幾種板栗品種對(duì)鏈格孢菌的室內(nèi)抗性比較及防治藥劑篩選

栗佳寧， 李愛霞， 霍佳歡， 馮麗娜 郭思柔， 王建華，溫曉蕾， 孫偉明， 齊慧霞*

（1. 板栗產(chǎn)業(yè)技術(shù)教育部工程研究中心，河北 秦皇島 066004；2. 河北科技師范學(xué)院農(nóng)學(xué)與生物科技學(xué)院，河北省作物逆境生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（籌），河北 昌黎 066600；3. 河北省邢臺(tái)市林業(yè)和草原有害生物防治檢疫站河北 邢臺(tái) 05400）

板栗（Castanea mollissimaBlume）為殼斗科栗屬植物，是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)林樹種之一，也是我國(guó)食用最早的著名堅(jiān)果之一，富含蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂肪、鈣、磷、鐵、鋅、多種維生素等營(yíng)養(yǎng)成分，具有延年益壽、健脾養(yǎng)胃、止血消腫等功效[1-2]。近年來(lái)，板栗種植產(chǎn)業(yè)高速發(fā)展，但板栗病害愈發(fā)嚴(yán)重，嚴(yán)重影響其產(chǎn)量及品質(zhì)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，每年因果仁腐爛造成的經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)50%[3]。同時(shí)，由于氣候環(huán)境的變化，原先較弱的病原菌逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)閺?qiáng)優(yōu)勢(shì)致病菌，從而引發(fā)板栗新病害的發(fā)生和流行。2007年，北京林業(yè)大學(xué)在北京懷柔首次發(fā)現(xiàn)由CandidatusPhytoplasma castaneae引起的板栗黃化皺縮病[4]；2022年唐山、秦皇島、承德等板栗主產(chǎn)區(qū)也受到該病原菌的侵襲[5]，造成大部分板栗絕產(chǎn)；2010年姜淑霞等[6]發(fā)現(xiàn)，Phomopsis mollissima引起板栗褐緣葉枯病，該病害嚴(yán)重時(shí)影響發(fā)芽抽梢，且極易誘發(fā)板栗疫病，引起樹木整株死亡。

板栗果實(shí)腐爛病是栗仁常見的主要病害，嚴(yán)重影響板栗的口感。研究發(fā)現(xiàn)，該病害由多種真菌復(fù)合侵染所致[7]；歐洲板栗內(nèi)腐病的病原菌包括6個(gè)屬[8]，我國(guó)包括13個(gè)屬[9-11]。鏈格孢菌（Alternaria alternata）是課題組前期在感病栗仁上分離獲得的1株病原菌，通過驗(yàn)證證實(shí)其為冀東地區(qū)引起板栗內(nèi)腐病的主要致病菌之一，與王海霞等[12]報(bào)道的北京地區(qū)優(yōu)勢(shì)菌株一致。該病原菌寄主范圍廣泛，可侵染柑橘[13]、番茄[14]、高粱[15]等400多種植物。近年來(lái)板栗內(nèi)腐病在河北、山東等北方主要板栗產(chǎn)區(qū)呈暴發(fā)趨勢(shì)[16]，該病害的主要特點(diǎn)是栗果外觀無(wú)異常，而在栗仁上產(chǎn)生各種各樣的壞死性斑點(diǎn)，嚴(yán)重影響板栗產(chǎn)量、品質(zhì)，大大降低了當(dāng)?shù)剞r(nóng)戶的經(jīng)濟(jì)效益[17-20]?？剐云贩N的栽培及合理噴灑殺菌劑是防治板栗內(nèi)腐病的重要措施。目前關(guān)于板栗內(nèi)腐病研究主要集中在病害危害癥狀、主要致病菌及其生物學(xué)特性、侵染循環(huán)、發(fā)病規(guī)律、防治技術(shù)等方面[21-22]，2022年張娜娜等[23]、霍佳歡[24]分別針對(duì)層出鐮孢（Fusarium proliferatum）、禾谷鐮孢（F. graminearum）和可可毛色二孢（Lasiodiplodia theobromae）的抗性品種篩選方面開展了研究。關(guān)于板栗品種對(duì)A. alternata抗性篩選的相關(guān)研究尚未見報(bào)道。因此，本研究選取當(dāng)?shù)?4個(gè)板栗品種，采用菌絲塊離體接種法研究其對(duì)A. alternata的室內(nèi)抗性，并進(jìn)一步通過統(tǒng)計(jì)分析發(fā)病率、病斑直徑對(duì)其抗性進(jìn)行比較，為生產(chǎn)上篩選優(yōu)質(zhì)抗病品種。此外，為了生產(chǎn)上能高效地防治內(nèi)腐病的發(fā)生，選取7種高效低毒化學(xué)殺菌劑進(jìn)行室內(nèi)藥劑篩選，旨在為開展田間藥效試驗(yàn)及病害防控奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試菌株為板栗內(nèi)腐病病原菌鏈格孢菌（Alternaria alternata），由河北省板栗產(chǎn)業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心提供。菌種于試管4 ℃保存，轉(zhuǎn)接于PDA（potato dextrose agar）平板上活化。

供試培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基：葡萄糖15～20 g、馬鈴薯200 g、瓊脂粉15～20 g、純凈水1 000 mL。

供試板栗品種包括‘遵玉’‘紫珀’‘燕寶’‘燕紫’‘東陵明珠’‘老品種’‘燕秋’‘小薄皮’‘燕龍’‘燕麗’‘燕奎’‘燕山早豐’‘大板紅’‘燕山短枝’共14個(gè)品種。

供試殺菌劑：25%嘧菌酯懸浮劑、25%咯菌腈懸浮劑、10%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑購(gòu)自先正達(dá)作物保護(hù)有限公司；10%多抗霉素可濕性粉劑購(gòu)自日本科研制藥株式會(huì)社；20%吡噻菌胺懸浮劑購(gòu)自日本三井化學(xué)AGRO株式會(huì)社；25%氰烯菌酯懸浮劑購(gòu)自江蘇省農(nóng)藥研究所股份有限公司；30%丙硫菌唑懸浮劑購(gòu)自安徽久易農(nóng)業(yè)股份有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 板栗果仁接種方法 使用打孔器（0.5 cm）在活化好的病原菌(A. alternata)菌落邊緣打取菌餅備用；然后選取14個(gè)板栗品種新鮮、健康、無(wú)損傷的果仁，采用菌絲塊針刺法[25]進(jìn)行接種。先將果仁用75%酒精進(jìn)行表面消毒30 s，再用無(wú)菌水沖洗3次；在果仁的頂部、底部、腹部分別用注射器造成1針的微傷口，將具有菌絲的一面接種于傷口處，以接種空白培養(yǎng)基為對(duì)照；用保鮮膜進(jìn)行固定保濕，置于已浸濕無(wú)菌濾紙的培養(yǎng)皿中。每處理5個(gè)果仁，重復(fù)3次，25 ℃培養(yǎng)24 h后去除菌絲塊，定時(shí)檢查接種部位是否發(fā)病，并采用十字交叉法測(cè)量病斑擴(kuò)展情況。

1.2.2 不同品種對(duì)A. alternata抗性評(píng)價(jià)方法 病斑發(fā)病率法：根據(jù)王冬梅等[26]對(duì)核桃炭疽病的抗性評(píng)價(jià)方法，定時(shí)檢查接種部位發(fā)病情況，計(jì)算發(fā)病率，公式如下。

病斑平均直徑（average lesion diameter，AD）法：根據(jù)A. alternata接種后第9天時(shí)的病斑直徑大小進(jìn)行等級(jí)劃分，分析14個(gè)板栗品種對(duì)A. alternata的抗性。分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)如下：1級(jí)，0 cm＜AD≤0.2 cm；2級(jí)，0.2 cm＜AD≤0.4 cm；3級(jí)，0.4 cm＜AD≤0.6 cm；4級(jí)，0.6 cm＜AD。

系統(tǒng)聚類分析法：根據(jù)張娜娜等[23]對(duì)栗果鐮孢菌室內(nèi)抗性評(píng)價(jià)方法，依據(jù)接種后第9天時(shí)病斑直徑，運(yùn)用平方歐氏距離法，以歐氏距離2作為最佳聚類分割點(diǎn)，分析14個(gè)板栗品種對(duì)A. alternata的抗性。

1.2.3 不同殺菌劑對(duì)病原菌的室內(nèi)毒力測(cè)定 采用菌絲生長(zhǎng)速率法[27]，測(cè)定不同殺菌劑對(duì)A. alternata的毒力，將嘧菌酯懸浮劑、咯菌腈懸浮劑、多抗霉素可濕性粉劑、吡噻菌胺懸浮劑、苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑、氰烯菌酯懸浮劑和丙硫菌唑懸浮劑共7種殺菌劑采用推薦含量作為中間水平進(jìn)行初步篩選，分別為660、500、660、500、330、560和18 mg·L-1。在超凈工作臺(tái)中配制含藥PDA平板，用打孔器取其病原菌菌餅（0.7 cm）置于不同含藥PDA中央，以不加殺菌劑的PDA培養(yǎng)基作為對(duì)照（CK），進(jìn)行殺菌劑初步篩選，25 ℃培養(yǎng)5 d，每處理重復(fù)3次，采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，計(jì)算抑菌率[28]，公式如下。

根據(jù)病原菌在含不同殺菌劑PDA培養(yǎng)基上菌絲的生長(zhǎng)情況及抑菌率，選擇抑菌率大于80%作為對(duì)該病害防控的有效殺菌劑。設(shè)置咯菌腈含量分別為15.63、31.25、62.50、125.00、250.00 mg·L-1；吡噻菌胺含量分別為62.5、125.0、250.0、500.0、1 000 mg·L-1。每處理重復(fù)3次，培養(yǎng)5 d后觀察病原菌在PDA上的生長(zhǎng)情況并測(cè)量菌落直徑，以含量對(duì)數(shù)值x和抑制菌落生長(zhǎng)百分率的概率值y求毒力回歸方程，計(jì)算半最大效應(yīng)濃度（concentration for 50% of maximal effect，EC50）。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)和聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同板栗品種對(duì)A. alternata室內(nèi)抗性鑒定

2.1.1 不同板栗品種接種A. alternata發(fā)病率分析 不同品種的發(fā)病率如表1所示。接種后第3天，‘遵玉’‘燕寶’‘燕奎’‘燕紫’‘燕秋’‘燕山早豐’和‘大板紅’開始發(fā)病，其中‘燕寶’的發(fā)病率最高，為26.67%；其次為‘燕紫’‘燕秋’‘燕山早豐’‘大板紅’，發(fā)病率為10.00%～18.00%；‘遵玉’‘燕奎’發(fā)病率較低，均低于5.00%。接種后第4天，所有品種均發(fā)病。隨著接種時(shí)間的延長(zhǎng)，‘遵玉’發(fā)病速率最快，到第9天時(shí)遵玉發(fā)病率達(dá)100.00%，說(shuō)明該品種對(duì)A. alternata病原菌表現(xiàn)出明顯的感病性?！帻垺蟀寮t’‘燕山短枝’的發(fā)病率均低于55.00%，說(shuō)明這3個(gè)品種對(duì)A. alternata具有一定的抗性。

9 d種接Inoculation 9 d 100.00±0.00 aA接種2.22 aA 97.78±8 d Inoculation 8 d t varieties 2.22 aA種7 d 95.55±病率lterna ria的6 d種lated in different C hinese chestnu發(fā)Disease incidence/%Inoculation 7 d種A. a2.22 aA Inoculation 6 d接88.89±率接接ria inocu 發(fā)病種品栗板同不種接2.22 aA 1表ce of A. alterna Table 1 Inciden 5 d Inoculation 5 d 71.11±4 d種接Inoculation 4 d 2.22 aAB 42.22±3 d種接Inoculation 3 d 4.45±2.22 dD品種Variety 玉Zunyu遵2.22 bB 82.22±2.22 bBC 75.55±2.22 cCD 62.22±2.22 dBC 48.89±D 2.22 cdeBC 48.89±0.00 bC 33.33±0.00 aA 26.67±寶Yanbao燕C 0.00 bcB 80.00±2.22 bB 77.78±2.22 bB 75.55±2.22 bB 57.78±2.22 eD 44.45±2.22 cD 24.45±0.00±0.00 dD種Laopinzhong品老D 2.22 bcdBC 77.78±D 2.22 cdC 68.69±0.00 cC 66.67±2.22 bB 57.78±2.22 bB 55.55±2.22 bBC 35.55±0.00±0.00 dD珀Zipo紫D 2.22 cdeBC 75.55±2.22 bBC 75.55±0.00 cC 66.67±2.22 bcB 55.55±2.22 bB 55.55±2.22 aA 44.45±4.45±2.22 dD奎Yankui燕D 2.22 cdeBC 75.55±D 0.00 cdC 66.67±0.00 cC 66.67±2.22 bB 57.78±C 0.00 bcB 53.33±2.22 cD 24.45±0.00±0.00 dD珠Donglingmingzhu明陵?yáng)|D 0.00 deC 73.33±D 0.00 cdC 66.67±2.22 eEF 48.89±0.00 dC 46.67±0.00 fE 33.33±2.22 cD 24.45±2.22 bB 17.78±紫Yanzi燕D 0.00 deC 73.33±2.22 cCD 68.89±2.22 cCD 62.22±2.22 dBC 48.89±D 0.00 deC 46.67±F 2.22 deE 15.55±0.00±0.00 dD皮Xiaobopi薄小2.22 eD 71.11±2.22 eE 57.78±H 2.22 fgG 37.78±E 0.00 efD 33.33±0.00 gEF 26.67±F 2.22 deE 15.55±0.00 cBC 13.33±秋Yanqiu燕2.22 eD 71.11±2.22 eE 57.78±2.22 eEF 48.89±2.22 fDE 31.11±2.22 fgE 31.11±G 2.22 efF 11.11±2.22 cC 11.11±豐Yanshanzaofeng早山燕2.22 fE 62.22±0.00 gF 53.33±E 2.22 deD 62.22±2.22 fF 48.89±2.22 dDE 55.55±2.22 fFG 42.22±C 2.22 cdB 51.11±2.22 eD 37.78±D 2.22 bcdBC 51.11±2.22 fgE 31.11±2.22 aAB G 42.22±0.00 eEF 13.33±0.00±0.00 dD 0.00±0.00 dD Yanli麗燕燕龍Yanlong 2.22 gFG 51.11±2.22 fF 48.89±0.00 fGH 40.00±2.22 fDE 31.11±2.22 fgE 28.89±E 0.00 cdD 20.00±2.22 cC 11.11±紅Dabanhong板大2.22 hG 44.45±2.22 gF 42.22±0.00 gH 33.33±2.22 fE 28.89±0.00 hF 20.00±6.67±0.00 fG 0.00±0.00 dD枝Yanshanduanzhi短山燕respectively.levels，0.05 0.01 and P＜。著顯異差平0.05水P＜0.01和n indicate significant differences between different varieties at P＜P＜在e colum別ercase letters in sam 間種品同不示表分母字寫、小大注Note：Differen t capital and low同不列同：

2.1.2 不同板栗品種對(duì)A. alternata的抗性分析對(duì)A. alternata在不同板栗品種上病斑擴(kuò)展直徑進(jìn)行分析，結(jié)果（表2）表明，病原菌在14個(gè)供試品種的栗仁上均可侵染，但其病斑擴(kuò)展范圍存在差異，接種后第9天病斑擴(kuò)展直徑為0.13～0.90 cm。采用病斑平均直徑法和系統(tǒng)聚類分析法均可將14個(gè)板栗品種劃分為4個(gè)類群（圖1），類群Ⅰ包括5個(gè)品種，占供試品種33.33%；類群Ⅱ包括6個(gè)品種，占供試品種40.00%；類群Ⅲ包括2個(gè)品種，占供試品種13.33%；類群Ⅳ僅包括1個(gè)品種。在供試板栗品種中未發(fā)現(xiàn)對(duì)A. alternata免疫的品種。各品種抗性表現(xiàn)為‘燕山短枝’＞‘大板紅’＞‘燕麗’＞‘燕奎’＞‘老品種’＞‘燕龍’＞‘燕山早豐’＞‘小薄皮’＞‘燕秋’＞‘紫珀’＞‘燕寶’＞‘燕紫’＞‘東陵明珠’＞‘遵玉’。

圖1 14個(gè)板栗品種接種A. alternata病斑直徑聚類分析Fig. 1 Cluster analysis of 14 Chinese chestnut varieties based on AD of disease spots inoculated by A. alternata

表2 不同板栗品種對(duì)A. alternata的抗性Table 2 Resistances of different Chinese chestnut varieties to A. alternata

2.2 7種供試殺菌劑室內(nèi)篩選

2.2.1 7種殺菌劑對(duì)A. alternata抑菌效果的室內(nèi)篩選 不同水平的7種殺菌劑對(duì)A. alternata菌落生長(zhǎng)均有一定的影響（表3，圖2）。在25 ℃培養(yǎng)5 d，咯菌腈對(duì)A. alternata的抑制效果最佳，菌落直徑為0.40 cm，抑制率高達(dá)93.75%；其次是吡噻菌胺，菌落直徑為1.07 cm，抑制率為83.33%；嘧菌酯的抑菌效果最差，菌落直徑為3.92 cm，抑制率僅38.80%。7種殺菌劑對(duì)A. alternata的抑菌效果表現(xiàn)為咯菌腈＞吡噻菌胺＞苯醚甲環(huán)唑＞丙硫菌唑＞氰烯菌酯＞多抗霉素＞嘧菌酯。

圖2 不同殺菌劑下A. alternata的生長(zhǎng)Fig. 2 Growth of A. alternata under different fungicides

表3 不同殺菌劑對(duì)A. alternata的抑制效果Table 3 Inhibitory effects of different fungicides on A.alternata

2.2.2 2種殺菌劑對(duì)A. alternata室內(nèi)毒力測(cè)定為了明確咯菌腈和吡噻菌胺適宜的殺菌水平，采用不同水平的殺菌劑對(duì)A. alternata進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，結(jié)果（表4,圖3）表明，CK菌落的直徑為6.30 cm；經(jīng)殺菌劑處理后菌絲生長(zhǎng)緩慢。在含咯菌腈殺菌劑的平板上，菌落直徑為0.55～5.78 cm，當(dāng)咯菌腈為250.00 mg·L-1時(shí)，抑菌率達(dá)到90%以上，顯著高于其他處理；其余處理的抑菌率均低于60%；毒力分析表明EC50為69.94 mg·L-1。在含吡噻菌殺菌劑的平板上，不同處理對(duì)A. alternata菌絲的抑制效果不同，當(dāng)吡噻菌為500.0、1 000.0 mg·L-1時(shí)，菌落直徑分別為1.82、1.45 cm，抑菌率均達(dá)70%以上，顯著高于其他處理；毒力分析表明EC50為71.96 mg·L-1。

圖3 不同水平供試殺菌劑下A. alternata菌絲的生長(zhǎng)Fig.3 Mycelial growth of A. alternata under different levels of tested fungicides

表4 不同含量的殺菌劑下A. alternata菌絲的生長(zhǎng)Table 4 Growth of A. alternata mycelia at different contents of tested fungicides

3 討論

采用室內(nèi)離體接種病原菌篩選抗性品種的方法已得到廣泛應(yīng)用。室內(nèi)接種避免了田間自然接種及外界環(huán)境的影響，既能保證接種條件的一致性，又可以保證抗病性評(píng)價(jià)的穩(wěn)定性及準(zhǔn)確性。歐智濤等[29]對(duì)11個(gè)柑橘品種的離體葉片進(jìn)行抗?jié)儾【b定，篩選出‘長(zhǎng)安金柑’為高抗品種；賈曉輝等[30]根據(jù)聚類分析法和病斑平均直徑法均將梨和蘋果種質(zhì)劃分為5類；霍佳歡[24]首次在板栗上運(yùn)用系統(tǒng)聚類分析法進(jìn)行可可毛色二孢和茄鐮孢（Fusarium solani）抗性品種的篩選，并篩選出抗病品種‘紫珀’‘燕山早豐’‘燕奎’‘燕紫’‘燕秋’；張娜娜等[23]同樣運(yùn)用系統(tǒng)聚類分析法測(cè)定了20個(gè)板栗品種對(duì)3種鐮孢菌抗性。本研究首次根據(jù)發(fā)病率、病斑平均直徑法和系統(tǒng)聚類分析法分析14個(gè)板栗品種對(duì)A. alternata的抗性，通過觀察接種后的發(fā)病率和病斑直徑擴(kuò)展情況，未發(fā)現(xiàn)免疫品種，不同品種的發(fā)病率存在差異；接種后9 d，‘遵玉’發(fā)病率最高，為100%；‘燕山短枝’和‘大板紅’發(fā)病率最低，分別為44.45%和51.11%；采用病斑平均直徑法和系統(tǒng)聚類分析法均將14個(gè)板栗品種劃分為4個(gè)類群；根據(jù)病斑直徑各品種的抗性表現(xiàn)為‘燕山短枝’＞‘大板紅’＞‘燕麗’＞‘燕奎’＞‘老品種’＞‘燕龍’＞‘燕山早豐’＞‘小薄皮’＞‘燕秋’＞‘紫珀’＞‘燕寶’＞‘燕紫’＞‘東陵明珠’＞‘遵玉’。通過3種方法評(píng)價(jià)14個(gè)品種的抗性，結(jié)果表明，‘遵玉’的抗性較弱；‘燕山短枝’和‘大板紅’的抗性較強(qiáng)，與張娜娜等[23]研究結(jié)果一致。未來(lái)將分析更多板栗品種資源對(duì)A. alternata的抗性，為板栗抗病育種的親本選擇提供參考。

科學(xué)用藥是防治植物病害的有效措施，在室內(nèi)采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定殺菌劑對(duì)病原菌的毒力是篩選有效殺菌劑的主要方法，也是后期進(jìn)行田間藥劑防控的基礎(chǔ)依據(jù)。試驗(yàn)采用菌絲生長(zhǎng)速率法對(duì)A. alternata進(jìn)行了7種殺菌劑室內(nèi)篩選，發(fā)現(xiàn)咯菌腈對(duì)該病原菌抑制效果最好，抑菌率達(dá)到90%以上，EC50為69.94 mg·L-1，與前人研究結(jié)果一致[31]。本研究中嘧菌酯對(duì)板栗內(nèi)腐病菌A. alternata抑菌效果最差，抑制率僅為38.80%，而嘧菌酯對(duì)A. alternata引起的甜瓜黑斑病的抑制效果最佳[32]，這可能是寄主不同導(dǎo)致A. alternata對(duì)殺菌劑敏感程度不同。此外，本試驗(yàn)僅對(duì)A. alternata進(jìn)行了室內(nèi)毒力測(cè)定，還需進(jìn)一步研究田間藥效；同時(shí)，長(zhǎng)期使用殺菌劑防治會(huì)使病原菌的抗藥性不斷提高，因此在進(jìn)行藥劑防治時(shí)，應(yīng)準(zhǔn)確掌握施藥時(shí)間、用量，并輪換使用藥劑。