長(zhǎng)春市2016—2020監(jiān)測(cè)年度甲型H1N1流感病毒血凝素(HA)基因特征分析

崔 薇,初 秋,李晨光,龔云偉,趙春艷,孫 宇,隋天卓,孫炳欣*

(1.長(zhǎng)春市疾病預(yù)防控制中心,吉林 長(zhǎng)春130033;2.吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,吉林 長(zhǎng)春130021)

流感病毒是有包膜的負(fù)鏈RNA病毒,其中甲型流感整個(gè)基因組分成8個(gè)節(jié)段,分別編碼PB2,PB1,PA,HA,NP,NA,M,NS等蛋白,每種蛋白在流感病毒感染、增殖、釋放、擴(kuò)散及傳播過程中都行使不同的功能。其中血凝素(HA),它在流感病毒受體識(shí)別和入侵過程中起著重要的作用,同時(shí)能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體[1]。HA還是流感病毒容易發(fā)生變異的抗原,進(jìn)而導(dǎo)致流感逃避宿主的免疫的識(shí)別與清除,從而引起流感的反復(fù)流行,因此對(duì)流感病毒抗原進(jìn)化和疫苗選擇的研究也主要集中在HA重要的氨基酸位點(diǎn)上。

為了解長(zhǎng)春市甲型H1N1血凝素(HA)基因特征,我們對(duì)2016-2020年度甲型H1N1血凝素(HA)變異情況及進(jìn)化特征進(jìn)行了分析,為長(zhǎng)春市甲型H1N1流感防控及預(yù)測(cè)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源

按照《全國(guó)流感監(jiān)測(cè)方案(2017版)》要求,長(zhǎng)春市3家流感監(jiān)測(cè)哨點(diǎn)醫(yī)院對(duì)發(fā)熱3天內(nèi)流感樣病例(體溫≥38℃,伴咳嗽或咽痛之一)進(jìn)行標(biāo)本采集。長(zhǎng)春市CDC流感網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室對(duì)這些流感樣病例標(biāo)本進(jìn)行核酸檢測(cè),并對(duì)其中流感病毒陽性標(biāo)本進(jìn)行病毒分離,獲得流感病毒毒株。本次研究選取長(zhǎng)春市2016-2020年期間共4個(gè)監(jiān)測(cè)年度的流感毒株109株,所有毒株均由長(zhǎng)春CDC流感網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室分離鑒定。

1.2 甲型H1N1流感病毒毒株核酸提取和HA基因擴(kuò)增

用碩世病毒核酸快速提取試劑盒提取流感病毒毒株RNA,將提取到的病毒RNA先反轉(zhuǎn)錄成cDNA,再用設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行血凝素(HA)基因擴(kuò)增,對(duì)PCR產(chǎn)物用毛細(xì)管電泳方法進(jìn)行確認(rèn)。

1.3 甲型H1N1流感病毒血凝素(HA)基因序列測(cè)定及分析

血凝素(HA)基因PCR產(chǎn)物送至上海生工生物工程公司進(jìn)行基因測(cè)序和拼接。拼接后的序列經(jīng)NCBI中的GenBank數(shù)據(jù)庫Blast比對(duì)確認(rèn)為甲型H1N1流感病毒血凝素(HA)基因序列。選取WHO推薦2010-2017年疫苗株A/California/07/2009、2017-2019年北半球疫苗株A/Michigan/45/2015、2019-2020年北半球疫苗株A/Brisbane/02/2018、2020-2021年北半球疫苗株A/Guangdong-Maonan/SWL1536/2019(H1N1)、國(guó)內(nèi)代表株A/Shanghai-Jiading/SWL1970/2015,國(guó)內(nèi)分離的第1株甲型H1N1流感毒株A/Sichuan/1/2009(H1N1)作為參考序列,參考序列均來自GISAID網(wǎng)站。使用MegAlign軟件進(jìn)行HA基因核苷酸和氨基酸序列同源性分析,使用Mega7.0軟件進(jìn)行重要位點(diǎn)氨基酸突變分析。

2 結(jié)果

2.1 流感病毒流行情況及分析

2016年4月至2020年3月,長(zhǎng)春地區(qū)共檢測(cè)流感樣病例樣本7930份,其中流感病毒核酸陽性樣本1061份,陽性率為13.38%。陽性樣本中甲型H1N1流感病毒陽性樣本475份,季節(jié)性H3N2流感病毒陽性樣本356份,乙型流感病毒陽性樣本230份。

從病原上分析,長(zhǎng)春地區(qū)流感病毒在不同年份出現(xiàn)不同的優(yōu)勢(shì)株：2016年4月以甲型H1N1和B型流感病毒共同流行,隨后的5-7月份甲型H1N1淡出,僅有B型流感病毒檢出;2016年8月至9月期間未有流感病毒陽性檢出;2016年10月至11月,僅零星有季節(jié)性H3N2流感病毒檢出。2016年12月至2017年3月期間,呈現(xiàn)季節(jié)性H3N2和甲型H1N1流感病毒共同流行的局面,并且甲型H1N1流感病毒逐漸成為主導(dǎo)的流行亞型;到2017年4月至6月期間,甲型H1N1流感成為唯一的流行株;而在2017年7月至11月期間,主要以季節(jié)性H3N2流行為主,偶爾會(huì)檢出甲型H1N1流感病毒。到了2017年12月至2月期間,又出現(xiàn)B型、季節(jié)性H3N2和甲型H1N1共同流行的局面,2018年3月到5月季節(jié)性H3N2流感病毒零檢出,出現(xiàn)甲型H1N1和B型流感病毒共同流行的局面;2018年6月至11月未有流感病毒陽性檢出。2018年12月至2019年1月主要以甲型H1N1流感流行為主,偶爾會(huì)檢出B型流感病毒。到2019年2月至4月期間,又出現(xiàn)B型、季節(jié)性H3N2和甲型H1N1共同流行的局面,并且B型流感病毒逐漸成為主導(dǎo)的流感亞型,至2019年5月,僅有B型流感病毒陽性檢出;2019年6月至9月未有流感病毒陽性檢出;2019年10月至12月,主要以季節(jié)性H3N2為流行優(yōu)勢(shì)株,偶爾有甲型H1N1檢出。而至2020年1月至3月,則為季節(jié)性H3N2和甲型H1N1共同流行,偶爾有B型流感病毒檢出,見圖1。

圖1 2016—2020監(jiān)測(cè)年度長(zhǎng)春市流感病毒各亞型流行情況

在此期間,每年都有甲型H1N1流感病毒檢出,特別是2017年1月至2017年6月,2018年12月至2019年2月,2020年1月至2020年2月這三個(gè)時(shí)間范圍,甲型H1N1流感陽性樣本分別占同時(shí)間范圍陽性總數(shù)的70.27%(156/222),96.80%(212/219)和47.57%(49/103),甲型H1N1流感為流感流行的優(yōu)勢(shì)株。

2.2 HA基因進(jìn)化分析

甲型H1N1流感病毒HA基因系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示,長(zhǎng)春地區(qū)2016—2020年4個(gè)監(jiān)測(cè)年度甲型H1N1流行株的HA基因,均屬于6B.1大分支,與疫苗株A/California/7/2009相比,其HA蛋白存在S84N、S162N和I216T共同的變異位點(diǎn)。甲型H1N1流感病毒毒株HA基因之間核苷酸同源性在96.9%～100%之間,氨基酸同源性在97.2%～100%之間。

其中2016—2017 年甲型H1N1流行株,與疫苗株A/California/7/2009相比,HA蛋白有P83S、S84N、D97N、S162N、K163Q、S185T、S203T、I216T、A256T、K283E、E374K、S451N、E499K共同的位點(diǎn)突變,與同一時(shí)期推薦的疫苗株A/California/7/2009 核苷酸同源性在97.0%～97.4%之間,氨基酸同源性在96.8% ～97.5%之間。

2017—2018 年甲型H1N1流行株繼續(xù)進(jìn)化,HA基因?qū)儆?B.1A分支,HA蛋白新增 S74R、S164T、I295V 變異,與同一時(shí)期推薦的疫苗株A/Michigan/45/2015 核苷酸同源性在98.1%～98.5%之間,氨基酸同源性在98.1%～98.9%之間。其中一部分流行株HA蛋白還出現(xiàn)S183P、T256I氨基酸位點(diǎn)突變,屬于6B.1A1分支。另一部分流行株未出現(xiàn)S183P氨基酸位點(diǎn)突變,但出現(xiàn)A256T氨基酸位點(diǎn)突變。

2018—2019年甲型H1N1流感病毒繼續(xù)進(jìn)化,一部分流行株HA蛋白出現(xiàn)N260D位點(diǎn)突變,屬于6B.1A5分支;另一部分流行株 HA蛋白未出現(xiàn)N260D位點(diǎn)突變,又分別分化為6B.1A2分支、6B.1A4分支、6A.1A6分支和6A.1A7分支。分別有L233I氨基酸位點(diǎn)突變(6B.1A2分支),A141E共同氨基酸位點(diǎn)突變(6B.1A4分支),T120A共同氨基酸位點(diǎn)突變(6A.1A6分支)和K302T、I404M、N496S、E506D共同氨基酸位點(diǎn)突變(6A.1A7分支),與同期疫苗株A/Michigan/45/2015的核苷酸同源性在97.5%～98.3%之間,氨基酸同源性為97.7%～98.9%。

2019—2020年甲型H1N1流行株是由上一年度6B.1A5分支的流行株進(jìn)化而來,其HA 蛋白新出現(xiàn)D187A、Q189E位點(diǎn)突變,進(jìn)化為6B.1A5A1分支,與同期推薦的疫苗株A/Brisbane/02/2018 的核苷酸同源性在98.4%～98.8%之間,氨基酸同源性為97.9%～98.5%。與2020—2021年推薦的疫苗株 A/Guangdong-Maonan/SWL1536/ 2019的核苷酸同源性在99.5%～99.9%之間,氨基酸同源性為99.4%～100%,見圖2。

圖2 2016-2020年度長(zhǎng)春市甲型H1N1流感病毒HA基因系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.3 HA蛋白分子特征分析

2.3.1HA抗原決定簇位點(diǎn)分析 2016—2017監(jiān)測(cè)年度的甲型H1N1流感病毒毒株與同期推薦的疫苗株A/California/07/2009相比,在HA蛋白抗原決定簇上都發(fā)生S162N和K163Q位點(diǎn)的共同突變,均位于HA蛋白抗原決定簇的Sa區(qū);S185T的共同突變,位于HA蛋白抗原決定簇的Sb區(qū);S203T位于HA蛋白抗原決定簇Ca區(qū)。除此之外,HA蛋白抗原決定簇還存在一些散在的突變位點(diǎn),本研究中1株毒株出現(xiàn)S71F氨基酸位點(diǎn)突變,1株毒株出現(xiàn)S74R氨基酸位點(diǎn)突變,均位于HA蛋白抗原決定簇Cb區(qū);1株毒株出現(xiàn)K160T氨基酸位點(diǎn)突變,位于HA蛋白抗原決定簇Sa區(qū);1株毒株還出現(xiàn)K169R、S190R氨基酸位點(diǎn)突變,分別位于HA蛋白抗原決定簇Ca區(qū)和Sb區(qū)。

2017—2019監(jiān)測(cè)年度的甲型H1N1流感病毒毒株與同期推薦的疫苗株A/Michigan/45/2015相比,在HA蛋白抗原決定簇上都發(fā)生S74R和S164T的共同突變,分別位于HA蛋白抗原決定簇的Cb區(qū)和Sa區(qū)。除此之外,與同期推薦的疫苗株A/Michigan/45/2015相比,HA蛋白抗原決定簇還存在一些散在的突變位點(diǎn)。本研究中的1株毒株出現(xiàn)A73S氨基酸位點(diǎn)突變,位于HA蛋白抗原決定簇Cb區(qū);3株毒株出現(xiàn)H138Y氨基酸位點(diǎn)突變,1株毒株出現(xiàn)G140R氨基酸位點(diǎn)突變,2株毒株出現(xiàn)A141E氨基酸位點(diǎn)突變,1株毒株出現(xiàn)A141T氨基酸位點(diǎn)突變,均位于HA蛋白抗原決定簇Ca區(qū);5株毒株出現(xiàn)L161I氨基酸位點(diǎn)突變,位于HA蛋白抗原決定簇Sa區(qū);5株毒株還出現(xiàn)T185I氨基酸位點(diǎn)突變,2株毒株還出現(xiàn)S190I氨基酸位點(diǎn)突變,均位于HA蛋白抗原決定簇Sb區(qū);1株毒株出現(xiàn)I166F和S190I氨基酸位點(diǎn)突變,分別位于HA蛋白抗原決定簇Ca區(qū)和Sb區(qū);1株毒株還出現(xiàn)T185I和E235D氨基酸位點(diǎn)突變,分別位于HA蛋白抗原決定簇Sb區(qū)和Ca區(qū)。

2019—2020監(jiān)測(cè)年度的甲型H1N1流感病毒毒株與同期推薦的疫苗株A/Brisbane/02/2018 相比,在HA蛋白抗原決定簇上都發(fā)生T185I、D187A和Q189E的共同突變,均位于HA蛋白抗原決定簇的Sb區(qū)。

2.3.2受體結(jié)合位點(diǎn)分析 甲型H1N1流感病毒位于HA蛋白頭部的受體結(jié)合位點(diǎn)由190螺旋(187～195：187-DQQSLYQNA-195位)、220環(huán)(218～225：218-PKVRDQEG-225位)和130環(huán)(132～135：132-VTAA-135位) 3個(gè)結(jié)構(gòu)域以及口袋底部的Y91、W150、H180和Y192構(gòu)成。通過軟件與A/California/07/2009對(duì)比,發(fā)現(xiàn)2019年12月以后分離到的毒株HA基因所編碼的氨基酸出現(xiàn)D187A、Q189E位點(diǎn)共同突變,均位于HA蛋白受體結(jié)合位點(diǎn)190螺旋上。

2.3.3糖基化位點(diǎn)分析 甲型H1N1流感病毒HA蛋白分子原有的糖基化位點(diǎn)有8個(gè),分別是第10、11、23、87、276、287、481和540位。2016-2017監(jiān)測(cè)年度的甲型H1N1流感病毒毒株與同期推薦的疫苗株A/California/07/2009相比,HA蛋白162位糖基化位點(diǎn)為162NQS。另外,1株毒株HA蛋白出現(xiàn)T278I位點(diǎn)突變,導(dǎo)致276位糖基化位點(diǎn)缺失。

2017—2019監(jiān)測(cè)年度的甲型H1N1流感病毒毒株與同期推薦的疫苗株A/Michigan/45/2015相比,甲型H1N1流感毒株HA蛋白的第162位糖基化位點(diǎn)由NQS變異成NQT,雖未影響糖基化位點(diǎn)的增減,但是否有功能方面的意義還有待進(jìn)一步研究。另外,1株毒株 HA蛋白出現(xiàn)T278A位點(diǎn)突變,導(dǎo)致276位糖基化位點(diǎn)缺失;1株毒株 HA蛋白出現(xiàn)G482E位點(diǎn)突變,但未影響糖基化位點(diǎn)的增減。

而2019—2020監(jiān)測(cè)年度的甲型H1N1流感病毒毒株與同期推薦的疫苗株A/Brisbane/02/2018 相比,HA蛋白162位糖基化位點(diǎn)均為162NQT。另外,1株毒株HA蛋白出現(xiàn)G482E位點(diǎn)突變,但未影響糖基化位點(diǎn)的增減。

2.3.4致病性位點(diǎn)分析 2016—2020年4個(gè)監(jiān)測(cè)年度甲型H1N1流感病毒HA蛋白裂解位點(diǎn)氨基酸序列為I(V)PSI(V)QSR↓GLFGAIA,只含有一個(gè)堿性氨基酸為精氨酸R,未出現(xiàn)多個(gè)堿性氨基酸(R、K、H)。

另外,甲型H1N1流感病毒的HA1蛋白第222位氨基酸位點(diǎn)突變也被證實(shí)與病毒致病性密切相關(guān)。HA1第222位為D時(shí),病毒主要識(shí)別人上呼吸道α-2,6-半乳糖唾液酸受體,HA1蛋白第222位一旦出現(xiàn)D222E、D222N或D222G突變,病毒就會(huì)更容易與下呼吸道α-2,3-半乳糖唾液酸受體結(jié)合,增加感染人下呼吸道的可能,從而使患者出現(xiàn)肺炎等嚴(yán)重的下呼吸道癥狀。經(jīng)分析,發(fā)現(xiàn)2018年1株樣本來源為長(zhǎng)春市中心醫(yī)院的甲型H1N1流感病毒分離株A/Jilin-Nanguan/SWL1204/2018(H1),其HA蛋白出現(xiàn)D222N的突變,我們后續(xù)還對(duì)此毒株進(jìn)行了全基因組序列分析。

3 討論

一般認(rèn)為,甲型H1N1流感病毒的HA蛋白內(nèi)部有4個(gè)抗原決定簇[2],分別是(不計(jì)信號(hào)肽)：Sa(124、153～157、159～164)、Sb(184～195)、Ca(137～142、166～170、203、221、235) 以及 Cb(70～75),這44個(gè)氨基酸是甲型H1N1流感病毒與宿主細(xì)胞受體相互作用的重要位點(diǎn),因此突變可能使病毒具有免疫逃逸的能力,從而引起流行。以上位點(diǎn)若出現(xiàn)4個(gè)以上氨基酸位點(diǎn)突變,且突變涉及到2個(gè)及以上抗原決定簇位點(diǎn);或一個(gè)涉及到抗原決定簇,另一個(gè)涉及到受體結(jié)合位點(diǎn),就可以認(rèn)為是具有流行病學(xué)意義的抗原變異株[3-4]。對(duì)長(zhǎng)春地區(qū)2016—2020年4個(gè)監(jiān)測(cè)年度甲型H1N1流行株的HA蛋白抗原決定簇分析,發(fā)現(xiàn)2016—2017年流行株相對(duì)于同期推薦的疫苗株A/California/07/2009,有4個(gè)共同突變涉及到了3個(gè)不同的抗原決定簇區(qū)域,因此提示2016—2017監(jiān)測(cè)年度的甲型H1N1流感流行株與同期的疫苗株匹配度不理想,一定程度上也說明需要更換當(dāng)時(shí)的疫苗組分,根據(jù)流行株的情況重新篩選甲型H1N1疫苗株,使疫苗株更好地匹配流行株,以保證流感疫苗對(duì)接種者的保護(hù)作用,從而預(yù)防甲型H1N1流感病毒大流行。

血凝素HA蛋白識(shí)別并結(jié)合宿主細(xì)胞表面的受體是流感病毒感染的關(guān)鍵步驟[12]。甲型H1N1流感病毒HA蛋白受體結(jié)合位點(diǎn)上關(guān)鍵氨基酸的變異可能會(huì)改變其受體結(jié)合的特異性,從而會(huì)影響流感病毒的傳播。分析發(fā)現(xiàn)2019年12月以后分離到的毒株HA基因所編碼的氨基酸出現(xiàn)D187A、Q189E位點(diǎn)共同突變,均位于HA蛋白受體結(jié)合位點(diǎn)190螺旋上,這很可能就會(huì)改變甲型H1N1流感病毒受體結(jié)合的特異性,從而會(huì)影響流感病毒在宿主間的傳播。

糖基化所形成的寡糖側(cè)鏈會(huì)影響蛋白質(zhì)的折疊,結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性和生物活性。因此糖基化位點(diǎn)的改變或數(shù)目的增減會(huì)影響病毒的穩(wěn)定性、傳染性和致病性。通過軟件與早期疫苗株A/California/07/2009對(duì)比,發(fā)現(xiàn)2016—2020年長(zhǎng)春地區(qū)甲型H1N1流感病毒HA基因所編碼的氨基酸新增了一個(gè)162位糖基化位點(diǎn)。

除此之外,其它因素也會(huì)影響甲型H1N1流感病毒的致病性。流感病毒HA的前體是未成熟的HA0,只有HA0被水解成由二硫鍵連接的HA1和HA2兩個(gè)亞基后才可以感染宿主細(xì)胞。許多研究發(fā)現(xiàn),HA蛋白中HA1和HA2裂解位點(diǎn)的堿性氨基酸的數(shù)量會(huì)影響HA蛋白對(duì)宿主蛋白酶的敏感性,從而影響流感病毒的致病性[5-6]。流感病毒HA裂解位點(diǎn)氨基酸序列中如果含有多個(gè)堿性氨基酸,則表現(xiàn)為高致病性,比如高致病性禽流感H5N1、H7N9等;如果只含有一個(gè)堿性氨基酸位點(diǎn)則表現(xiàn)為低致病性。經(jīng)分析,發(fā)現(xiàn)2016—2020年4個(gè)監(jiān)測(cè)年度甲型H1N1流感病毒HA蛋白裂解位點(diǎn)氨基酸序列只含有一個(gè)堿性氨基酸為精氨酸R,未出現(xiàn)多個(gè)堿性氨基酸。另外,HA1蛋白第222位出現(xiàn)D222E、D222N或D222G突變,會(huì)引起患者下呼吸道癥狀,已經(jīng)在國(guó)際上引起共識(shí)[7-11]。經(jīng)分析,發(fā)現(xiàn)2018年1株樣本來源為長(zhǎng)春市中心醫(yī)院的甲型H1N1流感病毒分離株,其HA蛋白出現(xiàn)D222N的突變,提示此毒株可引起患者嚴(yán)重的下呼吸道癥狀。

目前,流感病毒和新冠病毒仍是引起全球大流行的重要呼吸道病原。隨著北半球流感季的到來,未來可能會(huì)出現(xiàn)流感病毒和新冠病毒疊加流行的風(fēng)險(xiǎn)。我們?cè)诰韬捅O(jiān)測(cè)新冠病毒持續(xù)變異的同時(shí),還應(yīng)繼續(xù)加強(qiáng)對(duì)流感病毒的抗原性、致病性、耐藥性等方面的監(jiān)測(cè),防止由于流感病毒的變異和重組,引起新冠和流感合并感染,從而加大患者出現(xiàn)重癥和死亡的風(fēng)險(xiǎn)。