鹽酸表柔比星有關物質(zhì)系統(tǒng)適用性溶液制備方法探討

宋麗,張家寧,車慧,何麗娟（北京協(xié)和藥廠有限公司,北京 102600）

鹽酸表柔比星屬于廣譜抗腫瘤抗生素，由意大利Farmitalia Carlo Erba公司開發(fā)，1984年12月首次在意大利上市，1998年在中國上市，在美國、日本、英國等多國均獲批上市。鹽酸表柔比星及其制劑注射用鹽酸表柔比星收載于《中國藥典》2020年版。中國藥典標準有關物質(zhì)項下需制備多柔比星酮、鹽酸多柔比星與鹽酸表柔比星的混合溶液作為系統(tǒng)適用性溶液。在實際工作中，我們發(fā)現(xiàn)該系統(tǒng)適用性溶液中多柔比星酮在溶液中不能完全溶解，有微量沉淀，采用超聲或渦旋輔助方法均不能改善多柔比星酮的溶解。本研究針對多柔比星酮溶解特性，建立了多柔比星酮溶液的制備方法，并進行比較和優(yōu)化，提出藥典有關物質(zhì)檢測方法可能的完善方案。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Thermo U3000高效液相色譜儀，Agilent 1260高效液相色譜儀，Chromeleon 7網(wǎng)絡版色譜工作站，ZORBAX TMS-C1柱（4.6×250mm，5μm）；Thermo Genpure Pro超純水機。

1.2 試藥 多柔比星酮對照品[1]（批號130676-201801，中國食品藥品檢定研究院）、多柔比星酮對照品（批號1844-074A5，TLC Pharmaceutical Standards）、鹽酸表柔比星對照品（批號130560-202104，中國食品藥品檢定研究院）、鹽酸多柔比星（批號130509-202104，中國食品藥品檢定研究院）、乙腈（色譜純，F(xiàn)isher）、甲醇（色譜純，F(xiàn)isher）、十二硫基硫酸鈉（色譜純，Sigma-Aldrich）、磷酸（色譜純，阿拉?。?、二甲基亞砜（DMSO，色譜級，阿拉?。?。

2 方法與結(jié)果

2.1 《中國藥典》2020年版制備方法 ①流動相：水-乙腈-甲醇-磷酸（540∶290∶170∶1）并含0.2%十二烷基硫酸鈉的混合溶液為流動相。②系統(tǒng)適用性溶液（藥典方法）：取多柔比星酮3mg、鹽酸多柔比星3mg和鹽酸表柔比星10mg，置100ml量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成每1ml中分別約含多柔比星酮30μg、鹽酸多柔比星30μg與鹽酸表柔比星100μg的混合溶液。

2.2 本研究方法[2]①流動相：水-乙腈-甲醇-磷酸（540∶290∶170∶1）并含0.2%十二烷基硫酸鈉的混合溶液為流動相。②系統(tǒng)適用性溶液（本研究方法）：取多柔比星酮3mg，置10ml量瓶中，加DMSO溶解并稀釋至刻度，搖勻。取鹽酸多柔比星3mg和鹽酸表柔比星10mg，置10ml量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻。分別精密量取上述兩種溶液各5ml，置50ml量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，即得。③DMSO溶液：精密量取DMSO 1ml，置10ml量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3 測定 精密量取流動相、DMSO溶液、系統(tǒng)適用性溶液（藥典方法）、系統(tǒng)適用性溶液（本研究方法）各20μl，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖至表柔比星峰保留時間的4倍。記錄兩份系統(tǒng)適用性溶液中多柔比星酮峰、多柔比星峰和表柔比星峰的保留時間、理論板數(shù)、與相鄰峰的分離度。見表1，圖1-4。

表1 測定數(shù)據(jù)表

上述各色譜圖中，多柔比星酮峰、多柔比星峰、表柔比星峰與相鄰峰之間的分離度均大于1.5，兩份溶液的色譜圖中各峰的保留時間基本一致，理論板數(shù)均大于2000。表明使用DMSO制備的系統(tǒng)適用性溶液（本研究方法）滿足中國藥典中鹽酸表柔比星有關物質(zhì)項的測定要求，對測定無干擾。

2.4 耐用性試驗 精密量取流動相、DMSO溶液、系統(tǒng)適用性溶液（藥典方法）、系統(tǒng)適用性溶液（本研究方法）各20μl，分別注入另一臺高效液相色譜儀，記錄色譜圖至表柔比星峰保留時間的4倍。記錄兩份系統(tǒng)適用性溶液中多柔比星酮峰、多柔比星峰和表柔比星峰的保留時間、理論板數(shù)、與相鄰峰的分離度。見表2。

表2 耐用性試驗數(shù)據(jù)表

上述各色譜圖中，多柔比星酮峰、多柔比星峰、表柔比星峰與相鄰峰之間的分離度均大于1.5，兩份溶液的色譜圖中各峰的保留時間基本一致，理論板數(shù)均大于2000。表明使用DMSO制備的系統(tǒng)適用性溶液（本研究方法）滿足中國藥典中鹽酸表柔比星有關物質(zhì)項的測定要求，對測定無干擾。

2.5 重復性試驗 精密量取系統(tǒng)適用性溶液（藥典方法）、系統(tǒng)適用性溶液（本研究方法）各20μl，分別注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖至表柔比星峰保留時間的4倍。記錄各份溶液中多柔比星酮峰、多柔比星峰和表柔比星峰的保留時間、理論板數(shù)、與相鄰峰的分離度。重復性取系統(tǒng)適用性溶液（藥典方法）、系統(tǒng)適用性溶液（本研究方法）連續(xù)進樣5次。見表3。

表3 精密度試驗數(shù)據(jù)表

上述各色譜圖中，多柔比星酮峰、多柔比星峰、表柔比星峰與相鄰峰之間的分離度均大于1.5，兩份溶液的色譜圖中各峰的保留時間相近，理論板數(shù)均大于2000。系統(tǒng)適用性溶液（本研究方法）的5張色譜圖中多柔比星酮峰、多柔比星峰、表柔比星峰的保留時間平均值分別為3.111min、8.301min、9.814min，RSD分別為0、0.03%、0.02%。系統(tǒng)適用性溶液（藥典方法）的5張色譜圖中多柔比星酮峰、多柔比星峰、表柔比星峰的保留時間平均值分別為3.113min、8.310min、9.820min，RSD分別為0.09%、0.03%、0.03%。兩個方法各峰保留時間相對平均偏差為0.03%、0.05%、0.03%，表明使用DMSO制備的系統(tǒng)適用性溶液（本研究方法）滿足中國藥典中鹽酸表柔比星有關物質(zhì)項的測定要求，對測定無干擾，精密度良好。

3 討論

3.1 本研究建立方法對不同來源多柔比星酮溶解情況的考察 目前國內(nèi)的多柔比星酮對照品主要有兩個來源，中國食品藥品檢定研究院（以下簡稱中檢院）和TLC Pharmaceutical Standards（以下簡稱TLC）。其中，中檢院來源的多柔比星酮為深棕色固體，未標示純度，僅供鹽酸表柔比星系統(tǒng)適用性試驗用。TLC來源的為紅褐色固體，純度在90%以上，可用于定量測定。采用本研究方法對兩個來源的多柔比星酮進行溶液制備，結(jié)果在日光燈下目視觀察，兩份溶液均為橙黃色澄清液體；在光照度lx1000下目視觀察，溶液均澄清。表明本研究建立方法適用于不同來源的多柔比星酮。

圖1 流動相色譜圖

圖2 DMSO溶液色譜圖

圖4 系統(tǒng)適用性溶液（本研究方法）色譜圖

為了對比多柔比星酮溶解情況，我們使用《中國藥典》[3]2020年版的方法對兩個來源的多柔比星酮進行考察。流動相加入后，多柔比星酮沒有溶解。使用超聲處理35min后，在日光燈下目視觀察，TLC來源的樣品未觀察到明顯沉淀，中檢院來源的樣品仍能觀察到少量的沉淀，靜置后，TLC來源的樣品溶液底部可觀察到有少量的沉淀，中檢院來源的樣品溶液觀察到沉淀增加；繼續(xù)使用渦旋處理3min，在日光燈下目視觀察，兩個來源的樣品溶液均有懸浮顆粒，中檢院來源的懸浮顆粒相對明顯。在實驗中我們對兩個來源的樣品溶液過濾前后分別進樣分析，同一來源的樣品溶液過濾前后峰面積沒有明顯變化，TLC來源的多柔比星酮峰面積較中檢院來源的峰面積大。兩個來源的多柔比星酮溶解性能的不同應與其純度相關。

3.2 各國藥典中多柔比星酮定位方法的比較 《歐洲藥典》、《美國藥典》、《日本藥局方》和《中國藥典》2020年版均收載了鹽酸表柔比星的質(zhì)量標準?！吨袊幍洹?020年版還收載注射用鹽酸表柔比星的質(zhì)量標準[4-5]。在有關物質(zhì)項下，4部藥典在檢驗方法和雜質(zhì)控制標準上有所不同?！度毡舅幘址健凡捎脙?nèi)標法控制雜質(zhì)總量，沒有對多柔比星酮的控制要求?！睹绹幍洹泛汀稓W洲藥典》均對總雜質(zhì)、其他單個雜質(zhì)和多柔比星酮、多柔比星等7個雜質(zhì)進行控制，其中多柔比星酮是通過對鹽酸多柔比星進行酸破壞的方法獲得雜質(zhì)峰鑒別溶液，然后通過相對保留時間定位多柔比星酮?！吨袊幍洹?020年版通過制備多柔比星酮、鹽酸多柔比星與鹽酸表柔比星的混合溶液作為系統(tǒng)適用性溶液進行峰定位，采用自身對照法對多柔比星酮、多柔比星、其他單個雜質(zhì)和總雜質(zhì)進行控制。

我們按照《美國藥典》和《歐洲藥典》的多柔比星酮定位溶液制備方法開展了相關試驗。結(jié)果表明，制備方法操作難度不大，加入酸破壞后需要放置30min，再加入一定濃度的堿進行中和。使用HPLC進樣分析，除多柔比星酮外，還檢出未被破壞的多柔比星及其他被破壞的雜質(zhì)，影響多柔比星酮的辨識；且相比于本研究建立的方法，操作步驟較多，不便于日常檢驗。

3.3 溶劑的選擇 鹽酸表柔比星有關物質(zhì)項下流動相為水、乙腈和甲醇的混合溶液，但在前述的溶解性能考察中發(fā)現(xiàn)多柔比星酮無法完全溶解。單獨使用水、乙腈和甲醇分別溶解多柔比星酮，均無法有效改善其溶解情況。因此需要使用其他溶解性能更好的溶劑。

查閱中國知網(wǎng)等數(shù)據(jù)庫，未查詢到相關文獻中對多柔比星酮溶解性的描述。TLC來源的多柔比星酮對照品的說明書中提到，使用DMSO作為溶劑進行溶液制備，色譜峰理論板數(shù)、拖尾因子均良好。因此選擇DMSO作為溶劑開展研究工作。經(jīng)測試確定，采用本研究建立的DMSO溶解方法不影響有關物質(zhì)檢測。

3.4 制備方法的選擇 在制備過程中，我們在考察本研究方法配備溶液外，同步考察使用DMSO制備溶液的其他方法。制備方法為：取多柔比星酮3mg，置100ml量瓶中，加DMSO 10ml溶解，再用流動相稀釋至刻度。研究發(fā)現(xiàn)該方法制備的溶液在光照度lx1000下目視觀察到極微量的懸浮微粒，澄清度較本研究建立的方法稍差，最終沒有采納該方法。

3.5 小結(jié) 本試驗通過對《中國藥典》2020年版中鹽酸表柔比星的有關物質(zhì)項下系統(tǒng)適用性溶液中多柔比星酮的溶解情況的研究，確定了合理的系統(tǒng)適用性溶液的制備方法，為鹽酸表柔比星有關物質(zhì)測定方法提供了優(yōu)化方案。

建議《中國藥典》2020年版中鹽酸表柔比星有關物質(zhì)項下系統(tǒng)適用性溶液修訂為：取多柔比星酮3mg，置10ml量瓶中，加DMSO溶解并稀釋至刻度，搖勻。取鹽酸多柔比星3mg和鹽酸表柔比星10mg，置10ml量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻。分別精密量取上述兩種溶液各5ml，置50ml量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，即得。