不同雌激素濃度對(duì)重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白2干預(yù)乳腺癌MCF-7細(xì)胞生長(zhǎng)和遷移影響的體外研究

劉書(shū)中,姚思遠(yuǎn)△,吳昀效,劉 勇*

(1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院 骨科,北京 100730;2.北京大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院,北京100191)

骨形態(tài)發(fā)生蛋白(Bone morphogenetic protein,BMP)是生長(zhǎng)因子β超家族成員之一,迄今已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了30多種BMP,其中應(yīng)用最為廣泛的是骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(BMP-2)[1-2]。自2002年,重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(rhBMP-2)在美國(guó)已被廣泛應(yīng)用于骨不連、骨缺損、脊柱融合的手術(shù)治療中且臨床效果滿(mǎn)意。但與此同時(shí),rhBMP-2的臨床應(yīng)用是否會(huì)增加包括乳腺癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤的患病風(fēng)險(xiǎn)也引發(fā)了學(xué)界的關(guān)注[3]。此外,越來(lái)越多的研究證實(shí)了BMP通路在乳腺癌微鈣化灶形成和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程中的關(guān)鍵作用[4-5]。

BMP-2參與多種生物學(xué)過(guò)程,如組織分化、細(xì)胞增殖與凋亡、細(xì)胞功能調(diào)節(jié)等,并且在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中亦扮演著重要角色[6-7]。有證據(jù)表明BMP-2異常表達(dá)與乳腺癌發(fā)生和進(jìn)展密切相關(guān),BMP相關(guān)通路在調(diào)節(jié)乳腺腫瘤細(xì)胞生物學(xué)功能方面以及調(diào)節(jié)腫瘤間質(zhì)和骨轉(zhuǎn)移微環(huán)境中發(fā)揮重要作用[8]。本團(tuán)隊(duì)前期研究已證實(shí)在體外條件下,以不同濃度的rhBMP-2處理細(xì)胞可顯著抑制乳腺癌MCF-7細(xì)胞的增殖能力,并增加G1期細(xì)胞所占比例、促進(jìn)p21表達(dá)、抑制cyclin E表達(dá),并顯著抑制PI3K/Akt信號(hào)通路的磷酸化過(guò)程[9]。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中rhBMP-2可減小瘤體體積,免疫組化檢測(cè)顯示rhBMP-2處理可顯著降低瘤體組織中ki-67的表達(dá)水平[9]。

值得注意的是,乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程與人體內(nèi)環(huán)境中的雌激素水平密切相關(guān)[10-11]。Al Saleh等的研究表明沉默ERα可使體內(nèi)雌二醇增加伴隨BMP-2過(guò)表達(dá),并與乳腺癌上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)過(guò)程相關(guān)[12]。Wang等研究發(fā)現(xiàn)BMP-2對(duì)MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用可被三苯氧胺拮抗,提示該作用與雌激素受體有關(guān)[13]。不同的雌激素水平很可能在體內(nèi)、體外條件下對(duì)rhBMP-2干預(yù)乳腺癌細(xì)胞的生物學(xué)行為產(chǎn)生進(jìn)一步的影響,干擾甚至可能會(huì)逆轉(zhuǎn)rhBMP-2對(duì)乳腺癌細(xì)胞的生物學(xué)作用。目前尚缺乏不同濃度雌激素對(duì)上述過(guò)程影響的論證結(jié)果,本研究擬探究不同濃度雌激素對(duì)rhBMP-2干預(yù)乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖、遷移、侵襲以及細(xì)胞周期的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

人乳腺癌MCT-7細(xì)胞(由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所提供)、rhBMP-2(Novoprotein,上海)、Noggin(PrimeGene,上海)、雌激素(17β-oestradiol)(BioGems,美國(guó))。試驗(yàn)中使用的青霉素/鏈霉素溶液、胰蛋白酶、PBS緩沖液、MTT試劑、總RNA提取試劑盒、通用反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)定量PCR熒光定量試劑盒均購(gòu)自索萊寶公司,無(wú)水乙醇(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司),胎牛血清、RPMI 1640培養(yǎng)基及其他細(xì)胞培養(yǎng)試劑購(gòu)自Gibco公司,Transwell嵌套、細(xì)胞培養(yǎng)板購(gòu)自Corning公司,細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒購(gòu)自4A Biotech公司。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 將人乳腺癌MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 mg/L鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中,所有細(xì)胞在體積分?jǐn)?shù)5% CO2的37℃培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng),培養(yǎng)液每2 d或3 d更換1次,當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)至80%鋪滿(mǎn)時(shí)消化傳代。

1.2.2細(xì)胞處理 MCF-7細(xì)胞按適當(dāng)密度鋪板(第二天達(dá)80%匯合度),第二天換無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h,然后加入BMP-2、雌激素或noggin處理24 h。BMP-2處理濃度為100 ng/ml;noggin處理濃度為100 ng/ml。

1.2.3細(xì)胞分組 根據(jù)處理MCF-7細(xì)胞的rhBMP-2、noggin以及不同雌激素濃度條件,將各處理組分為：(1)MCF-7細(xì)胞+rhBMP-2;(2)MCF-7細(xì)胞+rhBMP-2+雌激素10-9mol;(3)MCF-7細(xì)胞+rhBMP-2+雌激素10-8mol;(4)MCF-7細(xì)胞+rhBMP-2+雌激素10-7mol;(5)MCF-7細(xì)胞+rhBMP-2+雌激素10-6mol;(6)MCF-7細(xì)胞;(7)MCF-7細(xì)胞+noggin;(8)MCF-7細(xì)胞+rhBMP-2+noggin。

1.2.4MTT試驗(yàn) 消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,在96孔板中接種細(xì)胞懸液(100 μL/孔),將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)一段時(shí)間(37℃,5% CO2),并按以上分組進(jìn)行處理。向每孔加入10 μL MTT反應(yīng)液,將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h;吸走上清液,每孔加入100 μL的DMSO振蕩10 min,酶標(biāo)儀測(cè)定在490 nm處的吸光度。

1.2.5Transwell遷移試驗(yàn)與侵襲試驗(yàn) 首先細(xì)胞采用常規(guī)消化傳代方法,制成細(xì)胞懸液,計(jì)數(shù),調(diào)整濃度為2×105個(gè)/ml。將含10%血清的培養(yǎng)基加入培養(yǎng)板底部,上室加入200 μL細(xì)胞懸液,繼續(xù)在孵箱培養(yǎng)24 h。4%多聚甲醛孔中進(jìn)行固定。取出培養(yǎng)板,PBS清洗兩次。100%甲醇室溫固定20 min后移到預(yù)先加入約700 μL 2.5%結(jié)晶紫溶液中,室溫染色15 min。PBS清洗、晾干后,使用熒光倒置顯微鏡完成細(xì)胞計(jì)數(shù)并拍照保存。

1.2.6流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期 收集細(xì)胞,加入1 ml冰浴預(yù)冷的PBS重懸細(xì)胞。1 ml細(xì)胞懸液與95%乙醇混勻后4℃固定12 h,1000 rpm離心3 min,棄上清。加入5 ml 冰浴預(yù)冷的PBS重懸細(xì)胞,1000 rpm離心3 min,棄上清,配置PI染色液。染色：每管加入400 μl PI染色液,渦旋,避光30 min。上機(jī)檢測(cè)(在激發(fā)波長(zhǎng)488 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)紅色熒光)。

1.2.7qPCR試驗(yàn) ①RNA提?。菏占?xì)胞沉淀,加入1 ml Trizol,室溫放置5 min,使得核酸蛋白復(fù)合物完全分離。重復(fù)離心、去廢液操作萃取RNA。②逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：在冰浴的無(wú)RNase的離心管中加入反應(yīng)成分。70℃保溫5 min后迅速在冰上冷卻2 min。將離心管置25 ℃溫浴10 min,42 ℃溫浴60 min。再于95 ℃條件下加熱。終止反應(yīng)后用RNase Free ddH2O將反應(yīng)體系稀釋到200 μl,取5 μl作為PCR反應(yīng)模板。③qPCR：根據(jù)合適條件配置反應(yīng)體系,進(jìn)行qPCR反應(yīng)。以2-ΔΔCt法(Livak法)進(jìn)行定量分析。

1.3 主要觀察指標(biāo)

①體外試驗(yàn)中不同雌激素濃度對(duì)rhBMP-2干預(yù)下乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖的影響及相關(guān)mRNA、蛋白的表達(dá)情況;②體外試驗(yàn)中不同雌激素濃度對(duì)rhBMP-2干預(yù)下乳腺癌MCF-7細(xì)胞遷移、侵襲和細(xì)胞周期的影響。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 不同濃度雌激素對(duì)rhBMP-2作用下MCF-7細(xì)胞增殖能力的影響

MTT試驗(yàn)結(jié)果表明rhBMP-2組、noggin組較對(duì)照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05),提示rhBMP-2、noggin均可抑制MCF-7細(xì)胞增殖見(jiàn)圖1A。在不同濃度雌激素處理組與對(duì)照組的對(duì)比中,我們發(fā)現(xiàn)10-9mol與10-8mol濃度的雌激素對(duì)rhBMP-2干預(yù)后的MCF-7細(xì)胞增殖有抑制作用(P<0.05),10-7mol與10-6mol濃度的雌激素對(duì)rhBMP-2干預(yù)后的MCF-7細(xì)胞增殖有促進(jìn)作用(P<0.05),見(jiàn)圖1B。

圖注：A.rhBMP-2、noggin對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖的影響;B.不同雌激素水平對(duì)rhBMP-2干預(yù)下MCF-7細(xì)胞增殖的影響

2.2 不同濃度雌激素對(duì)rhBMP-2作用下MCF-7細(xì)胞遷移能力的影響

圖注：A.NC組 B.rhBMP-2組 C.noggin組 D.rhBMP-2+noggin組E.統(tǒng)計(jì)分析顯示各組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異

圖注：A.rhBMP-2組 B.rhBMP-2+10-9 mol雌激素組 C.rhBMP-2+10-8 mol雌激素組 D.rhBMP-2+10-7 mol雌激素組E.rhBMP-2+10-6 mol雌激素組 F.統(tǒng)計(jì)分析顯示部分濃度的雌激素水平對(duì)rhBMP-2干預(yù)下的MCF-7細(xì)胞遷移具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

2.3 不同濃度雌激素對(duì)rhBMP-2作用下MCF-7細(xì)胞侵襲能力的影響

Transwell侵襲試驗(yàn)中,rhBMP-2、noggin具有減少M(fèi)CF-7細(xì)胞侵襲的趨勢(shì),但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,見(jiàn)圖4。不同濃度的雌激素對(duì)于rhBMP-2干預(yù)后MCF-7細(xì)胞的侵襲能力有降低趨勢(shì),但均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,見(jiàn)圖5。

圖注：A.對(duì)照組 B.rhBMP-2組 C.noggin組 D.rhBMP-2+noggin組E.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示各組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異

圖注：A.rhBMP-2組 B.rhBMP-2+10-9 mol雌激素組 C.rhBMP-2+10-8 mol雌激素組 D.rhBMP-2+10-7 mol雌激素組E.rhBMP-2+10-6 mol雌激素 F.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示各組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異

2.4 不同濃度雌激素對(duì)rhBMP-2作用下MCF-7細(xì)胞周期的影響

流式分析結(jié)果顯示rhBMP-2可影響乳腺癌MCF-7細(xì)胞的G1期(P<0.05),noggin可影響MCF-7細(xì)胞的S期(P<0.05),兩者共同作用可進(jìn)一步影響MCF-7細(xì)胞的S期(P<0.01),而對(duì)G2期均無(wú)顯著性影響,見(jiàn)圖6。10-9mol雌激素濃度可影響G1期(P<0.05),10-9mol、10-7mol、10-6mol雌激素濃度可影響S期(P<0.05),不同雌激素濃度對(duì)細(xì)胞G2期均無(wú)顯著性影響,見(jiàn)圖7。

圖6 rhBMP-2、noggin對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞周期的影響

圖7 不同濃度梯度的雌激素對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞周期的影響

2.5 不同濃度雌激素對(duì)rhBMP-2作用下MCF-7細(xì)胞周期相關(guān)蛋白轉(zhuǎn)錄情況的影響

2.5.1CDK2轉(zhuǎn)錄 相對(duì)于“MCF-7細(xì)胞+rhBMP-2”組而言,“MCF-7細(xì)胞+rhBMP-2+10-9mol雌激素”組、“MCF-7細(xì)胞+rhBMP-2+10-8mol雌激素”組、“MCF-7細(xì)胞+rhBMP-2+10-6mol雌激素”組基因CDK2轉(zhuǎn)錄水平顯著降低,而“MCF-7細(xì)胞+rhBMP-2+10-7mol雌激素”組則無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,見(jiàn)圖8A。相對(duì)于“MCF-7細(xì)胞”組而言,“MCF-7細(xì)胞+rhBMP-2+noggin”組的CDK2轉(zhuǎn)錄水平明顯降低,而“MCF-7細(xì)胞+ noggin”組、“MCF-7細(xì)胞+rhBMP-2”組CDK2轉(zhuǎn)錄水平并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,見(jiàn)圖8B。

圖8 不同濃度雌激素對(duì)rhBMP-2干預(yù)下MCF-7細(xì)胞CDK2轉(zhuǎn)錄的影響

2.5.2CDK4轉(zhuǎn)錄 相對(duì)于“MCF-7細(xì)胞+rhBMP-2”組而言,“MCF-7細(xì)胞+rhBMP-2+10-7mol雌激素”組基因CDK4轉(zhuǎn)錄水平顯著降低,而其余各組(“MCF-7細(xì)胞+rhBMP-2+10-9mol雌激素”組、“MCF-7細(xì)胞+rhBMP-2+10-8mol雌激素”組、“MCF-7細(xì)胞+rhBMP-2+10-6mol雌激素”組)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,見(jiàn)圖9A。相對(duì)于“MCF-7細(xì)胞”組,“MCF-7細(xì)胞+rhBMP-2”組CDK4轉(zhuǎn)錄水平降低,“MCF-7細(xì)胞+noggin”組、“MCF-7細(xì)胞+rhBMP-2+noggin”組CDK4轉(zhuǎn)錄水平無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,見(jiàn)圖9B。

這種書(shū)桌除了護(hù)眼以外，最大的功效就是能自動(dòng)調(diào)整孩子寫(xiě)作業(yè)的時(shí)間。當(dāng)在手機(jī)軟件上“作業(yè)”那一欄中填上所需要完成的作業(yè)后，機(jī)器便會(huì)自動(dòng)設(shè)置時(shí)間。聽(tīng)到這兒你一定覺(jué)得：“不就是設(shè)置個(gè)時(shí)間嗎，怎么會(huì)成了最大的功效呢？”因?yàn)槿绻麜r(shí)間一到，座椅就會(huì)把你彈到床上。在這期間，它會(huì)給你講一個(gè)個(gè)小故事，休息時(shí)間一到，它會(huì)提醒你繼續(xù)回去寫(xiě)作業(yè)。嘿嘿，怎么樣，很方便吧！

圖9 不同濃度雌激素對(duì)rhBMP-2干預(yù)下MCF-7細(xì)胞CDK4轉(zhuǎn)錄的影響

2.5.3cyclin D1轉(zhuǎn)錄 相對(duì)于“MCF-7細(xì)胞+rhBMP-2”組,“MCF-7細(xì)胞+rhBMP-2+10-9mol雌激素”組和“MCF-7細(xì)胞+rhBMP-2+10-6mol雌激素”組cyclin D1轉(zhuǎn)錄水平降低,另外2組(“MCF-7細(xì)胞+rhBMP-2+10-8mol雌激素”、“MCF-7細(xì)胞+rhBMP-2+10-7mol雌激素”)沒(méi)有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,見(jiàn)圖10A。相對(duì)于“MCF-7細(xì)胞”組,另外3組(“MCF-7細(xì)胞+rhBMP-2”、“MCF-7細(xì)胞+noggin”、“MCF-7細(xì)胞+rhBMP-2+noggin”)cyclin D1轉(zhuǎn)錄水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,見(jiàn)圖10B。

圖10 不同濃度雌激素對(duì)rhBMP-2干預(yù)下MCF-7細(xì)胞cyclin D1轉(zhuǎn)錄的影響

2.5.4cyclin E轉(zhuǎn)錄 相對(duì)于“MCF-7細(xì)胞+rhBMP-2”組,“MCF-7細(xì)胞+rhBMP-2+雌激素10-6mol”組cyclin E轉(zhuǎn)錄水平降低,其他3組(“MCF-7細(xì)胞+rhBMP-2+雌激素10-9mol”、“MCF-7細(xì)胞+rhBMP-2+雌激素10-8mol”、“MCF-7細(xì)胞+rhBMP-2+雌激素10-7mol”)沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,圖11A。相對(duì)于“MCF-7細(xì)胞”組,其他3組(“MCF-7細(xì)胞+rhBMP-2”、“MCF-7細(xì)胞+noggin”、“MCF-7細(xì)胞+rhBMP-2+noggin”)cyclin E轉(zhuǎn)錄水平?jīng)]有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,見(jiàn)圖11B。

圖11 不同濃度雌激素對(duì)rhBMP-2干預(yù)下MCF-7細(xì)胞cyclin E轉(zhuǎn)錄的影響

2.5.5p21轉(zhuǎn)錄 相對(duì)于“MCF-7細(xì)胞+rhBMP-2”組,“MCF-7細(xì)胞+rhBMP-2+雌激素10-9mol”組p21轉(zhuǎn)錄水平降低,其他3組(“MCF-7細(xì)胞+rhBMP-2+雌激素10-8mol”、“MCF-7細(xì)胞+rhBMP-2+雌激素10-7mol”、“MCF-7細(xì)胞+rhBMP-2+雌激素10-6mol”)沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,見(jiàn)圖12A。相對(duì)于“MCF-7細(xì)胞”組,其他3組(“MCF-7細(xì)胞+rhBMP-2”、“MCF-7細(xì)胞+noggin”、“MCF-7細(xì)胞+rhBMP-2+noggin”)p21轉(zhuǎn)錄水平?jīng)]有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,見(jiàn)圖12B。

圖12 不同濃度雌激素對(duì)rhBMP-2干預(yù)下MCF-7細(xì)胞p21轉(zhuǎn)錄的影響

3 討論

2002年美國(guó)FDA率先批準(zhǔn)rhBMP-2的臨床應(yīng)用至今,其誘導(dǎo)骨骼形成及組織修復(fù)的功效已經(jīng)得到國(guó)際上的普遍認(rèn)可,并且在生物組織工程學(xué)領(lǐng)域展現(xiàn)出了廣闊的應(yīng)用前景[2,14-15]。然而,多項(xiàng)體外和在體試驗(yàn)證明腫瘤細(xì)胞中可表達(dá)BMP-2受體,并且發(fā)現(xiàn)rhBMP-2具有促進(jìn)包括乳腺癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤發(fā)生及腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的潛能[6-7]。這就使得rhBMP-2臨床應(yīng)用的安全性問(wèn)題成為學(xué)界關(guān)注的熱點(diǎn)議題[16-17]。

迄今為止,尚缺乏關(guān)于rhBMP-2的臨床應(yīng)用與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)性研究,Ghosh-Choudhury等以乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞系為研究對(duì)象,運(yùn)用體外試驗(yàn)證實(shí)了BMP-2對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞增殖的抑制作用可通過(guò)調(diào)控Rb蛋白的CDK磷酸化過(guò)程而實(shí)現(xiàn)[18]。Katsuno等發(fā)現(xiàn)BMP-2可調(diào)控Smad通路促進(jìn)乳腺癌MDA-231-D細(xì)胞的侵襲能力和骨轉(zhuǎn)移事件的發(fā)生[19]。在此基礎(chǔ)上,Ye等[20]進(jìn)一步推測(cè)rhBMP-2是通過(guò)調(diào)節(jié)多種細(xì)胞周期蛋白表達(dá)及Smad、Wnt信號(hào)通路而抑制乳腺癌細(xì)胞增殖。

在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中,雌激素水平的調(diào)節(jié)發(fā)揮著極其關(guān)鍵的生物學(xué)作用。在MDA-MB-231細(xì)胞中,BMP-2誘導(dǎo)ER剪接變異體(ERα-36)的表達(dá)呈劑量依賴(lài)性,雌二醇可刺激MDA-MB-231細(xì)胞的生長(zhǎng),當(dāng)BMP-2信號(hào)通路被si-BMPR IA和si-BMPR IB沉默時(shí),ERα-36誘導(dǎo)即被解除[21]。袁霞等[22]研究發(fā)現(xiàn)BMP-2可阻滯雌二醇誘導(dǎo)的 MCF-7、T-47D以及ZR-75-1細(xì)胞系生長(zhǎng),提示BMP-2可有效抑制雌激素敏感乳腺癌細(xì)胞的增殖,研究表明BMP-2主要抑制細(xì)胞周期的G1期并與誘導(dǎo)p21蛋白相關(guān)。同時(shí)研究者探究了BMP-2對(duì)非雌激素依賴(lài)的乳腺癌細(xì)胞增殖的作用,發(fā)現(xiàn)BMP-2抑制了MDA-MB-231細(xì)胞增殖,而MDA-MB-468細(xì)胞系的增殖卻未受到抑制[22]。

張麗等證實(shí)rhBMP-2可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖并增強(qiáng)其遷移、侵襲能力,同時(shí)降低凋亡能力,反之noggin可抑制腫瘤增殖、侵襲及遷移能力,并可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡[23]。汪炬等的研究與本團(tuán)隊(duì)先前的研究均支持rhBMP-2對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖具有顯著的抑制作用,且呈濃度依賴(lài)性[9,24]。此外,張麗等發(fā)現(xiàn)BMP-2可以通過(guò)激活PI3K/Akt信號(hào)通路促進(jìn)MCF-7細(xì)胞發(fā)生乳腺癌上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化,從而誘導(dǎo)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移,這也與本團(tuán)隊(duì)先前的研究結(jié)果一致[9,23]。汪炬等[24]研究表明BMP-2可上調(diào)與遷移力正相關(guān)的ID1、Pail等基因表達(dá),并通過(guò)激活BMP信號(hào)途徑,誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生EMT轉(zhuǎn)化,從而促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞遷移及侵襲。李珍等[25]亦提出rhBMP-2可通過(guò)上調(diào)CD44表達(dá)來(lái)增加乳腺癌MCF-7細(xì)胞遷移能力。在本研究中,我們發(fā)現(xiàn)不同濃度的雌激素可影響rhBMP-2干預(yù)后MCF-7細(xì)胞的遷移,但并未發(fā)現(xiàn)rhBMP-2對(duì)MCF-7細(xì)胞的遷移和侵襲顯著的促進(jìn)作用,這可能是由于本研究與先前研究中使用的rhBMP-2濃度與作用時(shí)間不同所致。

BMP能夠調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng),BMP信號(hào)的抑制顯著降低有絲分裂檢查點(diǎn)組分BUB3、Hec1、TTK和MAD2的蛋白質(zhì)水平,導(dǎo)致細(xì)胞分裂和腫瘤發(fā)生,而B(niǎo)MP信號(hào)通路的激活則可對(duì)乳腺癌細(xì)胞產(chǎn)生相反的影響[26]。在BMP-2作用的研究中,發(fā)現(xiàn)BMP-2在體外對(duì)腫瘤細(xì)胞有直接的抗增殖作用[9,27]。另外,有學(xué)者證明BMP-2能增加MCF-7細(xì)胞中PTEN的表達(dá),從而導(dǎo)致增殖減少[28]。PTEN是一種通過(guò)調(diào)節(jié)PI3K/Akt途徑影響增殖的腫瘤抑制因子,PTEN突變者,乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)明顯增加。在BMP-2存在下,PTEN與泛素結(jié)合蛋白的結(jié)合減少,表明BMP-2可能降低PTEN的降解,從而抑制細(xì)胞增殖。本研究中MTT試驗(yàn)結(jié)果提示較低濃度的雌激素對(duì)rhBMP-2干預(yù)后的MCF-7細(xì)胞增殖有抑制作用,而較高濃度的雌激素對(duì)rhBMP-2干預(yù)后的MCF-7細(xì)胞增殖則具有促進(jìn)作用。

多項(xiàng)研究表明BMP-2可在體外和體內(nèi)促進(jìn)MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性和侵襲性[29,30]。BMP-2對(duì)腫瘤微環(huán)境、腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲的影響對(duì)乳腺癌的發(fā)生和進(jìn)展具有重要意義[8]。通過(guò)BMP信號(hào)通路激活刺激成纖維細(xì)胞可促進(jìn)乳腺腫瘤細(xì)胞侵襲并增加炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生[31-32]。在三陰性乳腺癌MDA-MB-468細(xì)胞中,上調(diào)的BMPR IB顯示出BMP-2作用下的細(xì)胞遷移能力增加,BMPR拮抗劑可消除上述現(xiàn)象[33]。BMP-2可能通過(guò)在腫瘤周?chē)|(zhì)中誘導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)糖蛋白Tenascin-W的形成而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移,乳腺癌間質(zhì)中Tenascin-W的過(guò)度表達(dá)通過(guò)與α8整合素的相互作用促進(jìn)癌細(xì)胞的侵襲和遷移[34]。在乳腺癌中,BMP信號(hào)對(duì)干細(xì)胞群的影響尚不明確,并且因?qū)嶒?yàn)條件而異。BMP2/7異二聚體在體外顯著降低乳腺癌干細(xì)胞群的大小,在體內(nèi)能夠抑制骨轉(zhuǎn)移的形成[35]。本實(shí)驗(yàn)中Transwell遷移試驗(yàn)提示不同濃度的雌激素均可促進(jìn)rhBMP-2干預(yù)后MCF-7細(xì)胞的遷移,其中部分濃度具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

在細(xì)胞周期方面,多種BMPs在乳腺癌中具有直接或間接的抗腫瘤增殖作用,但這可能與BMP受體平衡或功能異常有關(guān)。BMP-2可通過(guò)上調(diào)細(xì)胞周期蛋白激酶抑制劑p21抑制雌二醇誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞增殖,進(jìn)而抑制雌二醇誘導(dǎo)的細(xì)胞周期蛋白D1相關(guān)激酶活性[36]。有研究證實(shí)rhBMP-2可通過(guò)Rb和CD44信號(hào)通路誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞EMT和干細(xì)胞凋亡,進(jìn)而促進(jìn)乳腺癌轉(zhuǎn)移[37-38]。BMP-2促進(jìn)MCF10A乳腺細(xì)胞產(chǎn)生管腔祖細(xì)胞,而B(niǎo)MP-4則可阻止分化,表明BMP-2和BMP-4之間的平衡決定了乳腺細(xì)胞的命運(yùn)[39]。有研究提示BMPs可誘導(dǎo)干細(xì)胞靜止,當(dāng)腫瘤抑制因子ΔNp63α在MCF-7細(xì)胞中表達(dá)時(shí),BMP靶基因ID-1上調(diào),增殖顯著減少。祖細(xì)胞樣細(xì)胞比例增加,細(xì)胞處于可逆G0期。因而,研究者認(rèn)為BMP信號(hào)誘導(dǎo)MCF7細(xì)胞靜止是由ΔNp63α介導(dǎo)[40]。我們的研究發(fā)現(xiàn)10-9mol雌激素濃度可影響乳腺癌MCF-7細(xì)胞的G1期,10-9mol、10-7mol、10-6mol雌激素濃度可影響MCF-7細(xì)胞的S期,并且不同濃度的雌激素水平處理下細(xì)胞周期相關(guān)基因CDK2、CDK4、cyclin D1、cyclin E、p21的轉(zhuǎn)錄水平亦發(fā)生相應(yīng)改變。本研究首次通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)不同濃度雌激素對(duì)rhBMP-2干預(yù)乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖、遷移、侵襲以及細(xì)胞周期的影響。

本研究尚存在諸多不足之處：(1)本研究?jī)H以MCF-7細(xì)胞系為研究對(duì)象,乳腺癌分子表型多樣,研究結(jié)論是否適用于其他乳腺癌細(xì)胞亞型尚需進(jìn)一步探索;(2)雌激素于人體內(nèi)存在不同的活性類(lèi)型,不同類(lèi)型雌激素及其組合對(duì)于MCF-7細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及細(xì)胞周期的影響有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)加以論證;(3)本實(shí)驗(yàn)未進(jìn)行細(xì)胞周期蛋白表達(dá)水平的Western blot檢測(cè)及分析,不同濃度梯度的雌激素對(duì)于乳腺癌MCF-7細(xì)胞周期蛋白表達(dá)的影響有待進(jìn)一步深入探討。

綜上所述,不同濃度雌激素對(duì)重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白2干預(yù)乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及細(xì)胞周期存在一定影響。本項(xiàng)研究的意義在于：一方面為rhBMP-2的臨床應(yīng)用并發(fā)癥與安全性提供了一定的理論依據(jù),另一方面則為乳腺癌及乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的預(yù)防和治療靶點(diǎn)的選擇提供了新的思路。我們需要開(kāi)展更為深入的研究來(lái)闡明BMP-2及其相關(guān)通路在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用及不同濃度雌激素對(duì)乳腺癌發(fā)生及疾病進(jìn)展的影響及其作用機(jī)制。