枸杞根腐致病菌及拮抗菌的分離鑒定

朱 杰,程 亮,3,姚 強(qiáng),3,李秋榮,陳紅雨,3,郭青云,3

(1.青海大學(xué) 農(nóng)林科學(xué)院,西寧 810016;2.青海省農(nóng)業(yè)有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,西寧 810016;3.西寧農(nóng)業(yè)農(nóng)村部作物有害生物科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站,西寧 810016)

枸杞是茄科植物(Lyciumbarbarum),它不僅是中國(guó)傳統(tǒng)的珍貴中藥材,還被中國(guó)批準(zhǔn)為藥食同源的首批產(chǎn)品之一[1]。病害的發(fā)生會(huì)導(dǎo)致枸杞的產(chǎn)量及品質(zhì)遭受嚴(yán)重的破壞[2],枸杞根腐病是青海省栽培枸杞林的主要病害之一,發(fā)病率高達(dá)53.2%以上,近幾年還呈現(xiàn)逐步上升的趨勢(shì)[3]。枸杞根腐病是一種全株性的系統(tǒng)病害,整個(gè)生育期都可發(fā)病,在青海省德令哈市、都蘭縣、諾木洪縣、格爾木縣和寧夏、內(nèi)蒙古、新疆均有分布[3]。據(jù)報(bào)道,枸杞根腐病的致病菌約有9種:尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)、腐皮鐮刀菌(F.solani)、同色鐮刀菌(F.concolor)等[3-4],其中以尖孢鐮刀菌致病力最強(qiáng)。尖孢鐮刀菌屬于鐮刀菌屬土傳真菌,該菌引起的病害很難防治[5],其原因有:寄主植物根際分泌物會(huì)刺激尖孢鐮刀菌孢子萌發(fā)和芽管生長(zhǎng)[6];該菌會(huì)分泌細(xì)胞壁降解酶(CWDEs)和毒素進(jìn)行侵染[7],其鐮刀菌酸(FA)和伏馬菌素(FB)等毒素會(huì)干擾宿主呼吸,損害宿主的抗病反應(yīng)[8];鐮刀菌具有逃避植物防御的調(diào)控基因[9],還有很強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)能力[10]。

目前,防治枸杞根腐病害以培育種植抗病品種和使用化學(xué)藥劑為主[11]。中國(guó)農(nóng)業(yè)種植中過度使用農(nóng)藥,不僅污染環(huán)境,還威脅人類健康發(fā)展[12],而生物防治可以有效解決病原菌抗性、再猖獗以及農(nóng)藥殘留等問題,同時(shí)還能促進(jìn)綠色農(nóng)業(yè)發(fā)展[13]。從植物根際土壤中分離出的生防菌在植物體表及土壤具有一定的定殖能力[14]。相比真菌和放線菌,生防細(xì)菌種類和數(shù)量繁多,繁殖速度較快,還能產(chǎn)生特有的細(xì)菌素[15]。生防細(xì)菌可以通過競(jìng)爭(zhēng)作用,產(chǎn)生抑菌物質(zhì),誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗病性等方式有效抑制病原菌的危害[14]。Katz等[16]發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌可以產(chǎn)生脂肽類、蛋白酶等以降解病原菌細(xì)胞壁。Balthazar等[17]發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌可以誘導(dǎo)寄主植物激活自身的防御基因以此來響應(yīng)病原菌的侵入。本試驗(yàn)分離鑒定枸杞根腐病病原菌后,以此為靶標(biāo),篩選具有拮抗效果的生防細(xì)菌,明確其種類,為枸杞根腐病的生物防治提供菌種資源和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

病樣采集:于2019-2021年 6-8 月從青海省海西蒙古族藏族自治州烏蘭縣(97°01′99.27″E,36°19′37.20″N,海拔 3 285 m);都蘭縣諾木洪(98°09′98°13″ E,36°30′36.39″N,海拔3 180 m);德令哈市柯魯柯鎮(zhèn)(90°07′99.46″E,35°01′39.19″N,海拔2 942 m) 采集具有典型枸杞根腐病病害癥狀的植株根莖部各10份,對(duì)其利用組織分離法分離純化病原菌株,并對(duì)植株病害癥狀描述記錄。

土壤樣本:從青海省海西蒙古族藏族自治州烏蘭縣(97°01′99.27″E,36°19′37.20″N,海拔 3 285 m)栽培枸杞林中發(fā)病與未發(fā)病植株根際采集土壤樣本各5份,利用稀釋平板法對(duì)土樣中細(xì)菌進(jìn)行分離純化,編號(hào)保存。

1.2 病原菌形態(tài)特征觀察

將分離純化后的菌株轉(zhuǎn)移至PDA平板, 25 ℃恒溫培養(yǎng),直接觀察并記錄病原菌的菌落顏色、形態(tài),生長(zhǎng)速率;在顯微鏡下測(cè)量和記錄菌絲、分生孢子的形態(tài)、分隔、大小。

1.3 病原菌分子生物學(xué)鑒定

選擇形態(tài)鑒定后具有代表性的菌株,利用真菌試劑盒提取病原菌的DNA,選用引物ITS1/ITS4擴(kuò)增基因間隔序列(ITS);引物EF-1H/EF-2T擴(kuò)增翻譯延伸因子基因序列(TEF-1α)(表1)。PCR反應(yīng)體系(20 μL):正,反向引物 (10 μmol/L)各0.5 μL,DNA 模板 1 μL,2×PCR Mix 10 μL,dd H2O 8 μL。反應(yīng)程序如下。

表1 所用引物序列Table 1 Primer sequences in this study

ITS:99 ℃預(yù)變性5 min,95 ℃變性45 s, 58 ℃退火45 s,72 ℃延伸1 min,30 個(gè)循環(huán),最后72 ℃延伸5 min。

TEF-1α:94 ℃預(yù)變性5 min,94 ℃變性30 s,52 ℃退火45 s,68 ℃延伸50 s,35 個(gè)循環(huán),最后68 ℃延伸5 min。

擴(kuò)增產(chǎn)物提交楊凌天潤(rùn)奧科生物科技有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)及GenBank 中已知序列進(jìn)行相似性比對(duì)分析,再使用 MEGA 6.0 軟件將目的序列與模式菌株進(jìn)行多重比對(duì),選用K2模型和鄰近法(Neighbor-Joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,確定分離菌株的種屬分類地位。

1.4 柯赫氏法則驗(yàn)證

按柯赫法則(Koch postulates) 進(jìn)行驗(yàn)證,使用兩年生枸杞苗,栽植于無菌營(yíng)養(yǎng)土,放置于溫室,提供適合菌株生長(zhǎng)的溫度和水分。將根莖處韌皮部用無菌刀片劃開2～3 cm,取與傷口同面積的菌絲于劃傷處,并用濕潤(rùn)的滅菌棉花包裹,使傷口處保持水膜狀態(tài)。每個(gè)重復(fù)處理 3株,待發(fā)病后,觀察發(fā)病癥狀,并取發(fā)病組織再次進(jìn)行分離純化,最后與接種菌株進(jìn)行比較。

1.5 生防細(xì)菌的篩選

利用平板對(duì)峙法,將分離得到的細(xì)菌與病原菌分別置于NA、PDA培養(yǎng)基上,25 ℃恒溫培養(yǎng)。于PDA平板中央接種直徑為0.5 cm的病原菌菌餅,距離餅2.5 cm處用接種針點(diǎn)接細(xì)菌,以只接病原菌的PDA平板為對(duì)照,設(shè)置3次重復(fù),培養(yǎng)7 d后觀察細(xì)菌株對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的抑制效果。其中以尖孢鐮刀菌為靶標(biāo)菌進(jìn)行初步篩選,再利用尖孢鐮刀菌、木賊鐮刀菌、三線鐮刀菌、黃色鐮刀菌做為靶標(biāo)菌進(jìn)行復(fù)篩得到抑制率。

病原菌生長(zhǎng)抑制率=(對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑)/對(duì)照菌落直徑×100%

1.6 生防細(xì)菌的形態(tài)學(xué)鑒定

在NA培養(yǎng)基上,28 ℃恒溫培養(yǎng)目的菌株 48 h,觀察其菌落形態(tài)特征,并進(jìn)行革蘭氏染色。

1.7 生防細(xì)菌的分子生物學(xué)鑒定

利用細(xì)菌試劑盒提取生防菌的DNA,用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,選用引物為:27F/1492R、UP1-F/UP-2R。分別擴(kuò)增16S rDNA和GyrB基因序列,引物序列見表1。PCR反應(yīng)體系同“1.3”,反應(yīng)程序如下。

16S rDNA:95 ℃預(yù)變性5 min; 94 ℃變性30 s,58 ℃退火30 s,72 ℃延伸60 s,30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。

GyrB:95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性45 s, 60 ℃退火45 s,72 ℃延伸80 s,35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。

PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物和基因序列處理同“1.3”。

1.8 數(shù)據(jù)處理

所得數(shù)據(jù)用 DPS V9.01、SPSS 18.0軟件進(jìn)行方差分析和顯著性分析。根據(jù)處理的數(shù)據(jù)用Microsoft Excel 2010制作圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 枸杞根腐病病樣的采集及分離結(jié)果

從青海省海西蒙古族藏族自治州烏蘭縣、德令哈市柯魯柯鎮(zhèn)、都蘭縣諾木洪栽培枸杞林采集的病樣中共分離獲得23株真菌。采集的病樣癥狀為:植株地上部分無明顯病變,感病較重的植株葉片變黃脫落;于植株根莖處,撥開韌皮部,可見褐色病變及白色霉層,嚴(yán)重時(shí)伴有腐爛(圖1)。

圖1 采集的枸杞根腐病樣癥狀Fig.1 L.barbarum root rot-like symptoms

2.2 病原菌形態(tài)特征觀察

根據(jù)在PDA平板上的形態(tài)對(duì)分離得到的23株真菌進(jìn)行分類,共分為4種,分別為A類(G6-1,G6,GA-9-2)、B類(G6-2,GB-2-2,GB-2-3)、C類(G2-2,GA-2)、D類(LG-1,LG-1-1,LG-1-2,LG-1-3,LG-2,LG-3,LG-4,LG-5,LG-6,LG-6-1,G9-2,GA-3,GA-3-4,GB-6,GB-6-2),另選取D類中5株具有代表性的菌株(LG-4,LG-3,LG-1-3,LG-1-2,LG-6-1)進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定,以上4類真菌的形態(tài)學(xué)特征如下。

2.2.1 A類 菌絲稀疏,菌落正反面初期為中間深紅,四周淺紅,氣生菌絲氈絮狀,后期菌落中心開始出現(xiàn)黃色,7 d可長(zhǎng)滿整個(gè)皿。其分生孢子中間彎曲不明顯,兩端分隔細(xì)胞稍尖,3～5個(gè)隔膜,大小為6.90～14.73 μm,菌絲直徑平均約為1.40～2.65 μm,產(chǎn)孢細(xì)胞直接生長(zhǎng)在菌絲上,為單瓶梗(圖2)。初步鑒定為黃色鐮刀菌(F.culmorum)。

A1/A2.菌落正/反形態(tài);A3/A4.分生孢子及孢子梗形態(tài);A5.厚垣孢子形態(tài);A6.菌絲形態(tài)

2.2.2 B類 菌絲致密,菌落正面中心白綠,外圍紫紅色/黃色。中間與外圍菌絲有明顯分界線,背面菌落中心呈米黃色,外圍淡褐色,7天可長(zhǎng)62.32 mm。小型分生孢子呈檸檬形/梨形/瓜子形,大型分生孢子1～3個(gè)隔膜,平均4.07～7.01 μm,菌絲直徑約為2.5～7.5 μm(圖3)。初步鑒定為三線鐮刀菌(F.tricinctum)。

A1/A2.菌落正/反形態(tài);A3/A4/A5.分生孢子及孢子梗形態(tài);A6.小型分生孢子形態(tài)

2.2.3 C類 菌絲稀疏,部分菌落有輪紋,呈氈絮狀,7 d可長(zhǎng)78.48 mm,菌落正面白色/淡粉色,背面白色/淡粉色,菌絲直徑平均約為1.6～3.5 μm。小型分生孢子卵型,大型分生孢子分隔 1～3個(gè),平均大小為16.56～20.91 μm,產(chǎn)孢類型為單生(圖4)。初步鑒定為木賊鐮刀菌(F.equiseti)。

A1/A2.菌落正/反形態(tài);A3.菌絲形態(tài);A4/A5.分生孢子及孢子梗形態(tài);A6.小型分生孢子形態(tài)

2.2.4 D類 菌絲致密,隆起;氈絮狀,后期簇狀,微濕;菌落圓形,表面干燥,不透明,正面白色或菌落正面中心嫩黃色,背面膚色,邊緣白色或嫩黃色。菌絲長(zhǎng)勢(shì)較慢,7 d可長(zhǎng)38.11 mm,菌絲直徑平均約為1.56～3.16 μm。其小型分生孢子數(shù)量多,橢圓形,0～1 分隔,多數(shù)無隔,平均大小約為7.34～10.89 μm,單生(單瓶梗產(chǎn)孢,產(chǎn)孢梗短)及假頭狀聚生(圖5)。初步鑒定為尖孢鐮刀菌(F.oxysporum)。

2.3 病原菌分子生物學(xué)鑒定

經(jīng)同源性比較分析后發(fā)現(xiàn),基于rDNA-ITS基因序列所測(cè)長(zhǎng)度為510～560 bp,TEF-1α基因所測(cè)序列長(zhǎng)度為660～690 bp。將病原菌的5.8S rDNA和28S rDNA基因間隔序列(ITS)和翻譯延伸因子基因序列(TEF-1α)聯(lián)合構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,結(jié)果表明:菌株GB-2-3、G6-2、GB-2-2與三線鐮刀菌(F.tricinctum)模式菌株Z5(EF611092.1)和WAC:12337(JF776666.1)以100%序列相似性聚為一枝,菌株LG-4、LG-3、LG-1-3、LG-1-2、LG-6-1以100%序列相似性與尖孢鐮刀菌(F.oxysporum)模式菌株ATCC 34298(DQ452454.1/ DQ452431.1)和ATCC 16416(DQ452450.1/ DQ452427.1)聚為一枝,菌株GA-2、G2-2與木賊鐮刀菌(F.equiseti)模式菌株NRRL 26419(NR_121457.1/GQ505599.1)以100%相似性聚在一枝,菌株GA-9-2、G6-1、G6與黃色鐮刀菌(F.culmorum)模式菌株EI3b(KC311482.1)和WN75(GU370481.1) 以100%序列相似性聚為同一枝(圖6)。

T.模式種,下同

綜上,可將菌株GB-2-3、G6-2、GB-2-2鑒定為三線鐮刀菌(F.tricinctum),菌株LG-4、LG-3、LG-1-3、LG-1-2、LG-6-1鑒定為尖孢鐮刀菌(F.oxysporum),菌株GA-2、G2-2鑒定為木賊鐮刀菌(F.equiseti),菌株GA-9-2、G6-1、G6鑒定為黃色鐮刀菌(F.culmorum)。

2.4 柯赫氏法則驗(yàn)證

從枸杞根腐病病株上共分離出 23 個(gè)菌株,經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定后對(duì)其進(jìn)行柯赫氏法則驗(yàn)證。選取健康的2 a生枸杞苗進(jìn)行試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),接種清水對(duì)照(圖7-E)未發(fā)病,接種尖孢鐮刀菌、三線鐮刀菌、木賊鐮刀菌、黃色鐮刀菌的植株發(fā)病,且發(fā)病情況與取樣時(shí)的病癥相似。

A.接種黃色鐮刀菌;B.接種三線鐮刀菌;C.接種木賊鐮刀菌;D.接種尖孢鐮刀菌;E.接種清水

接種黃色鐮刀菌的植株葉尖變黃;接種部位有些許白色霉層,向上延伸,病部未見明顯的變色(圖7-A)。接種三線鐮刀菌的植株葉片顏色和形態(tài)均無明顯變化;接種部位變成黑褐,向上延伸,維管束中央呈紅色病變,與正常維管束顏色差距較大(圖7-B)。接種木賊鐮刀菌的植株葉片無黃化現(xiàn)象。接種部位發(fā)生黃褐色病變,維管束組織呈現(xiàn)淺褐色(圖7-C)。接種尖孢鐮刀菌的植株維管束無明顯變化,葉上部無明顯變化,接種部位發(fā)成黃褐色病變,有明顯白色霉層(圖7-D)。

對(duì)病部進(jìn)行再分離,鑒定,能獲得與原接種菌株形態(tài)及種類一致的病原菌。根據(jù)柯赫氏法則驗(yàn)證,試驗(yàn)中的尖孢鐮刀菌、木賊鐮刀菌、三線鐮刀菌、黃色鐮刀菌均為枸杞根腐病的病原菌。

2.5 生防細(xì)菌的篩選

2.5.1 初篩結(jié)果 從土壤中分離到660 株細(xì)菌菌株,以尖孢鐮刀菌為靶標(biāo)利用平板對(duì)峙法初步篩選每株細(xì)菌的拮抗效果(圖8),發(fā)現(xiàn):對(duì)尖孢鐮刀菌有拮抗作用的有8株,分別是QH-664、QH-667、QH-668、QH-588、QH-001、QH-468、QH-400和QH-390。

圖8 拮抗細(xì)菌初篩Fig.8 Preliminary screening of antagonistic bacteria

2.5.2 復(fù)篩結(jié)果 利用4種枸杞根腐病原菌為靶標(biāo)進(jìn)行復(fù)篩,結(jié)果發(fā)現(xiàn):QH-668、QH-667、QH-664、QH-588、QH-468、QH-400、QH-001和QH-390這8株生防菌對(duì)黃色鐮刀菌、三線鐮刀菌、木賊鐮刀菌、尖孢鐮刀菌均具有抑制效果;其中菌株QH-588對(duì)這4株病原菌的抑制效果最好,抑制率依次為:45.95%、36.09%、41.52%、51.79%;其次是菌株QH-468和QH-001。另外,菌株QH-668、QH-667、QH-664對(duì)病原菌的抑制率相差不大,抑制率較小的為菌株QH-400和QH-390(表2)。

表2 生防菌復(fù)篩抑制率Table 2 Re-screening inhibition rate of biocontrol bacteria

2.6 生防細(xì)菌的形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果

菌株QH-588、QH-668、QH-667、QH-664、QH-468、QH-001、QH-400和QH-390的革蘭氏染色均為紫色,表明這8株生防細(xì)菌均為革蘭氏陽性菌(圖9-i-9-p)。除菌株QH-400、QH-390菌落在NA培養(yǎng)基上透明,呈白色,泛青,表明干燥外(圖9-b,9-c),其余菌株的菌落在NA培養(yǎng)基上均為乳白色,不透明,邊緣不規(guī)則,表明不光滑(圖9-a,9-d-9-h)。經(jīng)形態(tài)學(xué)初步鑒定菌株QH-400、QH-390為芽孢桿菌屬(Bacillus)。

a、b、c、d、e、f、g、h依次分別為QH-001、QH-390、QH-400、QH-468、QH-588、QH-664、QH-667、QH-668的菌落形態(tài);i、j、k、l、m、n、o、p.依次分別為QH-001、QH-390、QH-400、QH-468、QH-588、QH-664、QH-667、QH-668的革蘭氏染色

2.7 生防細(xì)菌的分子生物學(xué)鑒定

將生防細(xì)菌的16S基因序列和GyrB基因序列聯(lián)合構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,結(jié)果表明:菌株QH-468、QH-668、QH-664、QH-001、QH-667與枯草芽孢桿菌(B.subtilis)模式菌株BCRC10255(NR_116017.1/DQ309293.1)以100%序列相似性聚為一枝,菌株QH-588以100%序列相似性與萎縮芽孢桿菌(B.atrophaeus)模式菌株BCRC 17123(EF433409.1/DQ309296.1)聚為一枝,菌株QH-390、QH-400與短小芽孢桿菌(B.pumilus)模式菌株ATCC 7061(NR_043242.1/JN575338.1)以100%相似性聚在一枝(圖10)。綜上,可將菌株QH-001、QH-468、QH-664、QH-667、QH-668鑒定為枯草芽孢桿菌(B.subtilis);菌株QH-390、QH-400鑒定為短小芽孢桿菌 (B.pumilus);菌株QH-588鑒定為萎縮芽孢桿菌(B.atrophaeus)。

圖10 基于 16S和GyrB基因序列聯(lián)合構(gòu)建生防菌菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.10 Phylogenetic tree of biocontrol bacterial strains based on 16S and GyrB gene sequence

3 討 論

枸杞根腐病是青海省栽培枸杞林的主要病害之一,通過分離鑒定發(fā)現(xiàn)海西蒙古族藏族自治州枸杞根腐病原菌有:三線鐮刀菌、黃色鐮刀菌、尖孢鐮刀菌、木賊鐮刀菌4種,分離比分別為: 13.04%、13.04%、65.22%、8.70%,其中以尖孢鐮刀菌為主。這與寧夏和甘肅靖遠(yuǎn)縣分離出的枸杞根腐病主要致病菌一致[2,19]。據(jù)報(bào)道,枸杞根腐病的致病菌約有9種:尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)、腐皮鐮刀菌(F.solani)、同色鐮刀菌(F.concolor)、串珠鐮刀菌(F.monilifome)、銳頂鐮刀菌(F.acuminatum) 、黃色鐮孢(F.culmorum)、木賊鐮刀菌 (F.equiseti)、寄生疫霉(Phytophthoranicotianae)和立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)[3-4],本研究鑒定出的三線鐮刀菌為首次報(bào)道。鐮刀菌分布極其廣泛,能危害多種作物。除枸杞根腐病以外,鐮刀菌屬中的三線鐮刀菌、黃色鐮刀菌、尖孢鐮刀菌、木賊鐮刀菌同時(shí)能引起馬鈴薯干腐病[22]、苜蓿根腐病[23]等。鐮刀菌不僅能分泌毒素進(jìn)行侵染,在伴隨谷物生長(zhǎng)時(shí),還會(huì)產(chǎn)生玉米赤霉烯酮、單端孢霉烯族化合物、丁烯酸內(nèi)酯[24]等毒素,這些毒素對(duì)人類的健康具有很大的威脅。人們發(fā)現(xiàn)在生防菌的抑制作用過程中,病原菌會(huì)通過各種途徑緩解生防菌的抑制[25]。生物防治目前是防治鐮刀菌病害的有效手段,如衛(wèi)傳昊等[26]發(fā)現(xiàn)生防菌GHt-q6發(fā)酵液對(duì)尖孢鐮刀菌的抑制率可達(dá)78.38%,張小彥[3]發(fā)現(xiàn)中華根瘤菌和綠僵菌對(duì)枸杞根腐病原中的腐皮鐮刀菌抑制率分別為52.29%和 39.80%。傳統(tǒng)的生物防治大多采用單一菌株防治單一病害,但生防菌使用中會(huì)出現(xiàn)適應(yīng)性差、防治效果不好等問題,生防菌組合可以延長(zhǎng)生防菌的作用期限,提高生防效果和穩(wěn)定性[27-28]。如葛紅蓮等[29]利用生防細(xì)菌組合防治辣椒青枯病,相比單一菌株, 復(fù)合菌劑更能適應(yīng)多種病原物、環(huán)境變化和多種類型的土壤。本研究亦對(duì)后期使用組合生防菌防治枸杞根腐病害有借鑒作用。