌細(xì)胞大小的影響

2.4.2 Masson染色 LVH常伴隨著心肌纖維化,因此利用Masson染色觀察各組大鼠心肌組織膠原纖維沉積情況。結(jié)果如圖5,圖中藍(lán)色部分為膠原纖維,紅色部分為肌纖維。顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn),26周齡時(shí),對(duì)照組心肌組織血管和間質(zhì)部位膠原纖維較少,而模型組心肌組織中有大量的膠原纖維沉積(P<0.05)。膠原纖維的過(guò)度沉積會(huì)引起心肌組織僵硬,從而影響左心室的收縮舒張功能。不同劑量GS-Re給藥后,膠原纖維的沉積較模型組有不同程度的改善,其中GS-Re 20和GS-Re 40顯著減少SHR心肌組織中的膠原纖維沉積(P<0.05)。

A:WKY;B:Model;C:GS-Re 10;D:GS-Re 20;E:GS-Re 40;F:Captopril;G:心肌細(xì)胞橫截面積統(tǒng)計(jì)結(jié)果;標(biāo)尺=20 μm;*:與WKY比較, P<0.05; #:與Model比較,P<0.05;n=7。圖5 GS-Re對(duì)SHR左心室膠原沉積的影響

2.5 GS-Re對(duì)SHR左心室組織中TRPC蛋白表達(dá)的影響 26周齡時(shí),與對(duì)照組相比,模型組左心室組織中TRPC1、TRPC3、TRPC6蛋白表達(dá)均顯著上調(diào)(P<0.05)。GS-Re給藥后,上述蛋白表達(dá)較模型組均有不同程度的下調(diào),其中GS-Re 10組顯著下調(diào)了TRPC1(圖6A)和TRPC3(圖6B)蛋白表達(dá)(P<0.05),而GS-Re 20和GS-Re 40則顯著下調(diào)了TRPC1(圖6A)、TRPC3(圖6B)及TRPC6(圖6C)蛋白的表達(dá)(P<0.05)。

A:TRPC1蛋白表達(dá)量;B:TRPC3蛋白表達(dá)量;C:TRPC6蛋白表達(dá)量;*:與WKY比較,P<0.05;#:與Model比較,P<0.05 ;n=5。圖6 GS-Re對(duì)SHR左心室組織中TRPC蛋白表達(dá)的影響

2.6 GS-Re對(duì)SHR左心室組織中CaN和CaMKⅡδ蛋白表達(dá)的影響 26周齡時(shí),與對(duì)照組相比,模型組左心室組織中CaN和CaMKⅡδ蛋白表達(dá)均顯著上調(diào)(P<0.05)。GS-Re給藥后,上述蛋白表達(dá)較模型組均有不同程度的下調(diào),其中GS-Re 10組顯著下調(diào)了CaN(圖7A)蛋白表達(dá)(P<0.05),而GS-Re 20和GS-Re 40則顯著下調(diào)了CaN(圖7A)和CaMKⅡδ(圖7B)蛋白的表達(dá)(P<0.05)。

A:CaN蛋白表達(dá)量;B:CaMKⅡδ蛋白表達(dá)量;*:與 WKY比較,P<0.05;#:與Model 比較,P<0.05; n=5。圖7 GS-Re對(duì)SHR左心室組織中CaN和CaMKⅡδ蛋白表達(dá)的影響

3 討論

LVH是高血壓所致心臟疾病的主要表現(xiàn)之一,是一種心臟重塑的過(guò)程。這整個(gè)過(guò)程既有基因表達(dá)、蛋白質(zhì)合成、肌節(jié)改變、細(xì)胞代謝等多種細(xì)胞層面的變化,又有心肌形態(tài)發(fā)生變化,包括體積增大、組織間質(zhì)和血管周圍膠原纖維沉積等組織層面上的變化,LVH最終導(dǎo)致心臟收縮功能下降[15-16]。LVH是一個(gè)重要的心臟疾病預(yù)測(cè)因子,LVH的減輕與心臟疾病預(yù)后的改善顯著相關(guān)[17]。

為了確定GS-Re是否能夠改善LVH,本研究選擇SHR作為L(zhǎng)VH的模型,SHR因其病理生理改變接近人類原發(fā)性高血壓,已被廣泛用于心血管疾病的研究。SHR在7周齡左右時(shí)出現(xiàn)自發(fā)性高血壓,12～14周齡開(kāi)始逐步形成左心室肥厚[18]。

卡托普利屬于血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑類藥物,可有效降低血壓、改善LVH,因此本實(shí)驗(yàn)選擇卡托普利作為陽(yáng)性對(duì)照藥。

灌胃給予GS-Re 12周后,觀察到GS-Re能夠顯著降低SHR左心室質(zhì)量、舒張末期左心室前壁及后壁厚度,改善了SHR左心室的結(jié)構(gòu)。此外,給予GS-Re治療后,左心室心肌纖維排列整齊,心肌細(xì)胞橫截面積減小,血管周圍和組織間質(zhì)膠原纖維沉積減小,LVH得到了有效改善。故認(rèn)為GS-Re降低了SHR的收縮壓,有效減輕了左心室的后負(fù)荷,是其改善LVH的原因之一。最近Lee等[19]研究表明在患有高血壓和LVH的成人中,血壓的下降能夠有效改善病情并減輕心血管疾病事件的風(fēng)險(xiǎn)。我們先前的研究表明GS-Re能增加NO的產(chǎn)生并升高環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷(cGMP)水平[20],有利于血管舒張,此結(jié)果類似Yutaka等人的研究[21]也表明GS-Re能夠促進(jìn)NO的釋放,從而促進(jìn)血管舒張,這可能是GS-Re的降壓作用的一種機(jī)制。此外還有研究表明TRPC3的過(guò)表達(dá)可能通過(guò)調(diào)節(jié)線粒體功能從而調(diào)節(jié)高血壓患者的血管張力和血壓[22],考慮到本研究表明GS-Re下調(diào)了SHR左心室TRPC3蛋白的表達(dá)量,因此我們推測(cè)GS-Re可能也下調(diào)了血管中TRPC3的表達(dá),從而發(fā)揮下調(diào)收縮壓的作用,但需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

細(xì)胞內(nèi)Ca2+依賴性信號(hào)通路的改變是LVH的分子標(biāo)志之一。TRPC是一種陽(yáng)離子通道,能允許鈣離子的通過(guò)。大量研究表明TRPC參與心肌肥厚的發(fā)生發(fā)展,如Wu等[23]較為全面的研究了TRPC3/C4/C6在心肌肥厚中的作用,發(fā)現(xiàn)其機(jī)制是通過(guò)調(diào)控[Ca2+]i及CaN/NFAT信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。Camacho等[10]研究也表明TRPC1/C4的敲除可預(yù)防病理性肥厚的發(fā)展。此外抑制TRPC1[24]能夠減輕佛波酯(phorbol 12-myristate 13-acetate,PMA)誘導(dǎo)的H9人類胚胎干細(xì)胞衍生心肌細(xì)胞的肥大;抑制TRPC3[25]也被證明可減輕高鹽誘導(dǎo)的小鼠心肌肥厚,這些結(jié)果說(shuō)明TRPC在調(diào)控心肌肥厚中發(fā)揮著重要作用。CaN和CaMKⅡ被認(rèn)為是細(xì)胞內(nèi)2種主要的鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)關(guān)鍵分子[5],也是TRPC的重要下游蛋白[7-8]。CaN是一種鈣依賴的蛋白磷酸酶,能夠促進(jìn)細(xì)胞質(zhì)中的p-NFAT去磷酸化進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi),在核內(nèi)激活多種肥厚相關(guān)基因,引發(fā)LVH[26-27]。而CaMKⅡδ是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,其能將HDAC磷酸化后從核轉(zhuǎn)位至胞質(zhì),解除對(duì)心肌肥厚相關(guān)基因的抑制而導(dǎo)致LVH[5]。此前曾有研究表明GS-Re能夠降低[Ca2+]i從而發(fā)揮保護(hù)心臟的作用[14],但研究并未繼續(xù)深入。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明GS-Re降低了SHR左心室組織中TRPC1/C3/C6及其下游的CaN和CaMKⅡδ蛋白的表達(dá),這表明GS-Re降低[Ca2+]i可能是通過(guò)抑制TRPC實(shí)現(xiàn)的,并且進(jìn)一步下調(diào)了TRPC下游的鈣信號(hào)通路相關(guān)蛋白。下調(diào)左心室組織中TRPC及其下游的鈣信號(hào)通路可能是GS-Re改善LVH的另一種原因。

本實(shí)驗(yàn)的局限在于,沒(méi)有使用特異性TRPC抑制劑或通過(guò)沉默/敲除TRPC基因更深入的探討GS-Re對(duì)TRPC的調(diào)節(jié)機(jī)制,之后需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

本研究結(jié)果表明GS-Re降低了SHR收縮壓,改善了其左心室的結(jié)構(gòu),降低了左心室心肌細(xì)胞的橫截面積和膠原纖維沉積,并下調(diào)了TRPC1/C3/C6及其下游的CaN和CaMKⅡδ蛋白表達(dá),提示GS-Re改善SHR左心室肥厚的作用與其抑制TRPC介導(dǎo)的鈣信號(hào)通路有關(guān)。