電化學(xué)生物傳感器在病毒性傳染病檢測中的應(yīng)用

彭雪，金政，林玉紅，周瑤，趙凱

（1.齊齊哈爾大學(xué)生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院，齊齊哈爾 161000；2.臺州學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院）

病毒是具有傳染性的專性細(xì)胞內(nèi)寄生，只能通過電子顯微鏡觀察到的小型微生物（直徑20～400 nm），其基因組由DNA 或RNA 組成[1-2]。在進(jìn)化過程中，病毒發(fā)展出多種機(jī)制[3]，所有的細(xì)胞生命都可能被病毒感染，病毒可引發(fā)人類和動物多種疾病，如普通感冒（Common cold）、唇皰疹（Herpes labialis）[4]、麻疹（Measles）[5]、肝炎（Hepatitis）[6]等。也有一些更有害甚至危及生命的病毒包括口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus，F(xiàn)MV）[7]、禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）[8]、豬瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）[9]、新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）[10]、冠狀病毒（Coronavirus）[11]、狂犬病毒（Rabies virus，RV）[12]、人體免疫缺陷病毒（HIV）[13]、埃博拉病毒[14]（Ebola virus，EV），以及新型冠狀病毒（Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2，SARS-CoV-2）[15]等，對全球人類和動物安全構(gòu)成了巨大威脅，同時(shí)也造成了不可估量的經(jīng)濟(jì)損失。早期診斷是預(yù)防疫病和有效控制疫病傳播的關(guān)鍵。因此，迫切需要快速、準(zhǔn)確、高靈敏且便捷的檢測技術(shù)來診斷引起疫病的病毒。

生物傳感器是一種分析裝置，由生物受體、傳感器和信號處理器組成，用于檢測、傳輸和記錄分析物的生理或生化變化，是解決臨床診斷中的靈敏度低、成本高等問題最具潛力的方法之一[16-17]。根據(jù)生物傳感器分類方式的不同，可將其分成很多類型（見表1）。其中，電化學(xué)生物傳感器由于其選擇性高、靈敏度好、低成本等特點(diǎn)，引起了研究者們的廣泛關(guān)注，是目前研究和應(yīng)用最廣泛的生物傳感器之一[18-19]。因此，綜述電化學(xué)生物傳感器檢測病毒技術(shù)的發(fā)展，對促進(jìn)電化學(xué)生物傳感器在病毒等病原微生物檢測領(lǐng)域中的推廣應(yīng)用具有重要的借鑒意義。

表1 生物傳感器分類Table 1 Classification of biosensors

1 電化學(xué)生物傳感器檢測原理及分類

電化學(xué)生物傳感器是一種通過將生化反應(yīng)轉(zhuǎn)化為定量電信號來檢測被分析物的分析裝置。它將生物識別分子（如抗體）的特異性與電化學(xué)檢測技術(shù)的優(yōu)勢相結(jié)合[32]。電化學(xué)生物傳感器由生物識別元件、物理化學(xué)信號轉(zhuǎn)換器和數(shù)據(jù)分析儀三部分組成（圖1）。電極是轉(zhuǎn)換元件和固定載體，抗體、酶、細(xì)胞等生物識別元件通過化學(xué)或物理方法固定在電極表面。

圖1 電化學(xué)傳感器組成簡圖Fig.1 Composition diagram of electrochemical sensor

電化學(xué)生物傳感器的檢測原理則是將生物活性物質(zhì)作為分子識別物固定在電極表面，由于識別元件與待測分子的特異性識別，信號轉(zhuǎn)換器將目標(biāo)分子及其響應(yīng)信號轉(zhuǎn)換為電流、電位等電信號，從而實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)待檢物的定性或定量檢測。以電化學(xué)生物傳感器檢測抗原為例，檢測過程示意圖如圖2 所示。

圖2 電化學(xué)生物傳感器檢測過程示意圖Fig.2 Schematic diagram of electrochemical biosensor detection process

迄今為止，電化學(xué)檢測技術(shù)包括差分脈沖伏安法（Differential pulse voltammetry，DPV）、循環(huán)伏安法（Cyclic voltammetry，CV）、線性掃描伏安法（Linear sweep voltammetry，LSV）、電化學(xué)阻抗譜（Electrochemical Impedance Spectroscopy，EIS）和方波伏安法（Square Wave Voltammetry，SWV）等[33]。同時(shí)根據(jù)不同的分類方式電化學(xué)生物傳感器也衍生出很多種類（表2）。電化學(xué)生物傳感器由于具有高度靈敏、信號生成和讀出速度快、所需樣品少、病毒檢測成本低廉，以及需要相對簡單的操作儀器等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于高發(fā)且傳染性強(qiáng)的病毒檢測中。

表2 電化學(xué)生物傳感器分類Table 2 Classification of electrochemical biosensors

2 電化學(xué)生物傳感器在高發(fā)性病毒檢測中的應(yīng)用

在過去的20 年中，隨著人類和家畜種群密度的增加，局部流行病和全球流行病的威脅也在增加，傳染性極強(qiáng)的流行性疾病頻發(fā)，如CSFV、FMV、AIV、Coronavirus 等高發(fā)傳染性病毒，造成人類與家畜生命、健康和經(jīng)濟(jì)的巨大損失。盡管已經(jīng)為一些有威脅的病原體開發(fā)出了有效的疫苗，但面對迅速蔓延的流行病，早期診斷對于預(yù)防和控制其源頭是有效控制疾病傳播的關(guān)鍵[42]。在過去的25 年里，電化學(xué)生物傳感器已被廣泛應(yīng)用，為PCR 和ELISA 的病原鑒定和定量檢測提供了補(bǔ)充平臺[43]。

2.1 流感病毒（Influenza virus，IFV）

IFV 是一種急性呼吸道病毒，屬于正粘病毒科[44]。根據(jù)核蛋白和基質(zhì)蛋白的內(nèi)部蛋白質(zhì)，IFV 分為A（甲）、B（乙）和C（丙）三種類型[45-46]。甲型和乙型流感病毒的表面糖蛋白，包括HA 和NA 蛋白，是IFV 暴露最多的蛋白[46]。其中，甲型流感病毒是人類和動物最常見的病原體，可引起季節(jié)性流感。甲型流感病毒經(jīng)常發(fā)生抗原變異，可以進(jìn)一步分為H1N1、H3N2、H5N1、H7N9 等亞型（其中的H 和N 分別代表流感病毒的兩種表面糖蛋白）[16]。IFV 的爆發(fā)有咳嗽、發(fā)燒和喉嚨痛等癥狀，由于其高傳染性，不僅在動物之間進(jìn)行傳播，同時(shí)在人群中也是常見的病原體與傳染源。所以開發(fā)快速、高效的檢測方法十分有必要。

S.Devarakonda 等[47]提出了一種高性價(jià)比的手工紙基電化學(xué)生物傳感器，用于IFV H1N1 的無標(biāo)記電化學(xué)檢測，電化學(xué)生物傳感器表現(xiàn)出良好的線性行為，檢測限低至1.13×105pfu·L-1。Park 等[48]報(bào)道了一種由多功能DNA 四通接頭（4WJ）和羧基二硫化鉬（羧基-MoS2）雜化材料組成的電化學(xué)生物傳感器，羧基-MoS2 提高了這種生物傳感器的靈敏度，該電化學(xué)生物傳感器對H1N1 顯示出良好的線性響應(yīng)，線性范圍在100 nmol·L-1到10 pmol·L-1之間。J.Huang 等[49]設(shè)計(jì)了一種新型的由金納米顆粒-石墨烯納米復(fù)合材料（AuNPs-G）包裹的金電極組成的夾心式電化學(xué)生物傳感器，采用納米銀-石墨烯（AgNPs-G）作為微量標(biāo)記用于臨床定量檢測AIV H7。傳感器的檢測線性范圍在1.6～1.6×104 ng·L-1，檢測限低至1.6×103pg·L-1。

2.2 冠狀病毒

冠狀病毒的結(jié)構(gòu)大致呈球形，突出部分呈冠狀，直徑約為125 nm，包膜直徑為85 nm，冠狀突長20 nm。冠狀病毒是單鏈RNA 病毒，是已知RNA 病毒中基因組最大的病毒[50]。冠狀病毒分布廣泛，可感染脊椎動物（包括蝙蝠、貓、駱駝、豬等）和人類的呼吸、腸道、中樞神經(jīng)系統(tǒng)等多個(gè)生物系統(tǒng)[51]。冠狀病毒可以被細(xì)分為ɑ-冠狀病毒、β-冠狀病毒、γ-冠狀病毒和δ-冠狀病毒4 個(gè)屬[52]，具體分類見表3。

表3 冠狀病毒的分類Table 3 Classification of coronavirus

由SARS-CoV-2 引起的COVID-19 是自2019年12 月以來世界面臨的一個(gè)嚴(yán)重的全球衛(wèi)生威脅，COVID-19 已在幾個(gè)月內(nèi)將這一相對未被充分研究的病毒組轉(zhuǎn)變?yōu)槿蚬残l(wèi)生事項(xiàng)[53-54]。由于抗病毒治療仍處于早期階段，因此SARS-CoV-2 的實(shí)驗(yàn)室診斷是及時(shí)管理和隔離確診病例以防止進(jìn)一步傳播的關(guān)鍵[55]。

Büyüksünet?i Y T 等[56]建立了一種COVID-19 的電化學(xué)檢測方法，傳感器將血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2（ACE2）和CD147（結(jié)合S 蛋白的宿主特異性受體）固定在不同的金絲網(wǎng)印刷電極（AuSPE）上，用EDC/NHS 混合物進(jìn)行修飾，在修飾的工作電極區(qū)加入SARS-CoV-2 S 蛋白，檢查S 蛋白與ACE2 或CD147受體的結(jié)合。結(jié)果表明，ACE2 受體線性范圍為7×105～1.5×106ng·L-1，檢測限（LOD）為2.99×105ng·L-1；CD147 受體的線性范圍為5×105～5×106ng·L-1，LOD值為3.9×104ng·L-1。B.Mojsoska 等[57]開發(fā)一種快速檢測SARS-CoV-2 的無標(biāo)簽電化學(xué)生物傳感器測定法。隨著電化學(xué)生物傳感器表面抗原濃度的增加，[Fe（CN）6]3-/4-電流的絕對變化被用來確定刺突蛋白的檢測范圍。該傳感器能夠檢測到2×104μg·L-1以上的重組刺突蛋白亞基1 的特異性信號，而且能夠檢測到濃度為5.5×108pfu·L-1的SARS-CoV-2。這種新型電化學(xué)生物傳感器的分析時(shí)間比RT-PCR 快得多，并且便于攜帶、操作簡單，可實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場診斷。

豬流行性腹瀉病毒（Porcine Epidemic Diarrhea Virus，PEDV）引起的一種豬接觸性腸道傳染病，其特征為嘔吐、腹瀉、脫水，該病毒的傳播給人類造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，及時(shí)檢測顯得尤為重要[58]。Ma J等[59]構(gòu)建了一種用于檢測PEDV 抗體的靈敏電化學(xué)發(fā)光（ECL）平臺，該平臺以AuNPs 修飾的石墨烯納米片（Au-GN）為底物，以抗體-抗原反應(yīng)為識別單元，并組裝了級聯(lián)Ru-DNA 納米標(biāo)簽作為信號標(biāo)記，生物傳感器對PEDV 抗體表現(xiàn)出良好的分析性能，線性范圍在100～5×106pg·L-1之間，檢測限為50 pg·L-1（S/N=3）。

2.3 寨卡病毒（Zika virus，ZIKV）

ZIKV 是黃病毒科病毒家族的一員，于1947 年首次在猴子身上發(fā)現(xiàn)，隨后于1952 年在人類身上發(fā)現(xiàn)[60]。ZIKV 是一種約11 kb 且有包膜的二十面體正義單鏈RNA 病毒[61]，其是一種人畜共患病的節(jié)肢動物傳播病毒（蟲媒病毒）[62]，引起的臨床癥狀與登革熱和基孔肯雅病毒感染相似[63]。大量證據(jù)表明，ZIKV 與人類神經(jīng)系統(tǒng)嚴(yán)重病變的病因有關(guān)，如新生兒小頭畸形和成人格林-巴利綜合征的發(fā)生。對于ZIKV，既無有效的治療方法，也無有效的疫苗。因此，公共衛(wèi)生應(yīng)對措施主要側(cè)重于預(yù)防感染，特別是孕婦感染，開發(fā)靈敏、快速的檢測方法來識別ZIKV 相關(guān)的傳染病十分有必要[64]。

Moco A C R 等[65]研發(fā)一種用電化學(xué)還原的氧化石墨烯和聚酪胺導(dǎo)電聚合物進(jìn)行修飾的電化學(xué)基因傳感器用于檢測感染患者樣本中ZIKV 的基因組RNA，檢測限達(dá)100 fg·L-1，且具有良好的穩(wěn)定性（60 d內(nèi)）和快速分析（約20 min），填補(bǔ)了ZIKV 診斷方法的不足。Chompoonuch T 等[60]用表面印跡聚合物（SIP）和氧化石墨烯復(fù)合材料，研發(fā)出新型ZIKV 電化學(xué)生物傳感器，檢測限可達(dá)到RT-qPCR 檢測水平。電化學(xué)生物傳感器通過使用標(biāo)準(zhǔn)電化學(xué)技術(shù)測量電信號隨緩沖液和血清中病毒濃度的變化來檢測ZIKV，在PBS 中可檢測濃度低至0.2 pfu·L-1，而在存在登革熱病毒和培養(yǎng)基的情況下LOD 為20 pfu·L-1，實(shí)際樣品中的最低檢測限應(yīng)為1 pfu·L-1，此LOD 值足以在實(shí)際應(yīng)用中檢測ZIKV。

2.4 豬瘟病毒（Swine fever virus）

非洲豬瘟病毒（ASFV）是非洲豬瘟（ASF）的病原體，是家豬和野豬的一種高死亡率致命疾病，自2018年在中國引入并迅速傳播以來，幾乎所有受ASFV 感染的豬死亡率接近100%。ASF 是由一種大型雙鏈DNA 病毒ASFV 引起的，該病毒主要在巨噬細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中復(fù)制，自然宿主包括野生豬和鳥獸屬節(jié)肢動物媒介[66-68]。ASFV 可通過口鼻或皮膚擦傷直接接觸在受感染的豬之間傳播。極高的病毒傳播水平，特別是在血液中，為動物的直接或間接感染提供了大量病毒來源，病毒也存在于其他排泄物和分泌物中，包括尿液和唾液[68]?？刂艫SF 疫情的措施主要是及時(shí)發(fā)現(xiàn)和診斷。因此及早發(fā)現(xiàn)并控制ASF 疫情，建立靈敏、準(zhǔn)確、快速的ASFV 早期檢測方法是十分必要的。

Biagetti M 等[69]提出了一種基于DNA/LNA 探針與VP72 靶基因保守區(qū)互補(bǔ)配對的原則，建立了ASFV 電化學(xué)傳感器檢測方法，傳感器利用帶有鎖核酸（LNA）代替的單鏈DNA 探針作為ASFV VP72 基因保守區(qū)的互補(bǔ)識別元件，可測出最低檢出限為1.78×108copies·L-1基因組DNA，LOD 為2.45×108copies·L-1，單次測試時(shí)間僅需要5 min。該方法是一種很有前景的ASF 初步診斷篩查方法，具有相對快速、易于使用、成本低等主要優(yōu)點(diǎn)。樂莉等[70]用量子點(diǎn)（QDs）和納米金（AuNPs）構(gòu)建了一種基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移的DNA 傳感器，基于DNA 互補(bǔ)配對原則用于ASFV 特異性基因檢測。傳感器可在1.25 h 內(nèi)快速檢測ASFV 靶DNA，檢測限為0.72 μmol·L-1，在豬肉、火腿腸和豬肉餃子等食品中的回收率為82.0%～108.0%，變異系數(shù)為0.02%～0.15%。

2.5 麻疹病毒（Measles virus，MeV）

麻疹，也稱為紅疹或莫比爾，是由MeV 引起的一種傳染性疾病。MeV 是副粘病毒科的一種包膜病毒，是一種高度傳染性負(fù)鏈RNA 病毒，直徑為120～1 000 nm，人類是MeV 的自然宿主，主要通過呼吸道傳播。麻疹以發(fā)熱和皮疹為特征，通常伴有咳嗽、鼻炎和結(jié)膜炎，該病引起的癥狀看似無害，但麻疹的免疫抑制導(dǎo)致機(jī)會性感染的易感性增加，而機(jī)會性傳染是每年10 萬多人死亡的主要原因[71-74]。雖然PCR 技術(shù)是世界衛(wèi)生組織推薦的方法，但一些實(shí)驗(yàn)室，特別是發(fā)展中國家的實(shí)驗(yàn)室，依賴于更簡單的免疫學(xué)方法，需要數(shù)小時(shí)到數(shù)天的檢測時(shí)間。因此，迫切需要一種快速、靈敏的方法來檢測MeV，以防止疾病的迅速傳播。

Mayall R M 等[75]研發(fā)一種電化學(xué)生物傳感器快速檢測MeV 的超靈敏方法，該傳感器將對MeV 跨膜H 蛋白具有特異性的抗體通過N-雜環(huán)卡賓（NHC）的自組裝連接到Au 電極，所得電化學(xué)生物傳感器對104～105μg·L-1麻疹病毒具有線性響應(yīng)，檢測限為6×103μg·L-1，檢測時(shí)間需要大約15 min，每次測試成本僅為3.72 美元，這種方法預(yù)計(jì)將對麻疹監(jiān)測產(chǎn)生重大影響，并可推廣到其他病毒，包括SARS-CoV-2。Philani M 等[76]構(gòu)建了電化學(xué)阻抗免疫傳感器，使用麻疹抗原修飾的金電極表面作為傳感界面來檢測麻疹特異性抗體。結(jié)果表明：當(dāng)抗體濃度為1 000 μg·L-1時(shí)，40 min 后電極達(dá)到最佳條件，也證實(shí)了基于阻抗的無標(biāo)記免疫傳感器在麻疹檢測中顯示出良好的應(yīng)用前景。

3 總結(jié)

病毒感染是導(dǎo)致人類與動物患病的主要原因之一，嚴(yán)重威脅著人類與動物的健康和安全，同時(shí)也造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。為了保證人類的生命安全和財(cái)產(chǎn)安全，及時(shí)發(fā)現(xiàn)與診斷病毒十分重要。電化學(xué)生物傳感器是用生物活性材料（酶、蛋白質(zhì)、DNA、抗體、抗原等）與化學(xué)換能器有機(jī)結(jié)合的一門新興交叉學(xué)科，是生物技術(shù)發(fā)展過程中必不可少的一種檢測與監(jiān)控方法，同時(shí)也是一種快速、微量分析方法，未來勢必會成為一種發(fā)展趨勢。傳統(tǒng)的檢測方法雖然應(yīng)用廣泛且特異性強(qiáng)，但存在需要專業(yè)技術(shù)人員和費(fèi)用較高等缺陷。電化學(xué)生物傳感器具有構(gòu)造簡單方便、用時(shí)較短、檢測結(jié)果靈敏、不需要專業(yè)技術(shù)人員等多重特點(diǎn)，是理想的病毒檢測平臺，在動物和人類健康監(jiān)測方面具有廣闊的應(yīng)用前景。目前，電化學(xué)生物傳感器在高傳染性病毒檢測應(yīng)用中引起了廣泛關(guān)注。盡管電化學(xué)生物傳感器在病毒檢測中顯示出特有的優(yōu)勢，但是微型化和可移動化檢測技術(shù)仍然備受關(guān)注，未來將移動智能手機(jī)與電化學(xué)生物傳感器相結(jié)合勢必是種發(fā)展趨勢，該技術(shù)必將在高傳染性病毒檢測方面得到更廣泛的應(yīng)用，尤其適用于許多貧困地區(qū)的健康監(jiān)測。