蛋糕中合成色素的高效液相色譜檢測研究

許樺 鄧金鳳

目前，合成色素已廣泛應用于食品生產加工中，在蛋糕生產中也多有應用。合成色素即人工合成的色素，具有色澤鮮艷、著色力強、色調多樣等優(yōu)點，但也有一個大缺點，即具毒性（包括毒性、致瀉性和致癌性），因而會對人體造成不同程度的危害。基于此，本研究以蛋糕為研究對象，采用高效液相色譜法（HPLC）對蛋糕中的合成色素進行了檢測。

一、材料與設備

1.材料與試劑。甲醇（預層析純化、過濾脫氣），瑞典Upson Chemical Co.，Ltd.；醋酸銨（超純，0.02mol/L溶液配制，脫氣過濾器），百威化學有限公司；醋酸鋅（可用21.9%水溶液）、鐵氰化鉀（可用10.6%水溶液）、無水乙醇、氨水、檸檬酸（可用20.0%水溶液），均為分析純；聚酰胺粉末（100-200目），中國醫(yī)藥集團實業(yè)有限公司；檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅、日落黃、誘惑紅、亮藍、赤蘚紅、新紅，國家研究中心參考資料；Low Performance Polyamide （2g，12mL），Angelen Technology Ltd.；測試水-超純水（電阻率18.3mq/m2）；市售蛋糕。

2.試驗設備。主要儀器包括紫外檢測器、高速離心機、渦流發(fā)生器、低溫制冷機和24位標準固相萃取儀。

二、試驗與方法

1.試驗溶液制備。合成色素分析中的溶液主要有檸檬酸溶液、檸檬酸鈉溶液、醋酸銨溶液、無水乙醇、檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液、標準儲備液和混合標準溶液。先將檸檬酸溶液與21.01g檸檬酸和1L水混合，充分攪拌；再取29.41g檸檬酸鈉溶液與1L水混合均勻；配置無水乙醇溶液時，將70mL無水乙醇、20mL氨水和10mL水充分混勻；從標準儲備液中取上述色素0.1g，放入容量為100mL的瓶裝水中，至多100mL；配制混合標準溶液時，取上述溶液2mL，加水100mL配成染料。

2.高效液相色譜條件。色譜柱：C18柱，5hm，4.6mm*250mm；流速：1.0mL/min；柱溫：30℃；注射次數(shù)：10次；檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅、日落黃、誘惑紅和赤蘚紅的檢測波長為254nm，亮藍色的檢測波長為595nm；0.02mol/L醋酸銨和甲醇為流動相，洗脫梯度如表1所示。

3.曲線標準。取1mg/mL的檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅、日落黃、誘惑紅、亮藍、苔蘚紅、新紅標準品，精密吸取0.1mg/mL的混合標準液0.10mL、0.25mL、0.50mL、0.75mL、1.0mL，分別置于5個10mL容量瓶中，用現(xiàn)制的一級水定容至刻度搖勻，制劑新紅的濃度分別為1.0μg/mL、2.5μg/mL、5.0μg/mL、7.5μg/mL、10.0μg/mL。另精密吸取0.1mg/mL的混合標準液1.0mL、2.5mL、5.0mL、7.5mL、10.0mL，分別置于5個10mL容量瓶中，用超純水定容后搖勻，制得標準濃度分別為10μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、75μg/mL、100μg/mL的混合標準溶液。根據(jù)色譜條件進行高效液相色譜分析，根據(jù)峰面積和對應濃度生成標準曲線。

4.試驗方法。（1）選擇一部分蛋糕進行均質化。（2）將5g蛋糕樣品放入30mL離心管中，再放入10mL無水乙醇、氨水和水的混合液中，超聲處理10min，離心10min，選擇澄清的沉淀液，然后繼續(xù)加入無水乙醇混合溶液，提取兩次。（3）選擇提取的清洗液，在-42℃條件下冷凍0.5h、1h、3h、5h、12h。冷凍后，將離心機放入冷凍離心機中離心5min，然后取出清洗液。（4）除去透明溶液并在高溫下濃縮，調節(jié)pH值至6-7以獲得濃縮溶液。（5）將濃縮液用固相聚酰胺萃取塔過濾，用檸檬酸鈉溶液精制，再用無水乙醇和氨水混合液精制，將初期流出液清除后，保存剩余流出液，在50℃條件下將氮氣增濃至0.8mL，再加入0.2mL醋酸銨溶液殘渣，配制液用水微孔濾器過濾，濾液用液相色譜法測定。（6）優(yōu)化層析條件。色譜柱的溫度保持在30℃，流動相A為0.02mol/L醋酸銨溶液、0.02mol/L醋酸鈉氨溶液，流動相B為甲醇。（7）制作基質匹配標準曲線，取5g空樣置于30mL離心管中，分別加入不同量的合成染料，直至完全均勻冷卻，重復提取操作。

三、研究與分析

1.優(yōu)化處理樣品。（1）樣品的預處理。蛋糕基質含有大量的脂肪和蛋白質，會阻礙后續(xù)實驗，必須提前去除。8種色素易溶于水，不溶于油，故本試驗采用油醚萃取脫脂，效果較好，色素回收率也未受到嚴重影響。由于蛋白質會吸附色素，本實驗使用21.9%的醋酸鋅和10.6%的鐵氰化鉀溶液進行蛋白質沉積，同時加入軟膏以提取色素。在強烈的超聲波振動下，包裹在蛋白質中的色素被釋放到樣品提取物中。

（2）優(yōu)化清洗條件。提取物通過持久性聚酰胺提取進行精制，并與聚酰胺粉末的吸附性進行比較。聚酰胺粉末吸附法需要較高的運行溫度，色素回收率非常低，而聚酰胺柱固相萃取工藝簡單，溶劑含量低，8種色素的回收率均得到顯著提高。

（3）優(yōu)化色譜條件。本試驗測試了8種合成色素的分離，流速分別為0.3mL/min、0.5mL/min和1.0mL/min。當流速為0.5mL/min時，8種色素分離良好，峰值尖銳，分析效果好，分析時間中等。結合達到峰值時間、色素分離效果、儀器柱壓力等因素，最終確定0.5mL/min為最佳流速。8種色素基本上可以在四個溫度下分離，但由于測量溫度高于室溫，環(huán)境對測量溫度影響不大，溫度波動小，因此選擇30℃作為測量溫度。

2.選擇固相萃取柱。固體萃取塔由固體吸附劑組成，將吸附試樣中的目標化合物與主要干擾物質分離，然后用去污劑清洗，達到分離和濃縮的目的。市場上大多數(shù)的固相吸附劑很相似，通常導致回收率低，純度不完整，分析材料重復性差。將市場上銷售的多個固相萃取塔進行比較，發(fā)現(xiàn)Strata X-AW固相萃取塔可以有效滿足實驗要求。Strata X吸附劑采用創(chuàng)新的聚合物技術，其中二胺基是帶電酸性化合物，能夠100%洗滌，切實提高檢測方法的靈敏度和可重復性。

3.曲線檢出限。曲線檢出限的測試結果如表2所示。從表2可知，采用該測試方法對8種線性范圍寬、線性好、檢出限低的合成色素進行分離分析，可以滿足裝飾蛋糕中合成色素的檢測要求。

為檢測樣品中8種合成色素的回收率和精密度，選取空白蛋糕加入8種不同牌號的合成色素，按試驗方法配制樣品溶液，測定6次的回收率和相對標準偏差。取出后，將精制后的溶液放入冰箱-4℃降溫，每隔1h、4h、8h、12h、24h、48h、168h取樣，室溫保存，待測。機器比較儲存時間與樣品溶液對目標物質的影響結果表明，樣品溶液在-4℃下冷卻一周，各色素的出峰時間無明顯變化，色譜峰重現(xiàn)良好，說明樣品溶液在-4℃下冷卻一周并不影響檢測結果，適用于批量樣品處理檢測。

4.樣品提取優(yōu)化。在蛋糕中加入少量色素，可以使蛋糕更加美觀。本實驗以5g陰性樣品中6種色素含量為4mg/kg作為研究對象，對環(huán)境條件的優(yōu)化進行研究，包括提取溶劑的選擇、提取時間、提取溫度的確定。由于色素易溶于水和微量液體，故選用水、0.4%氫氧化鈉水溶液和0.4%氫氧化鈉乙醇水溶液作為提取溶劑進行比較，其他操作與色譜研究完全相同，只是將樣品加入標準樣品中，提取時間為1次。實驗發(fā)現(xiàn)，樣品中的色素能被水溶解，提取物的顏色很淺，色素明顯牢固地吸附在固體上。結果表明，0.4%的氫氧化鈉水溶液可以提取部分色素，但對淺色素的提取十分不利。

5.聚酰胺粉用量。實驗研究了兩種聚酰胺粉末和不同用量對8種色素吸附和解吸的影響。使用市場上常用的兩種粉末，實驗中檢測到的聚酰胺粉體和色素的種類與數(shù)量在萃取液酸化后吸附良好，但30-100目聚酰胺粉體解吸不完全，有部分殘留色素。聚酰胺粉末的用量對分析結果影響很大，100-200目聚酰胺粉的回收率遠高于30-100目，使用0.5g聚酰胺粉末時回收量超過1.0g，回收率為90%-97%?？梢钥闯觯勰┖康?，顆粒大，顆粒中吸附的色素不能被解吸液完全分解吸收，導致還原率低；粉末含量高，細粉，解吸完全。因此，選擇0.5g的100-200目聚酰胺粉末作為試驗條件。

6.油脂去除分析。蛋糕制品含有大量脂肪，如果脂肪沒有完全去除，會影響和干擾實驗。實驗中，在陰性樣品中加入標準溶液（4mg/kg）作為實驗樣品進行實驗對比。在第一組實驗中，提取物中含有大量的油，酸化后變得渾濁，聚酰胺粉末沒有完全吸收色素，一些色素留在溶液中。同時，包封在油中的色素無法通過過濾釋放出來。雖然g2玻璃砂礫漏斗和70%乙醇水溶液在后續(xù)抽濾中可以去除部分油脂，但最終溶液中仍有雜質存在；基本漂移和劇烈波動會嚴重影響8種色素的結果分析和檢測靈敏度；回收率很低，結果僅為55%-65%。在第二組中，脫脂后的樣品根據(jù)上述實驗操作進行處理，結果顯著優(yōu)于非脫脂組。

在選擇萃取溶劑時，本實驗比較了混合溶劑乙醚和石油醚的分析效果。采用乙醚萃取時，誘惑紅的萃取率很低，只有50%，而其余五種色素的萃取率為80%-83%。采用石油醚（1+1）混合液萃取，可以顯著提高誘惑紅的回收率，效果達到90%以上，剩下的7個結果也很不錯。因此，選擇石油醚（1+1）混合溶液作為萃取溶劑。

作者簡介：許樺（1993-），男，漢族，廣西貴港人，助理工程師，大學本科，研究方向為食品檢測。

鄧金鳳（1993-），女，漢族，廣西貴港人，助理工程師，大學本科，研究方向為食品檢測。