消光系數(shù)法與二喹啉甲酸法測定多肽濃度精密度的比較*

張璐瑤, 朱 偉, 李瑛傑, 張博燃, 曾 凱, 魏 蔚, 馬凈植, 楊 焰△

1華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院口腔醫(yī)學(xué)中心,武漢 430030 2四川省綿陽市中醫(yī)醫(yī)院口腔科,綿陽 621053 3武漢市中醫(yī)醫(yī)院口腔科,武漢 430010 4華中科技大學(xué)協(xié)和深圳醫(yī)院口腔科,深圳 518052 5湖南中醫(yī)藥大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院(長沙市口腔醫(yī)院),長沙 410023

少于50個(gè)氨基酸組成的相對(duì)分子質(zhì)量低于10000的分子被稱為多肽,它們是通過肽鍵連接且缺少穩(wěn)定3D結(jié)構(gòu)的短氨基酸鏈[1]。多肽參與了許多細(xì)胞過程的調(diào)節(jié),如氧化還原穩(wěn)態(tài)、激素調(diào)節(jié)、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、神經(jīng)元信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、免疫反應(yīng)和生長,也可以模擬蛋白質(zhì)的生物活性而發(fā)揮相應(yīng)功能[2]。在對(duì)多肽研究過程中,研究者們發(fā)現(xiàn)多肽溶液極易吸附于玻璃和塑料容器中造成濃度損耗[3],因此,快速、簡便、可靠地測定濃度低、樣本量小的樣品中多肽的含量具有重要意義[4]。

隨著蛋白質(zhì)組學(xué)的不斷發(fā)展,出現(xiàn)了許多測定蛋白質(zhì)濃度的方法,這些方法用于多肽濃度的測定時(shí)表現(xiàn)出各自的優(yōu)勢與不足。消光系數(shù)法利用色氨酸與酪氨酸在波長280 nm處的吸光度來計(jì)算多肽濃度值。比色測定法如BCA法也常被用來測定多肽濃度[5],該法應(yīng)用BSA作為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算多肽濃度時(shí),由于BSA屬于大分子蛋白,在分子長度、分子量等方面與多肽存在較大差異,因此計(jì)算得到的多肽濃度值可能會(huì)與實(shí)際濃度值出現(xiàn)偏差。為了探討B(tài)CA法標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)濃度計(jì)算值的影響,課題組提出改進(jìn)二喹啉甲酸法(BCA)法,擬將多肽代替BSA作為標(biāo)準(zhǔn)品來繪制個(gè)性化的標(biāo)準(zhǔn)曲線,由此計(jì)算濃度值可能更加準(zhǔn)確?？紤]到消光系數(shù)法要求檢測的多肽必須含有色氨酸或酪氨酸,因此課題組選取長度相同、結(jié)構(gòu)相似、含有色氨酸或酪氨酸的3條固相合成環(huán)肽(CYE、CLP、CHY)作為研究對(duì)象,最終比較消光系數(shù)法與不同標(biāo)準(zhǔn)曲線的BCA法測定多肽濃度結(jié)果與理論值之間的差異,以期為快速而簡便地測定多肽濃度提供方法參考。

1 材料和方法

1.1 環(huán)肽的固相合成

委托生工生物工程上海股份有限公司合成環(huán)肽CYE(NH2-CYENLRSTC-COOH,C1-C9二硫鍵成環(huán))、CLP(NH2-CLPLWYPSC-COOH,C1-C9二硫鍵成環(huán))及CHY(NH2-CHYPTYSKC-COOH,C1-C9二硫鍵成環(huán)),并鑒定分子量與純度。

1.2 BSA與多肽溶液的制備

按照說明書將BCA法蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒(BCA Protein Assay Kit,C503021)中的牛血清白蛋白(BSA,生工生物工程上海股份有限公司,中國)梯度稀釋為0、25、50、100、200、300、400、500 μg/mL。將多肽凍干粉(生工生物工程上海股份有限公司,中國)溶解為1 mg/mL的溶液,同樣梯度稀釋為0、25、50、100、200、300、400、500 μg/mL。

1.3 消光系數(shù)法計(jì)算濃度

清潔并校準(zhǔn)微量紫外分光光度計(jì)(ND-1000,Thermo,美國)。按濃度梯度吸取2 μL不同濃度的BSA、CYE、CLP及CHY溶液分別測定吸光度值(A280nm),設(shè)置6組重復(fù)樣本。利用色氨酸殘基(W)和酪氨酸殘基(Y)的消光系數(shù)計(jì)算各濃度梯度下的BSA、CYE、CLP及CHY溶液濃度。計(jì)算公式如下所示:肽濃度(mg/mL)=(A280nm×DF×MW)/e。其中,A280nm為波長280 nm下溶液的吸光度,DF(dilution factor)為稀釋系數(shù),MW(molecular weight)為肽的分子量,e為W和Y殘基的摩爾消光系數(shù)之和(色氨酸消光系數(shù)為5560 [mL/(mg·cm)],酪氨酸消光系數(shù)為1200 [mL/(mg·cm)]。

1.4 BCA法與個(gè)性化標(biāo)準(zhǔn)曲線的BCA法計(jì)算濃度

1.4.1 工作液的配制 將BCA法蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒中的A液與B液混勻(50∶1),制成BCA工作液。

1.4.2 BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算濃度 在96孔酶標(biāo)板上各孔分別加入20 μL各梯度濃度的BSA、CYE、CLP及CHY,每個(gè)濃度設(shè)置6個(gè)重復(fù)樣本。隨后在各樣本孔中依次加入200 μL的BCA工作液,迅速混勻。在37°C中保溫30 min后,將測試液冷卻至室溫,在酶標(biāo)儀(Synergy HTX,Biotech,美國)上測各孔在波長562 nm處的讀數(shù),記為A562nm。按照濃度梯度的順序,以BSA各孔A562nm讀數(shù)的平均值為縱坐標(biāo),對(duì)應(yīng)的濃度為橫坐標(biāo),在Microsoft Excel軟件中繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程式。將CYE、CLP及CHY各孔A562nm讀數(shù)代入BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線方程式,求濃度計(jì)算值。

1.4.3 個(gè)性化標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算濃度 按照濃度梯度的順序,縱坐標(biāo)分別為CYE、CLP及CHY各孔A562nm讀數(shù)的平均值,橫坐標(biāo)為對(duì)應(yīng)的濃度,在Microsoft Excel軟件中繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到3條個(gè)性化標(biāo)準(zhǔn)曲線方程式。將各孔A562nm讀數(shù)代入個(gè)性化標(biāo)準(zhǔn)曲線,求濃度計(jì)算值。

1.4.4 BSA、CYE、CLP與CHY標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算自身濃度 方法同上,按照濃度梯度的順序,縱坐標(biāo)為BSA 3個(gè)重復(fù)樣本A562nm讀數(shù)的平均值,橫坐標(biāo)為對(duì)應(yīng)的濃度,在Microsoft Excel軟件中繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程式。將BSA其余3個(gè)重復(fù)樣本A562nm讀數(shù)代入BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線,求濃度計(jì)算值。同法,以多肽溶液的3個(gè)重復(fù)樣本A562nm讀數(shù)的平均值為縱坐標(biāo),對(duì)應(yīng)的濃度為橫坐標(biāo),在Microsoft Excel軟件中繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到多肽個(gè)性化標(biāo)準(zhǔn)曲線方程式。將設(shè)置的多肽溶液3個(gè)重復(fù)樣本A562nm讀數(shù)代入自身標(biāo)準(zhǔn)曲線,求濃度計(jì)算值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 CYE、CLP及CHY的性質(zhì)

表1、表2展示多肽的成分、組成與性質(zhì)。對(duì)氨基酸進(jìn)行分析,通過計(jì)算疏水分?jǐn)?shù),CYE表現(xiàn)出較好的水溶性,而CLP與CHY水溶性較差。

表1 多肽的高效液相色譜法(HPLC)與質(zhì)譜法(MS)鑒定結(jié)果Table 1 Identification of polypeptides by High performance liquid chromatography and Mass spectrometry

表2 CYE、CLP及CHY的氨基酸組成Table 2 Amino acid composition of CYE,CLP and CHY

2.2 三種方法測定濃度結(jié)果的比較

2.2.1 消光系數(shù)法 利用微量紫外分光光度計(jì)測定BSA、CYE、CLP及CHY溶液在波長280 nm處的吸光度值,利用色氨酸殘基(W)和酪氨酸殘基(Y)的消光系數(shù)計(jì)算濃度。將濃度計(jì)算結(jié)果與理論值繪制趨勢線進(jìn)行比較(圖1),實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:BSA、CYE、CLP以及CHY通過消光系數(shù)法計(jì)算的濃度計(jì)算值與理論值之間無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P>0.05)。R2均大于0.99,線性關(guān)系良好。計(jì)算值與理論值相對(duì)偏差為1.475%～5.125%,屬于相對(duì)偏差允許值范圍[7]。

圖1 BSA、CYE、CLP以及CHY消光系數(shù)法濃度計(jì)算值與濃度理論值比較Fig.1 Comparison of calculated and theoretical concentration values of BSA,CYE,CLP and CHY solution calculated by extinction coefficient method

2.2.2 BCA法與個(gè)性化標(biāo)準(zhǔn)曲線的BCA法 根據(jù)BCA法(標(biāo)準(zhǔn)品:BSA)與個(gè)性化標(biāo)準(zhǔn)曲線的BCA法(標(biāo)準(zhǔn)品:CYE、CLP、CHY)的4條標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的4個(gè)標(biāo)準(zhǔn)方程式,分別計(jì)算出BSA與多肽濃度(圖2、表3)。標(biāo)準(zhǔn)曲線R2均大于0.99,線性關(guān)系良好。4條標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率由大到小依次為CHY>CLP>CYE>BSA(均P<0.05),與形成的紫色絡(luò)合物顏色深淺相一致。

將各組濃度計(jì)算值與理論值相比較,如圖3所示,在BCA法中,使用BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到的多肽濃度計(jì)算值大于理論值,而使用CYE、CLP與CHY的個(gè)性化標(biāo)準(zhǔn)曲線分別計(jì)算BSA的濃度值,其計(jì)算結(jié)果均小于理論值(均P<0.05);使用CYE標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算CLP與CHY的濃度,二者計(jì)算值均大于理論值(均P<0.05);使用CLP標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算CYE與CHY的濃度,CYE濃度計(jì)算值小于理論值(P<0.05),而CHY濃度計(jì)算值大于理論值(P<0.05);使用CHY標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算CYE與CLP濃度,二者計(jì)算值均小于理論值(均P<0.05)。比較不同標(biāo)準(zhǔn)曲線下的濃度計(jì)算值與理論值之間的差值的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,結(jié)果表明,個(gè)性化標(biāo)準(zhǔn)曲線的BCA法的濃度計(jì)算值比BCA法的濃度計(jì)算值更接近理論值(P<0.05)。計(jì)算值與理論值相對(duì)偏差為43.36%～385.10%,超出相對(duì)偏差允許值范圍[7]。

圖2 BSA、CYE、CLP與CHY的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 The standard curves of BSA,CYE,CLP and CHY solution

表3 BSA、CYE、CLP與CHY的標(biāo)準(zhǔn)曲線公式及R2值Table 3 Standard curve formulas and R2 values of BSA,CYE,CLP and CHY solution

圖3 不同標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算同一蛋白或多肽的濃度計(jì)算值與理論值的比較Fig.3 Comparison of calculated and theoretical concentration values of the same protein or polypeptide calculated by different standard curve formulas

2.2.3 BSA、CYE、CLP與CHY標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算自身濃度 分別用BSA、CYE、CLP與CHY標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算自身濃度,其標(biāo)準(zhǔn)方程及R2如表4所示。計(jì)算結(jié)果表明BSA、CYE、CLP以及CHY通過自身標(biāo)定計(jì)算的濃度計(jì)算值均與理論值無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P>0.05)(圖4)。R2均大于0.99,線性關(guān)系良好。計(jì)算值與理論值相對(duì)偏差為0.3718%～12.83%,屬于相對(duì)偏差允許值范圍[7]。

表4 自身個(gè)性化標(biāo)準(zhǔn)曲線的BCA法標(biāo)準(zhǔn)曲線公式及R2值Table 4 Self-individualized standard curve formulas and R2 values of BCA method

圖4 BSA、CYE、CLP以及CHY自身個(gè)性化標(biāo)準(zhǔn)曲線的BCA法計(jì)算值與濃度理論值比較Fig.4 Comparison of calculated and theoretical concentration values of BSA,CYE,CLP and CHY solution calculated by self-individualized standard curve formulas through BCA method

2.3 變異系數(shù)的計(jì)算

對(duì)不同方法下計(jì)算的濃度值進(jìn)行變異系數(shù)(CV)的計(jì)算。由表5可知,不同方法下吸光度值變異系數(shù)均小于10%,表明測試方法的精密度均較好,可以用于測定多肽濃度。

表5 A280nm與A562nm測量值變異系數(shù)Table 5 Coefficient of variation for A280nm and A562nm

3 討論

在一個(gè)多肽研究實(shí)驗(yàn)過程中可能需要對(duì)多肽連續(xù)取樣測定濃度,同時(shí),為了更好地利用多肽的低濃度效應(yīng)、避免容器壁吸附對(duì)濃度的影響,簡單快捷地測定多肽濃度十分必要。隨著蛋白質(zhì)/多肽組學(xué)的發(fā)展,濃度測定主要分以下幾類:①依賴蛋白質(zhì)固有的紫外光吸收能力的方法;②利用蛋白質(zhì)結(jié)合染料進(jìn)行比色或熒光檢測的方法;③被還原的銅離子與顯色劑形成絡(luò)合物進(jìn)行比色檢測的方法;④熒光測定法;⑤免疫檢測法。每一種檢測方法各有優(yōu)劣,目前實(shí)驗(yàn)室最常用的還是消光系數(shù)法和比色測定法[8]。

紫外吸收法中以吸收波長為280 nm的消光系數(shù)法最為常見,方法簡單,適用于低濃度或低體積的多肽溶液[9],其原理是使用分光光度計(jì)測定芳香族氨基酸如色氨酸、酪氨酸等在波長280 nm處產(chǎn)生的吸光度,按照公式計(jì)算出相應(yīng)濃度值。BCA法原理是在堿性條件下蛋白將Cu2+還原為Cu+,Cu+與BCA試劑形成紫色絡(luò)合物。其中,發(fā)揮主要功能的是半胱氨酸、胱氨酸、色氨酸和酪氨酸殘基。測定溶液在波長562 nm處的吸光度值,將其帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線即可計(jì)算待測蛋白的濃度[10-12]。BCA法與Lowry法[13]和Bradford法[14]比色測定方法原理相似,但大量研究表明BCA法在線性范圍和敏感度方面均高于Lowry法與Bradford法[11-12,15]。因此,本次實(shí)驗(yàn)選擇消光系數(shù)法與BCA法進(jìn)行多肽濃度測定的研究。

BCA法以大分子蛋白BSA作為標(biāo)準(zhǔn)品,在繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算濃度值時(shí),結(jié)果的準(zhǔn)確性可能存在一定偏差。因此,我們對(duì)BCA法進(jìn)行改進(jìn),以長度相同、分子量相近的3條環(huán)肽CYE、CLP、CHY替代BSA作為標(biāo)準(zhǔn)品繪制個(gè)性化標(biāo)準(zhǔn)曲線來計(jì)算濃度值。本次實(shí)驗(yàn)選擇了消光系數(shù)法、BCA法與個(gè)性化標(biāo)準(zhǔn)曲線的BCA法分別測定大分子蛋白BSA與小分子多肽CYE、CLP、CHY的濃度。本研究結(jié)果顯示消光系數(shù)法計(jì)算值與理論值之間無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P>0.05),計(jì)算結(jié)果準(zhǔn)確度較高,但只適用于含有色氨酸或酪氨酸的多肽。

在BCA法中,使用BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到的多肽濃度計(jì)算值均大于理論值(均P<0.05);在個(gè)性化標(biāo)準(zhǔn)曲線的BCA法中,使用CYE、CLP與CHY的個(gè)性化標(biāo)準(zhǔn)曲線分別計(jì)算BSA的濃度值時(shí),其計(jì)算結(jié)果均小于理論值(均P<0.05)。這可能與BSA分子量大、氨基酸數(shù)目多有一定的關(guān)系。在BCA法的顯色原理中,半胱氨酸、胱氨酸、酪氨酸和色氨酸殘基發(fā)揮主要作用[10-12]。在等量的BSA與多肽測試溶液中,分子量大的BSA反而總質(zhì)量變小,顯色氨基酸數(shù)目少于多肽,以BSA為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí),則高估小分子多肽的濃度。使用CYE標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算CLP與CHY的濃度,二者計(jì)算值均大于理論值(均P<0.05)。CYE、CLP與CHY均具有兩個(gè)半胱氨酸。但是,在CYE序列中只含有一個(gè)芳香族氨基酸,即酪氨酸,而CLP與CHY序列中均含有兩個(gè)芳香族氨基酸,所以在還原銅離子的強(qiáng)度上,CYE表現(xiàn)出較弱的能力。同時(shí),CYE疏水程度弱于CLP與CHY,這種多肽的親水性差異可能也會(huì)導(dǎo)致結(jié)果的偏差[9]。因此,使用CYE標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算CLP與CHY的濃度時(shí),二者計(jì)算值均大于理論值。使用CLP標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算CHY的濃度,CHY濃度計(jì)算值大于理論值(P<0.05);使用CHY標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算CLP濃度,CLP濃度計(jì)算值小于理論值(P<0.05)。CLP與CHY的芳香族氨基酸個(gè)數(shù)與疏水性相似,這種濃度差異可能是由CHY序列中存在賴氨酸,也就是在堿性的實(shí)驗(yàn)條件下,賴氨酸能與銅離子發(fā)生反應(yīng)所致[16]。

回顧近年來BCA法等進(jìn)行蛋白定量的研究文獻(xiàn),大多關(guān)注的是大分子蛋白測試速度、回收率與變異系數(shù)等定性指標(biāo),并無明確小分子多肽定量測試的比較研究[17-19]。本研究發(fā)現(xiàn)消光系數(shù)法對(duì)含有色氨酸與酪氨酸的多肽的濃度測定具有準(zhǔn)確性較高的優(yōu)勢,但不能用于不含有色氨酸與酪氨酸殘基的多肽,并且該方法操作比較耗時(shí),技術(shù)敏感性要求高。BCA法具有操作簡單、節(jié)約時(shí)間、重復(fù)性佳等優(yōu)點(diǎn),但直接使用BCA法計(jì)算多肽濃度值時(shí)得到的結(jié)果不準(zhǔn)確。比較BCA法與個(gè)性化標(biāo)準(zhǔn)曲線的BCA法的濃度值計(jì)算結(jié)果,使用分子量相近的標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線以求未知濃度的多肽濃度時(shí),濃度計(jì)算值與理論值之間仍然有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,但比BCA法的濃度計(jì)算值更接近理論值。也就是說,個(gè)性化標(biāo)準(zhǔn)曲線的BCA法在一定程度上減小了BCA法的誤差。